Dissecção de túbulo malpighiano de uma mosca adulta: isolando um órgão osmoregulatório e excretório

Overview

Este artigo descreve a dissecação dos túbulos malpighianos anteriores (MT) de uma mosca drosophila feminina e um protocolo de exemplo de Rossano et al. (2017) em que os MTs são preparados para imagens ao vivo em uma câmara de perfusão.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Rossano e Romero, Quantificação Óptica do PH Intracelular em Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia com um Indicador de PH Geneticamente Codificado fluorescente, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparação de Slides de Poli-L-Lysine

1. Desenhe uma borda de 40 x 20 mm com uma caneta PAP hidrofóbica em torno da parte superior dos slides padrão de 75 x 25 mm e reserve para secar por 15 minutos no RT. Use grandes tampas se os slides não forem compatíveis com a óptica de imagem.
2. Transfira 2 mL de estoque 0,01% solução Poly-L-Lysine (PLL) para cada slide e reserve por 1h na RT.
3. Remova o excesso de PLL com uma pipeta. Salve a solução em um frasco cônico de 50 mL para uso futuro. Armazenar a 4 °C.
4. Aspire qualquer solução restante com uma linha de vácuo. Execute a linha de vácuo sobre toda a superfície de deslizamento para garantir que nenhuma solução permaneça nos slides.
5. Reserve os slides por 1 h adicional no RT antes de usar. Armazene os slides secos no RT por até 1 mês em um slide book padrão.

2. Preparação de Prato de Dissecação e Hastes de Vidro

1. Adicione 0,5 mL de agente de cura de elastômero a 4,5 mL de base elastômera em uma placa petri de poliestireno de 35 x 10 mm na RT para produzir uma profundidade de 5 mm. Misture com uma ponta de pipeta descartável. Permita que elastomer cure O/N na RT.
   NOTA: Elastomer deve ser claro e livre de bolhas. A limpeza das bolhas pode ser facilitada mantendo placas de elastômero em um frasco de vácuo por 10 a 15 minutos após o derramamento.
2. Segure uma haste de vidro de 5 mm de diâmetro entre as mãos e derreta o centro da haste sobre um queimador Bunsen aceso enquanto puxa as extremidades separadas. À medida que o vidro derrete, puxe mais rapidamente para produzir um eixo fino (0,1 mm) e afilado(Figura 1).
   NOTA: Um ângulo de 45 ° na haste é muitas vezes útil no manuseio de túbulos. Isso pode ser conseguido baixando uma mão à medida que a haste é puxada (ver Figura 1).
3. Quebre o eixo fino no meio com o lado contundente de uma lâmina de barbear de aço de um único gume. Inspecione a extremidade fina da haste sob um escopo de dissecação para garantir que a ruptura esteja limpa.

3. Dissecção de Túbulos Malpighianos Anteriores de Drosophila Adulto

1. Reúna o prato de dissecção e a haste de vidro puxada da seção 2, um slide revestido de PLL da seção 1, um divisor adesivo de perfusão-poço, graxa de vácuo, uma tira de 4 x 2" de filme de vedação, 2 pares de fórceps finos #5 e 40 mL alíquotas do meio de Schneider gelado e RT iPBS.
2. Espalhe graxa de vácuo na fita de vedação e pressione o divisor de perfusão adesivo sobre a fita para revestir a parte inferior com graxa. Retire o divisor de perfusão adesivo e coloque-o de lado para baixo em cima de um slide revestido de PLL. Remova o divisor de perfusão para deixar poços de espécimes individuais rastreados em graxa hidrofóbica.
3. Coloque 200 μL de RT iPBS no poço de graxa no slide revestido de PLL e mova o slide sob o estereoscópio.
4. Coloque UAS-pHerry/capaR-GAL4 voa em um frasco de mosca vazio e anestesia-os no gelo por 10 minutos.
   NOTA: Este método de anestesia, ao contrário do CO_2,garante que as moscas não se desidratam.
5. Despeje o meio de Schneider gelado no prato de dissecação e use fórceps finos para transferir uma única mosca fêmea anestesiada para o prato sob um estereóscópio dissecando.
6. Segure a mosca pelo tórax com um conjunto de fórceps e use o outro para segurar suavemente o posterior do abdômen. Puxe o posterior da mosca usando os fórceps em movimentos curtos e deliberados. Uma vez que o hindgut é visível, segure a extremidade distal e liberte o intestino e os MTs das traqueoles subjacentes puxando o hindgut para longe do corpo através de puxões repetitivos e breves.
   NOTA: Os MTs anteriores e posteriores serão visíveis onde eles encontram a junção do midgut e hindgut através do ureter. O primeiro par de MTs a ser livre provavelmente serão os túbulos posteriores enquanto circundam o traseiro. Estes podem ser ignorados(Figura 2A).
7. Belisque os MTs anteriores no ureter com fórceps finos uma vez que o segundo conjunto de MTs está livre do abdômen. Isso separará os MTs anteriores do intestino e fechará o ureter.
8. Pegue os MTs anteriores livres com a haste de vidro puxada deslizando a haste sob o ureter de tal forma que os túbulos caiam para ambos os lados. Levante os MTs para fora da solução.
9. Gire a haste de vidro de tal forma que os MTs e o ureter sejam aderidos à parte inferior da haste e abaixe o ureter direto para o escorregador. Fixar o ureter e selar as extremidades distais dos MTs pressionando o ureter para baixo na lâmina de vidro(Figura 2B). Não manipule os MTs mais do que o necessário. Os MTs devem estar flutuando na solução com o ureter ancorado no slide.
10. Use a extremidade fina da haste de vidro para varrer suavemente cada túbulo através da superfície do slide. Prepare a haste contra a lâmina para evitar esmagar o túbulo e deslize a haste sobre a parte superior do túbulo, movendo-se distal para proximal, para fixar o comprimento total de cada túbulo à superfície do slide revestido de PLL(Figura 2C).
11. Coloque o divisor de perfusão adesivo de volta no slide para formar um pequeno fluido bem cheio sobre o túbulo montado.
12. Coloque o espécime no estágio do microscópio. Posicione os capilares de entrada e saída sobre a entrada e a abertura do poço de perfusão, respectivamente.
    NOTA: O divisor de poços pode ser deixado de fora se uma câmara de perfusão aberta for desejada. Neste caso, os capilares de entrada e saída podem ser alinhados a lados opostos de um poço de imagem.

Representative Results

Figura 1: Fabricação de hastes de vidro para manuseio de túbulos malpighianos.
A - E. Processo de aquecimento e puxar uma haste de vidro para produzir um taper e ângulo adequado para manusear MTs. Setas denotam direção e magnitude de força a serem aplicadas. F. Fotografia de uma ferramenta de vidro apropriadamente fabricada. Barra de escala = 10 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Dissecção de Túbulos Malpighianos Anteriores de Drosophila Adulto.
A. Representação esquemática da remoção anterior de MT com 2 pares de fórceps finos no meio de Schneider refrigerado. "A. Tubule" = Anterior MT. "P. Tubule" = MT. Bposterior . Processo de recuperação e montagem de MTs extraídos usando barras de vidro finas. C. Processo de adesão de toda a extensão dos MTs extraídos a um slide para imagem e avaliação fisiológica. D. Imagens de campo largo representativas dos componentes SEpH (470/510 nm ex/em) e mCherry (556/630 nm ex/em) de componentes UAS-pHerry conduzidos por capaR-GAL4 representando MTs anteriores saudáveis, MTs anteriores danificados por perfusão insuficiente, e MTs posteriores mal identificados. Observe que os MTs anteriores saudáveis exibem um segmento inicial cego dilatado claro, um segmento transitório constrito com expressão relativamente aumentada de UAS-pHerry quando impulsionado por capaR-GAL4, e um segmento principal distal. MTs danificados exibem agregados perceptíveis de fluorescência mCherry sem fluorescência SEpH correspondente. Os MTs posteriores são uniformes de diâmetro sem segmentos morfologicamente distintos. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.