Мальпигский трубчатый рассечение от взрослой мухи: Изоляция осморегуляции и выделительного органа

Overview

В этой статье описывается вскрытие передней malpighian труб (MT) от самки Drosophila летать и пример протокола от Россано и др. (2017), в котором MTs подготовлены для живой визуализации в перфузионной камере.

Protocol

Этот протокол представляет собой выдержку из Россано и Ромеро, оптическая количественная оценка внутриклеточного рН в Drosophila меланогастер Malpighian Tubule Эпителия с флуоресцентной генетически закодированной рН индикатор, J. Vis. Exp. (2017).

1. Подготовка слайдов Поли-Л-Лизина

1. Нарисуйте 40 х 20 мм границы с гидрофобной ручкой PAP вокруг верхней части стандартных 75 х 25 мм слайдов и отложите в сторону, чтобы высохнуть в течение 15 мин на RT. Используйте большие крышки, если слайды не совместимы с оптикой изображения.
2. Передача 2 мл акций 0,01% Poly-L-Lysine (PLL) решение на каждый слайд и отложите на 1 ч на RT.
3. Удалите излишки PLL с помощью пипетки. Сохраните раствор в коническом флаконе 50 мл для использования в будущем. Хранить при 4 градусов по Цельсию.
4. Аспирировать любое оставшееся решение с помощью вакуумной линии. Запустите вакуумную линию по всей поверхности слайда, чтобы убедиться, что решение не остается на слайдах.
5. Установите слайды в сторону для 1 дополнительного ч на RT перед использованием. Храните слайды сухими на RT на срок до 1 месяца в стандартной слайд-книге.

2. Подготовка рассекая тарелки и стеклянных стержней

1. Добавьте 0,5 мл еластомерного лечебного средства в 4,5 мл базы еластомер в 35 х 10 мм полистирол Петри блюдо на RT производить глубину 5 мм. Смешайте с одноразовым наконечником пипетки. Разрешить еластомер для лечения O / N на RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Еластомер должен быть ясным и свободным от пузырей. Очистка пузырьков может быть облегчена путем хранения еластомерных пластин в вакуумной банке в течение 10 - 15 минут после заливки.
2. Держите стеклянный стержень диаметром 5 мм между руками и растопйте центр стержня над освещенной горелкой Bunsen, потянув концы друг от друга. По мере того как стекло тает вытягивают более быстро для того чтобы произвести тонкий (0.1 mm) и конические вал(рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Угол 45 градусов по хвостовиком часто помогает в обработке труб. Этого можно достичь, опустив одну руку по мере вытягивания хвостовика (см. рисунок 1).
3. Разбей тонкий вал посередине тупой стороной одноконечного углеродного стального лезвия бритвы. Осмотрите тонкий конец стержня под областью вскрытия, чтобы убедиться, что перерыв чист.

3. Рассечение взрослых дрозофилы передней мальпигской трубы

1. Соберите блюдо для вскрытия и вытащил стеклянный стержень из раздела 2, PLL покрытием слайд из раздела 1, клей перфузии хорошо разделитель, вакуумная смазка, 4 х 2 "полоса герметизации пленки, 2 пары #5 тонкой типсов, и 40 мл aliquots ледяной Шнайдер среды и RT iPBS.
2. Распространение вакуумной смазки на уплотнительной ленте и нажмите клей перфузии хорошо разделитель на ленту, чтобы покрыть дно с жиром. Очистите клей перфузии хорошо разделитель и поместите его смазки стороной вниз на вершине слайда с покрытием PLL. Удалите перфузии хорошо разделитель оставить отдельные образцы скважин прослеживается в гидрофобной смазки.
3. Поместите 200 МКЛ RT iPBS в смазанную смазкой хорошо на слайде с покрытием PLL и переместите слайд под стереоскоп.
4. Поместите UAS-pHerry/capaR-GAL4 мух в пустой флакон мухи и анестезировать их на льду в течение 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод анестезии, в отличие от CO_2,гарантирует, что мухи не обезвоживаются.
5. Налейте ледяную среду Шнайдера в рассечение и используйте тонкие типсы, чтобы передать одну анестезироватую самку мухи в блюдо под рассеченным стереоскопом.
6. Держите муху за грудную клетку с набором типсов и использовать другие мягко сцепление задней части живота. Потяните открыть заднюю часть мухи с помощью типсов в коротких, преднамеренных движений. После того, как hindgut виден, сцепление дистального конца и освободить кишечник и MTs от основных трахеол, потянув hindgut от тела через повторяющиеся, краткие буксиры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Передние и задние MTs будут видны, где они встречаются соединения midgut и hindgut через мочеточник. Первая пара MTs быть свободным, вероятно, будет задней трубоушки, как они окружают hindgut. Они могут быть проигнорированы(рисунок 2A).
7. Pinch от передней MTs на мочеточник с тонкой щипцы, как только второй набор MTs свободна от живота. Это отделит передние MTs от кишечника и закрыть мочеточник.
8. Возьмите свободные передние MTs с вытащил стеклянный стержень, сдвинув стержень под мочеточником так, что трубочки падают в обе стороны. Поднимите MTs прямо из раствора.
9. Поверните стеклянный стержень так, чтобы MTs и мочеточник прилипли к нижней стороне стержня и опустите мочеточник прямо на горку. Прикрепите мочеточник и запечатьте дистальные концы MTs, нажав мочеточник вниз на стеклянную горку(рисунок 2B). Не манипулируйте MTs больше, чем это необходимо. MTs должны плавать вверх в растворе с мочеточником закрепленным к скольжению.
10. Используйте тонкий конец стеклянного стержня, чтобы аккуратно подметать каждую трубочку по всей поверхности слайда. Приготовьте стержень к слайду, чтобы избежать дробления трубочки и сдвиньте стержень поверх трубочки, двигаясь дистальным до проксимального, чтобы прикрепить всю длину каждой трубочки к поверхности слайда с покрытием PLL(рисунок 2C).
11. Поместите клей перфузии хорошо разделитель обратно на слайде, чтобы сформировать небольшой жидкости заполнены хорошо над установленной трубоубии.
12. Поместите образец на сцену микроскопа. Распоить капилляры притока и оттока над входом и выходом открытия перфузии хорошо, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании открытой перфузионная камера может быть оставлена на нет. В этом случае капилляры притока и оттока могут быть выровнены к противоположным сторонам хорошо изображений.

Representative Results

Рисунок 1: Изготовление стеклянных стержней для обработки мальпийских труб.
A - E. Процесс нагрева и потянув стеклянный стержень для производства конус и угол подходит для обработки MTs. Стрелки обозначают направление и величину силы, которые будут применяться. F.Фотография надлежащим образом изготовленный стеклянный инструмент. Масштабная планка 10 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

Рисунок 2: Вскрытие взрослых дрозофилы передней Malpighian Tubules.
A.Схематическое представление переднего удаления МТ с 2 парами тонких типсов в охлажденной среде Шнайдера. "A. Tubule" - Передняя МТ. "P. Tubule" - задняя МТ В. Процесс извлечения и монтажа извлеченных MTs с помощью тонких стеклянных стержней. C.Процесс соблюдения всей длины извлеченных MTs к слайду для визуализации и физиологической оценки. D.Представитель широкополе изображения SEpH (470/510 нм ex/em) и mCherry (556/630 нм ex/em) компонентов UAS-pHerry, управляемых capaR-GAL4, изображающих здоровые передние MTs, передние MTs повреждены недостаточной перфузии, и ошибочно задней MTs. Обратите внимание, что здоровые передние MTs отображать четкий расширенный слепой начальный сегмент, суженный переходный сегмент с относительно увеличенным выражением UAS-pHerry при приводе capaR-GAL4, и дистальный основной сегмент. Поврежденные MTs отображают заметные агрегаты флуоресценции mCherry без соответствующей флуоресценции SEpH. Задние MTs однородны в диаметре без морфологически различных сегментов. Масштабная планка 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.