Drosophila (olika betydelser) Uppvaktningskonditionering: En metod för att testa lärande och minne i flugor

Overview

Denna video beskriver en klassisk konditioneringsanalys som testar lärande och minne i Drosophila, kallad uppvaktningskonditionering. Analysen är baserad på minskningen av manlig uppvaktning efter att ha upplevt ett avslag av en icke-mottaglig förinnad kvinna. Exempelprotokollet visar en inställning för proceduren som kan användas för att bedöma korttids- och långtidsminne.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

OBS: I protokollet som beskrivs nedan beskrivs en replikat av insamling, utbildning och testning. För att testa resultatens reproducerbarhet bör dessa steg upprepas parallellt, på flera dagar och med separata grupper av flugor (tabell 1). Protokollet är baserat på en 10 dagars livscykel från ägg till vuxen, vilket är normalt vid uppfödning av flugor under konstanta förhållanden på 25 °C, 70% luftfuktighet och en 12 h ljus / mörk cykel. Alla aspekter av detta protokoll förutsätter att förhållandena hålls konstanta under hela analysen. Tider anges som timmar innan lamporna tänds (BLO) eller efter att lamporna tänds (ALO) i inkubatorn, eftersom detta bekvämt kan ställas in beroende på forskarens föredragna tid på dagen. Använd CO_2-gas endast för den första insamlingen av naiva hanflugor och för insamling av förmatade honor. Detta protokoll för uppvaktningskonditionering består av följande steg:

1. Etablering av förmatade kvinnliga samlingskulturer
2. Upprättande av kulturer för insamling av manliga försökspersoner
3. Förberedelse av bostadshus
4. Inrättande av parningsflaska för produktion av standardiserade förmatade honor
5. Insamling av manliga försökspersoner
6. Utbildning
7. Testning
8. Videodataanalys och statistik

1. Inrättande av förmatade kvinnliga samlingskulturer

1. Förbered powerfood. Koka 0,8% (w/v) agar, 8% (w/v) jäst, 2% (w/v) jästextrakt, 2% (w/v) pepton, 3% (w/v) sackaros, 6% (w/v) glukos, 0,05% (w/v) MgSO₄och 0,05% (w/v) CaCl₂ i vatten i 15 min. Låt lösningen svalna till 70 °C innan du tillsätter 0,05 % (w/v) metylparaben(VARNING: giftig)och 0,5 % (v/v) propionsyra (VARNING: giftig). Blanda väl genom omrörning medan du kyler vidare till 50 °C för att få en homogen lösning.
2. Innan maten stelnat i rumstemperatur, tillsätt ~ 50 ml powerfood till varje 175 ml plastflaska. Låt maten svalna ytterligare. Stäng injektionsflaskan med en plugg.
   OBS: Powerfood är en specialiserad livsmedelsblandning formulerad speciellt för produktion av ett stort antal flugor, förmodligen genom att inducera äggläggning. Powerfood används inte för att producera manliga flugor som kommer att användas för beteendeanalys (steg 2) eftersom den atypiska kosten och potentiell trängsel kan påverka utvecklingen.
3. På dag -11 (Tabell 1), starta 5-20 wildtype kulturer med cirka 60-100 flugor (en blandning av män och kvinnor) i powerfood flaskor; Dessa kommer att användas i steg 4 för att producera standardiserade förmatade honor. Tillsätt ett filterpapper till varje flaska för att öka det område där larverna kan poppar; detta kommer att öka antalet flugor som kan eclose.
4. Upprepa regelbundet steg 1.1-1.3 under hela försöket för att erhålla tillräckligt många nya eclosingflugor som insats för "etablering av parningsflaska för produktion av standardiserade förmatade honor" (steg 4).

2. Inrättande av kulturer för insamling av manliga försökspersoner

1. Förbered normal mat, gjord med 0,5% (w/v) agar, 2,75% (w/v) jäst, 5,2% (w/v) majsmjöl, 11% (w/v) socker, 0,05% (w/v) metylparaben och 0,5% (v/v) propionsyra i vatten, enligt beskrivningen i steg 1,1 och 1,2. Stäng de 175 ml plastflaskorna med en flugflaska.
2. På dag -10 (Tabell 1), placera ca 10-20 män med cirka 30-75 jungfruliga honor(Material / UtrustningStabell) i varje 175 ml injektionsflaska som innehåller normal mat. Lägg till ett filterpapper för att öka ytan för poppning och för att maximera produktiviteten.
3. Upprätta tre till sex 175 ml injektionsflaska per genotyp för att erhålla det erforderliga antalet försökspersoner.
   OBS: Fler injektionsflaska kan behövas, beroende på produktiviteten hos önskad genotyp.

3. Förberedelse av bostadshus(figur 2A)

1. Smält cirka 50 ml powerfood per husblock i mikrovågsugn, eller förbered det fräscht.
2. Tillsätt 500 μL powerfood till varje brunn i ett 96-brunns, platt bottenblock med en multidispenserpipett.
3. Låt maten stelna i rumstemperatur.
4. Täck blocken med PCR-självhäftande film och använd en nål för att göra minst 4 hål per brunn för att ge frisk luft till flugorna.
5. För att kunna öppna varje brunn, använd ett rakblad för att skära den självhäftande filmen på längden mellan varje rad. Lämna filmen intakt i ena änden av kvarteret.
6. Blocken kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 dagar.
   OBS: Låt blocken balansera om till rumstemperatur före användning.

4. Inrättande av parnings injektionsflaska för produktion av standardiserade förmatade honor

1. På dag -1, ta bort och kassera alla vuxna wildtype flugor från förmatade kvinnliga samling kulturer på 2-5 h BLO.
2. Samla flugor med aspiratorn (Figur 2B) från dessa injektionsflaskar i 2- till 3-timmarsintervaller(t.ex. vid 30 min, 2,5 h och 5 h ALO) och placera dem i en ny powerfoodflaska kompletterad med en liten mängd jästpasta och filterpapper.
3. För att undvika trängsel och för att främja en optimal parningsatmosfär, överför inte mer än 150-200 flugor till varje ny flaska. Se till att alla honor paras genom att ge minst 25% män. Se till att det finns tillräckligt många honor i parningsflaskan för att tillgodose experimentets storlek.
   OBS: Eftersom detta är ett avgörande steg i protokollet, se till att endast nyeslutna flugor och inga gamla flugor, larver eller puppar överförs till den nya parningsflaskan.
4. Inkubera dessa "parningsflaska" i fyra dagar för att ge tillräckligt med tid för alla honor att ha parat sig.

5. Insamling av manliga försökspersoner

1. På dag 1 (Tabell 1) vid 2-3 h BLO, använd CO₂ för att ta bort alla vuxna flugor från de manliga insamlingsflaskan (steg 2), men låt fler flugor eclose under de närmaste timmarna.
2. Under de kommande 5-6 h, ta bort nyligen eclosed flugor var 20-30 min med CO₂ och sätt varje hane i en individuell brunn i bostadsblocket (steg 3) med hjälp av aspiratorn (Figur 2B).
3. Försegla brunnen igen med den självhäftande PCR-filmen.
   OBS: Detta är ett avgörande steg i protokollet. Hanarna ska samlas in ofta. Insamlade män bör isoleras i bostadshuset nära eklosionstiden, när de visar blek pigmentering och närvaron av mekoniumet i den genomskinliga buken.
   OBS: Mild användning av aspiratorn möjliggör överföring av flugor; Olämplig användning kommer dock att stressa flugorna, vilket orsakar varians i analysen (se diskussionen).
4. Sikta på att samla upp till 48 män per genotyp. Detta ger ett litet överskott till det maximala antalet män som behövs för analys av både naiva och tränade förhållanden, vilket möjliggör viss förlust under senare överföringssteg.

6. Utbildning

1. Ta bort flugorna från parningsflaskan (steg 4.2) med CO₂ och separera de förmatade honorna från männen.
2. Använd aspiratorn, tillsätt en enda bedövad, förmatad kvinna till varje brunn i en rad i ett nytt bostadshus.
3. Använd aspiratorn och utan anestesi, överför en individuell naiv hane från bostadshuset som är inrättat i steg 5.2 till brunnen som innehåller en förmatad kvinna. När hanen har placerats i brunnen, försegla omedelbart med den självhäftande filmen; låt inte hanen fly.
   OBS: Överför manliga flugor från aspiratorn till bostadshuset genom att dra nytta av deras naturliga "negativa geotaxis" beteende.
4. Upprepa steg 6.2-6.3 tills tillräckligt med manliga-kvinnliga par är etablerade. Helst etablera 24 par, två fulla rader av ett bostadshus, per genotyp. Lämna de återstående naiva männen i det ursprungliga bostadshuset i steg 5.2.
5. Lämna de manliga och kvinnliga paren ostört under träningsperioden(tabell 2, figur 1B).
   OBS: Under denna tid kommer mannen att uppvakta och avvisas av den förmatade kvinnan. För lärande och STM är träningsperioden 1 timme och för LTM är träningsperioden 7-9 h.
6. Avsluta träningen(tabell 2, figur 1B )medhjälp av en aspirator för att försiktigt skilja hanen från den förmatade honan. använd inte anestesi. Placera den separerade hanen i ett nytt bostadshus.
7. Använd aspiratorn för att försiktigt och utan anestesi överföra alla naiva hanar från det bostadshus som satts upp i steg 5.2 till ett nytt bostadshus.
   OBS: Detta steg är valfritt för STM och lärande, men det är mycket viktigt för LTM eftersom flugorna är inrymda i ytterligare 24 h för att testa LTM.
8. För STM och LTM, låt hanarna vila i 1 timme respektive ~24 h(tabell 2, figur 1B) före provning (steg 7).
9. För lärande, testa omedelbart de utbildade och naiva männen (steg 7).

7. Testning

1. Samla flugor från parningsflaska (steg 4.2) med CO₂ och separera de förmatade honorna från männen.
2. Låt honorna återhämta sig från anestesin i minst 1 timme i en flaska som innehåller normal mat.
3. Montera videoinspelare i förväg (figur 2C), för att ha all utrustning klar innan provningen startar.
4. Starta testningen enligt de olika tidsramarna för lärande, STM och LTM(tabell 2, figur 1B). Utför testning omedelbart efter utbildning för lärande, 1 timme efter träning för STM och 24 timmar efter träning för LTM.
5. Använd aspiratorn, överför försiktigt en enskild man från vilohuset eller från träningshuset om lärandet testas (steg 6.7, utbildad; steg 6.8, naivt) till ena halvan av en uppvaktningsarena med avdelaren stängd (Figur 2D; se Fil S1 för en byggplan).
   OBS: Användningen av det naturliga "negativa geotaxis" beteendet bör vara tillräckligt för att överföra de manliga flugorna från aspiratorn till uppvaktningsarenan.
6. Flytta snabbt men försiktigt ingångshålet till nästa arena och upprepa steg 7,5 tills alla 18 arenor innehåller en man.
7. Använd aspiratorn och utan CO₂, tillsätt en förmatad kvinna (insamlad i steg 7.2) till den andra hälften av alla 18 arenor.
8. Placera försiktigt uppvaktningskammaren under kameran, med öppningen av brunnarna vända nedåt(bild 2C).
9. Ta bort avdelaren av arenorna för att möjliggöra direkt interaktion mellan männen och förmatade kvinnor.
10. Börja omedelbart spela in beteendet i minst 10 minuter.
    OBS: När du använder en tvåkamerainställning kan parallellinspelning av två uppvaktningsplattor göras i överlappande tidsramar för att maximera effektiviteten.
11. Töm uppvaktningsarenorna med hjälp av en handhållen dammsugare och låt uppvaktningskammaren ventilera innan den åter används.
12. Upprepa steg 7.4-7.11 tillstestningen av alla genotyper och villkor (dvs. naiva och tränade) har slutförts.

8. Analys och statistik av videodata

1. Beräkna uppvaktningsindexet (CI), definierat som den procentandel av tiden som de manliga domstolarna under de första 10 minuterna av testperioden, för varje enskild manlig fluga.
   OBS: Detta kan göras manuellt genom att observera stereotypt uppvaktningsbeteende (figur 1A) eller genom att använda datorprogramvara för automatiserad kvantifiering av uppvaktningsbeteende.
   OBS: Det rekommenderas att analysera 40-60 män per tillstånd under tre dagar för att uppnå tillräcklig statistisk kraft och bedöma överensstämmelsen i CI-data.
2. Beräkna inlärningsindex (LI), definierat som procentminskningen av medelvärdet CI för utbildade män jämfört med naiva män (LI = (CI_naiv –_CI-utbildad) / CI_naiv). Utvärdera LI för varje testdag och jämför den med den kumulativa LI som beräknats från alla testdagar tillsammans.
3. Gör en separat datafil med två kolumner med "Genotyp" och "CI" som rubriker.
   OBS: Dessa rubriker är fallkänsliga. Namnet på genotypen för varje KI måste bestå av en beskrivning av genotypen följt av ett understreck och träningstillståndet (t.ex. genotype_N och genotype_LTM, etc., där N = naiv och LTM = långtidsminne; se kompletterande fil S2 till exempel). Denna anteckning är nödvändig, eftersom funktionen analearn kommer att identifiera tränade och naiva flugor baserat på de tecken som finns efter det första understrecket i kolumnen "Genotyp".
4. Använd analearn R-skriptet (Kompletterande fil S3) för att utföra ett randomiseringstest för att bedöma den statistiska signifikansen av skillnader mellan LI-värdena från olika genotyper.
   1. Källa skriptet (Kompletterande fil S3) till R, som definierar en funktion som kallas "analearn".
      OBS: Funktionsdefinitionen är: analearn <- function(nboot = 10 000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Starta funktionen genom att ange "analearn()" på kommandoraden R och välja den datafil som ska analyseras (produceras i steg 8.3) via popup-fönstret.
   3. Välj referensmutationen, som är kontrollgenotypen, genom att ange motsvarande nummer och trycka på enter.
      OBS: När du har valt referensgenotypen tar det flera sekunder för skriptet att utföra 10 000 bootstrap-replikat.
   4. Observera utdatatabellen (tabell 3), som innehåller genotyp, inlärningstillstånd (dvs.inlärning, STM eller LTM), genomsnittlig CI naiv, genomsnittlig CI-utbildad, LI, skillnaden mellan LI för kontrollen jämfört med försöksförhållandet (LI dif), den nedre gränsen (LL) och övre gränsen (UL) för LI dif: s konfidensintervall på 95% och p-värdetsom indikerar sannolikheten för att det inte finns någon signifikant skillnad.
      Analearn lagrar en utdatatextfil i katalogen där datafilen finns. Utdatatabellen visas dock också i R-Studio-konsolen. Standardnamnet konstrueras baserat på namnet på den angivna datafilen.
   5. Det finns flera argument i analearn-funktionen som kan användas för att ändra standardinställningarna för funktionen för att justera parametrarna för bootstrapping.
      OBS: "nboot" definierar antalet bootstrap-replikat och är som standard inställt på 10 000. Det här värdet kan ändras till ett heltal som är större än noll. Tabell 5 innehåller flera argument som kan användas för att ändra standardinställningarna för funktionen. Det rekommenderas dock inte att använda data som produceras med ett lågt antal bootstrap-replikat.

Representative Results

Figur 1: Fastställande av uppvaktningsindex och experimentell översikt. (A) Bilder som visar stereotypt manligt uppvaktningsbeteende mot en kvinnlig fluga. Olika stadier av uppvaktningsbeteende visas: orientering (I), följande (II), vingvibration (förlängning) och gängning (III), slickning (IV) och försök till kopulering (V). B)Schematisk översikt över tränings- och testtider i förhållande till inkubatorns ljuscykel, markerad i timmar. Träningstider anges med staplar, viloperioder för STM och LTM indikeras med en streckad linje och teststartpunkten anges som en pil. Observera att testtiden för LTM är dagen efter träningen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Utrustning som används för Drosophila Courtship Conditioning Assay. ( A) Bostadshuset är ett platt bottenblock med 500 μL powerfood per brunn. Den är förseglad med en qPCR-limfilm med minst 4 hål per brunn som skapades med en sprutnål med en diameter på 0,8 mm. Enskilda rader skärs på längden i remsor med hjälp av ett rakblad för att möjliggöra öppning och stängning. B)Aspiratorn krävs för en försiktig överföring av han- och honflugor utan användning av anestesi. Insetet visar spetsen på aspiratorn, stängd med en bit bomull för att hålla flugorna inom spetsen. C)Installation av ett system med två kameror för samtidig inspelning av två uppvaktningskammare. D)En uppvaktningskammare med 18 arenor. Skjutbara ingångshål används för att placera flugorna i arenorna. De vita avdelarna kan samtidigt öppnas för att initiera interaktion mellan män och kvinnor. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Tabell 1: Exempeltidslinje för testning av LTM över tre replikat på enskilda dagar.

	Allmänt	Samla	Tåg	Test
dag -11	Starta förmatade kvinnliga samlingskulturer (steg 1.3)
dag -10	Starta kulturer för insamling av manliga försökspersoner (steg 2.2)
Dag 1		rep. 1
Dag 2		rep. 2
Dag 3		rep. 3
Dag 4		rep. 4	rep. 1
Dag 5			rep. 2	rep. 1
Dag 6			rep. 3	rep. 2
dag 7			rep. 4	rep. 3
Dag 8				rep. 4
Dag 9	Videodataanalys och statistik (steg 8)
rep = upprepa

Tabell 2: Träningstid, träningstider och testtider för lärande, STM och LTM

	Lärande	Stm	Ltm
Träningstid	1 h.	1 h.	8 h.
Vilotid	0 h.	1 h.	- 24 timmar.
börja träna	0 h. ALO	0 h. ALO	4 h. BLO
sluta träna	1 h. ALO	1 h. ALO	4 h. ALO
starta test	1 h. ALO	2 h. ALO	0 h. ALO (nästa dag)
ALO = efter att lamporna tänds, BLO = innan lamporna tänds, STM = korttidsminne, LTM = långtidsminne

Tabell 3: Statistiska uppgifter som tagits fram ur Analearn-skriptet.
Statistiska data som producerats från analearn-skriptet. Utdatafilen för bootstrapping R-skriptet som innehåller genotypen,inlärningstillståndet( dvs. inlärning, STM eller LTM), genomsnittlig CI naiv, genomsnittlig CI-utbildad, LI, skillnad mellan LI av kontrollen jämfört med experimentellt tillstånd (LI dif), den nedre gränsen (LL) och övre gränsen (UL) för LI dif: s konfidensintervall på 95% och p-värdetsom indikerar sannolikheten för att det inte finns någon signifikant skillnad.

Genotyp	Lärande	Ci	Ci	Li	Li	Nedre gräns	Övre gräns	p-värde
	Villkor	Naiv	Utbildade		Skillnaden	(95 % konfidensintervall)	(95 % konfidensintervall)
Kontroll	Stm	0.467	0.116	0.752	Na	Na	Na	Na
Dhap-at-RNAi (på RNAi)	Stm	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.03	0.265	0.116
Kontroll	Ltm	0.59	0.384	0.348	Na	Na	Na	Na
Dhap-at-RNAi (på RNAi)	Ltm	0.697	0.65	0.068	0.28	0.103	0.446	0.003

Kompletterande arkiv S1: Byggplan för en uppvaktningskammare. Filen kan öppnas med alla program som tillåter .stp-tillägg (CAD-filer). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil S2: Exempel på en indatafil för Analearn-skriptet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil S3: Analearn.r-skriptet. Filen kan öppnas med R-studio. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-