Montaggio di cervelli drosofili adulti: un metodo per preparare diapositive per l'imaging confocale

Overview

Questo video descrive un metodo per montare cervelli intatti da mosche adulte sotto una diapositiva del ponte e mostra il protocollo eseguito su cervelli immunososteniati per microscopia fluorescente.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Kelly et al., Dissezione e colorazione immunofluorescente del corpo dei funghi e dei neuroni fotorecettori nei cervelli adulti drosofilia melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montaggio di cervelli D. melanogaster adulti su diapositive al microscopio e imaging

1. Costruisci una diapositiva "ponte". Posizionare due copripasci "base" distanti circa 1 cm su uno scivolo caricato positivamente. Assicurarsi che il lato caricato positivamente della diapositiva sia rivolto verso l'alto. Aderire ai coprisparsi alla diapositiva con smalto per unghie, come illustrato nella figura 1A. Di solito è utile sigillare i tre bordi esterni di ogni coperchio di base scivolare con smalto per unghie per garantire che i supporti di montaggio non si assorbano sotto questi scivolamenti del coperchio di base. Lasciare asciugare completamente l'unghia (10 - 15 minuti) prima di procedere.
2. Posizionare lo scivolo sotto lo stereomicroscopio e pipettare la soluzione di supporto di montaggio contenente i cervelli sezionati nello spazio tra le due coverlips. Per fornire più contrasto, è utile manovrare le luci a collo d'oca in modo che siano parallele con il piano di panca.
3. Rimuovere i supporti di montaggio extra dalla diapositiva utilizzando una pipetta, facendo attenzione a non pipettare il cervello dallo scivolo.
4. Allontanare i supporti di montaggio extra. Ciò consentirà al cervello di essere posizionato in modo più preciso durante il prossimo passo.
5. Usando un paio di forcep e lo stereomicroscopio, posizionare il cervello sulla diapositiva in un motivo a griglia con lobi antennali rivolti verso l'alto.
6. Posizionare un foglietto di copertura (il "ponte") sul cervello (Figura 1A). Utilizzare lo smalto dell'unghia per sigillare i lati dello scivolo del coperchio del ponte dove contattano gli scivolamenti del coperchio "base".
7. Utilizzando una pipetta p200, riempire lentamente la cavità centrale sotto il ponte con mezzi di montaggio freschi (Figura 1B). Posizionare una goccia alla volta sul bordo aperto del coverslip centrale e consentire al supporto di montaggio di stopparsi sotto il coperchio centrale del ponte. Continuare fino a quando l'intera cavità è riempita con mezzi di montaggio, quindi sigillare la parte superiore e inferiore con smalto chiaro per unghie.
8. Una volta che lo smalto per unghie è asciutto, immagini immediatamente le diapositive o conservale in una scatola scorrevole stretta a prova di luce a -20 °C.
9. Entro una settimana, cervelli di immagini che utilizzano un microscopio confocale a scansione laser con laser di eccitazione e cubi filtranti appropriati agli anticorpi secondari fluorescenti scelti. Le immagini Z-stack dei neuroni del corpo dei funghi sono tipicamente ottenute utilizzando obiettivi 20X o 40X. L'imaging dei neuroni fotorecettore retinica può richiedere un ingrandimento più elevato.

Representative Results

Figura 1: Montaggio di cervelli in preparazione per l'imaging ad immunofluorescenza. (A) I cervelli sono montati su diapositive SuperFrost Plus con una copertura del ponte per evitare l'appiattimento del cervello. Due slip di copertura "base" vengono aderito a una diapositiva caricata positivamente Superfrost Plus con smalto chiaro per unghie e cervelli sezionati vengono quindi posizionati sullo scivolo tra di loro. Un chiaro scivolo di copertura "ponte" viene posizionato sopra il cervello e adere ai foglietti di copertura di base. (B) Una volta asciugato lo smalto per unghie, Vectashield viene lentamente pipettato sotto il ponte per preservare la fluorescenza dell'anticorpo secondario. Lo smalto chiaro dell'unghia viene quindi utilizzato per sigillare la parte superiore e inferiore dello scivolo di copertura "ponte". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus Slides	ThermoFisher	99-910-01
Coverslips	ThermoFisher	12-553-454
fingernail polish	Electron Microscope Services (EMS)	72180
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe	Fisher	06-666