Drosophila ( Drosophila ) Quantification de la jonction neuromusculaire (NMJ) : une méthode pour évaluer la morphologie et la fonction synaptiques

Overview

La jonction neuromusculaire de Drosophila (NMJ) est employée comme modèle pour étudier la morphologie et la fonction des synapses. Cette vidéo décrit les caractéristiques importantes que les chercheurs quantifient pour caractériser le NMJ. Le protocole d’exemple montre un logiciel capable d’effectuer la quantification automatiquement.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Castells-Nobau et coll., Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017).

1. Exigences avant le traitement de l’image

1. Effectuez des préparations de livres ouverts Drosophila de larves errantes de troisième stade (L3), comme décrit précédemment.
2. Co-immunolabel Drosophila NMJ terminaux à l’aide d’une combinaison de deux marqueurs: Dlg-1 ou Hrp avec Brp pour analyse avec "Drosophila NMJ Morphometrics « , et Syt ou Csp avec Brp pour analyse avec "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics « .
   REMARQUE: Les anticorps de la même espèce peuvent être combinés en pré-étiquetage un avec un kit anticorps-conjugaison tels que les kits d’étiquetage Zenon Alexa.
3. Les terminaux image NMJ à l’aide d’un microscope de choix, par exemple la fluorescence (avec ou sans ApoTome) ou la microscopie confoccale.
   1. Acquérir une pile d’images à 2 canaux du terminal NMJ.
      1. Ajustez les paramètres du microscope d’une manière qui acquiert le terminal NMJ immunolabeled avec Dlg-1 (ou Hrp, Syt, Csp) et le canal 2 le terminal NMJ immunolabeled avec Brp.
      2. En option, analyser des images à un canal (de synapses immunolabeled avec un seul anticorps) avec les macros. Image NMJs immunolabeled uniquement avec Dlg-1 ou Hrp pour analyse avec "Drosophila NMJ Morphometrics « , ou Syt ou Csp pour "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics « .
         REMARQUE: Il n’est pas possible d’analyser les synapses immunotachées avec seulement anti-Brp.
   2. Exportez les images obtenues en tant que fichiers .tiff individuels. Inversez l’ordre du canal avant d’exécuter les macros si elles ne sont pas acquises comme indiqué.

2. Exigences logicielles et installation

1. Télécharger les macros: "Drosophila NMJ Morphometrics " et "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics " à partir du site web suivant: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
2. Déplacez le curseur vers le dossier « Macros mise à jour 1 », et cliquez sur l’option apparaissant « voir ». Une liste avec le contenu de ce dossier apparaîtra. Le dossier contient les macros "Drosophila NMJ Morphometrics " et "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics « .
   REMARQUE: Les deux macros sont compatibles avec les versions fidjiennes 1.4, qui sont également fournies dans le même dossier. Les macros peuvent ne pas s’exécuter sur les versions récentes. Veuillez utiliser la version fournie 1.4. Il n’est pas problématique de démarrer cette version, même sur les ordinateurs avec une version fidjienne plus récente disponible.
3. Cliquez sur « Télécharger tous ». Le contenu du dossier sera téléchargé sur l’ordinateur sous forme de .zip fichier. Dézip le fichier téléchargé.
4. Copiez les fichiers Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm et Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm à Fiji.app/plugins/ annuaire. Lors du redémarrage du programme, les macros apparaissent en bas du menu plugins dropdown.

3. Exécutez sub-macro « Convertir en pile » pour créer des projections Z et hyperstacks des images NMJ

1. Démarrez l’interface graphique en sélectionnant plugins dans la barre d’outils et choisissez "Drosophila NMJ Morphometrics " dans le menu dropdown.
2. Définissez le paramètre « Unique File String » dans l’interface graphique de la macro.
   REMARQUE: Le logiciel microscope utilise une signature d’identification pour organiser les avions et les canaux lors du stockage des piles en tant que fichiers .tiff individuels. Le paramètre de chaîne de fichiers unique entré doit spécifier la signature attribuée par le logiciel au premier plan du premier canal (important : le numéro de plan et de canal le plus bas doit être indiqué).
3. Sélectionnez uniquement la sous-macro « Convertir en pile » et cliquez sur « ok » et sélectionnez le dossier où les images sont situées. Si un répertoire principal avec plusieurs sous-ensembles est sélectionné, tous les fichiers individuels '.tiff dans l’annuaire principal et le sous-répertoire correspondant aux critères uniques de chaîne de fichiers seront traités.
   1. Si le z-stack ne contient qu’un seul canal, sélectionnez la case « Canal 1 uniquement ».
4. Notez que deux nouveaux fichiers par image NMJ, par défaut appelé stack_image_name et flatstack_image_name apparaîtront. Ne stockez que ces piles et plates pour une analyse plus approfondie. Les .tiff de fichiers peuvent être supprimés à ce stade, minimisant les capacités de stockage requises et évitant les sources d’erreur potentielles.

4. Exécuter sous-macro « Définir le roi » pour délimité le terminal d’intérêt NMJ

1. Démarrez l’interface graphique de "Drosophila NMJ Morphometrics « .
2. Sélectionnez uniquement la case à cocher « Define ROI » et appuyez sur « OK » et sélectionnez le répertoire principal où les images intitulées flatstack_name sont stockées et appuyez sur « Sélectionnez ». La sous-macro « Define ROI » effectue automatiquement des recherches dans tous les sous-ensembles de l’annuaire principal sélectionné.
3. Au fur et à mesure que la première projection s’ouvre, sélectionnez l’outil « Sélections à main levée » dans la barre d’outils.
4. À l’aide de la souris dessiner une sélection qui contient exclusivement le terminal complet NMJ d’intérêt et cliquez sur « OK » dans la fenêtre « Définir le terminal ». La macro procédera à la prochaine projection.
5. Délimité le prochain retour sur investissement et répétez jusqu’à ce que toutes les IA soient définies. Le fichier d’image roi, appelé « roi_image_name », sera stocké dans le même répertoire que la pile précédemment générée et les images de projection pour chacune des images traitées. La sortie de cette sous-macro est une image binaire du ROI en blanc sur fond noir.

5. Exécuter sous-macro « Analyser » pour quantifier les fonctionnalités terminal NMJ

1. Allez à la barre d’outils, sélectionnez « Plugins » et utilisez :
   «Drosophila_NMJ_Morphometrics " lors de l’analyse des synapses immunolabeled avec anti-Dlg-1 ou anti-Hrp (canal 1) avec anti-Brp (canal 2), ou "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics " lors de l’analyse des synapses immunolabeled avec anti-Syt ou anti-Csp (canal 1) avec Brp (canal 2).
   1. Lorsqu’une pile d’images de canal doit être analysée (le canal structurel Dlg-1 ou HRP pour " Drosophila_NMJ_Morphometrics « , ou Syt ou Csp pour "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics « ), sélectionnez la case " Canal 1 seulement « .
2. Ajustez l’échelle correspondant aux images à analyser.
   1. Si un pixel de l’image correspond à 2,5 μm, indiquez Scale-Pixels = 1, Scale-Distance en μm = 2,5. Dans le cas où les deux paramètres sont laissés à 0, la zone NMJ, périmètre, longueur et plus longue longueur de branche sera exprimée en nombre de pixels.
3. Si nécessaire, ajustez les paramètres d’analyse par défaut de la macro. Effectuez des ajustements uniquement si la sous-macro « Analyse » a déjà été exécuté avec des résultats insatisfaisants (voir la fin de cette section, et la section 6 pour les instructions comment optimiser les paramètres).
4. Sélectionnez les casettes « Analyser » et « Attendre » et appuyez sur « OK ».
   1. Sélectionnez la case à cochée « Attendre » lors de l’exécution de la sous-macro « Analyser » sur 2 images de canal. Dans le cas contraire, des erreurs dans le comptage des zones actives peuvent se produire en raison de capacités informatiques limitées.
5. Lorsqu’une nouvelle fenêtre « Choisissez un répertoire » s’ouvre, sélectionnez l’annuaire où se trouvent les images et appuyez sur « sélectionnez ». La macro analysera toutes les images stockées dans le répertoire principal et, le cas échéant, les dossiers suivants (en utilisant les trois fichiers de l’exécution des sous-macros précédentes: stack_image_name, flatstack_image_name et roi_image_name). La macro traite chaque image individuellement et consécutivement. Cela peut prendre plusieurs minutes par pile d’images (en fonction de la capacité de l’ordinateur).
6. Après l’exécution de la macro, notez qu’un nouveau fichier d’image nommé res_image_name pour chaque synapse analysée stockée sera créé dans le dossier parental. Les mesures quantitatives seront stockées sous forme de fichier « .txt ».
7. Inspectez toutes les images de résultat pour détecter et exclure les images avec des erreurs de segmentation. Les erreurs de segmentation possibles sont décrites dans le tableau 1,ainsi que des conseils sur la façon d’ajuster les paramètres pour contourner ces erreurs. Les images de résultat avec de telles erreurs de segmentation sont fournies à titre d’exemples dans la figure 1.
   REMARQUE: Lors de l’exécution de la macro avec les paramètres par défaut observés dans l’interface utilisateur, il y avait une précision d’environ 95% lorsque l’évaluation macro a été comparée à l’évaluation manuelle.

6. Ajuster les paramètres macro aux images

1. Lorsque plus de 5% des images montrent des erreurs de segmentation, explorez les différents algorithmes pour définir/choisir les paramètres macro les plus appropriés pour les images.
2. Ajuster la valeur du rayon de la balle roulante
   REMARQUE: La fonction rayon de boule roulante soustrait l’arrière-plan de l’image. Cette fonction est d’une importance cruciale lorsque vous travaillez avec des images acquises sur des microscopes à fluorescence et/ou lorsque les images ont un bruit de fond élevé. La soustraction de l’arrière-plan aidera les étapes de seuil automatique de la macro pour produire une segmentation adéquate des terminaux NMJ.
   1. Sélectionnez trois images stack_image_name NMJ générées par la sous-macro « Convertir en pile ». Choisissez des images représentatives de l’ensemble de données d’image.
   2. Dans la barre d’outils, sélectionnez Image | Couleur | Canaux fractionnements. Deux piles d’images seront créées, l’une représentant le canal 1 et l’autre canal 2, respectivement et les enregistrer.
   3. Ouvrez la pile d’images appartenant au canal 1 ouvert, correspondant à l’immunolabeling Dlg-1, Hrp, Syt ou Csp.
   4. Exécutez le filtre « Soustraire l’arrière-plan » en sélectionnant « Processus » dans la barre d’outils suivi de « Soustraire l’arrière-plan... dans le menu dropdown.
   5. Cliquez sur la case à cocher de prévisualisation dans la fenêtre pop-up et ajustez le rayon de roulement à la valeur la plus appropriée pour les images. Le paramètre « Rayon de roulement » doit être ajusté aux valeurs qui augmentent le contraste entre la synapse et l’arrière-plan (voir la figure 2A').
      1. Voir la figure 2 par exemple. Dans le panneau A, certaines parties de la synapse présentent les mêmes niveaux gris que l’arrière-plan, tandis que dans le panneau A' de la figure 2, un « rayon de boule roulante » de 500 entraîne un fort contraste entre la synapse et l’arrière-plan.
   6. Créez une projection z en sélectionnant dans la barre d’outils Image | Pile| Z-projection, a choisi le type de projection = Intensité maximale et enregistrer l’image résultante. Lorsque la valeur appropriée pour le rayon de la balle roulante est définie, exécutez l’algorithme « Soustraire l’arrière-plan » sur les images représentatives restantes avec la même valeur de rayon de boule roulante. Créez les projections Z et enregistrez-les (dans n’importe quel répertoire).
      REMARQUE: La valeur du rayon de roulement pour les images 8 bits ou RVB doit être au moins aussi grande que le rayon du plus grand objet de l’image qui ne fait pas partie de l’arrière-plan. Pour les images 16 bits et 32 bits, le rayon doit être inversement proportionnel à la plage de valeur pixel.
3. Déterminer les différents seuils automatiques qui seront utilisés
   1. Ouvrez les projections Z enregistrées dans l’étape précédente (6.2.6) et sélectionnez l’image | Ajuster | AutoThreshold | Essayez tout.
   2. Comme une image de résultat binaire seuil apparaîtra avec tous les différents algorithmes de seuil automatique, déterminer l’algorithme le plus approprié pour les images.
      1. Lors de l’exécution de la macro plus tard, modifiez le seuil dans les paramètres macro en conséquence.
      2. Utilisez des seuils plus restrictifs tels que « RenyiEntrophy » ou « Moments » comme seuil de contour NMJ et des seuils plus permissifs tels que « Li » pour déterminer le squelette du NMJ et « Huang » pour déterminer les zones actives. Lorsque les images sont très nettes avec peu ou pas de fond, utilisez « Huang » comme " seuil de contour NMJ. Dans le cas contraire, certaines parties de la synapse pourraient manquer après segmentation de l’image.
      3. Voir la figure 2B par exemple. La segmentation appropriée de la synapse est obtenue avec des seuils automatiques mis en évidence par des boîtes vertes. Quelques exemples de seuils non appropriés sont mis en évidence par des cases rouges (cocher les synapses à grossissement élevé). Dans ce dernier cas, soit des parties de la synapse sont manquantes, soit des parties de l’arrière-plan sont incluses.
4. Déterminer la taille maximale des petites particules
   REMARQUE: Cette fonction exclura de l’analyse toutes les particules détectées par le seuil de contour NMJ et le seuil squelette qui sont plus petites que la valeur définie dans le « réglage des petites particules ». Cette valeur est définie en pixels. Cette fonction sert de filtre antibrut et est très utile lorsque des taux élevés de fond non uniforme (comme les cristaux/poussière) sont présents dans les images obtenues.
   1. Ouvrez les projections Z enregistrées à l’étape 6.2.6. et définir l’échelle pour détecter le nombre de pixels via Analyze | Définir l’échelle. Appliquer les paramètres suivants: distance en pixels = 1, distance connue = 1, rapport d’aspect pixel = 1, Unité de longueur = pixel et appuyez sur « Ok ». Cliquez sur l’outil « Sélection ovale » dans la barre d’outils.
   2. À l’aide de la souris dessiner une sélection étroitement entourant les particules simples qui sont présents dans l’immunostaining, mais n’appartiennent pas à la NMJ. Appuyez sur Ctrl+m pour un utilisateur Windows ou cmd+m pour les utilisateurs de Mac. Une fenêtre de résultat s’ouvrira, indiquant la zone des particules sélectionnées en nombre de pixels.
   3. Répétez l’étape précédente plusieurs fois avec plusieurs artefacts présents dans les images pour déterminer la plus grande zone de contamination des particules et des artefacts. Ce sera la valeur à définir dans le paramètre lors de l’exécution de la macro plus tard. Lors de l’exécution de la macro définir la « Petite Taille des particules » que la plus petite taille de particules observé pus une marge de 25%.
   4. Voir la figure 2D par exemple. Le plus gros cristal détecté a une surface de 112 pixels. Le réglage « Petite taille de particules », lors du traitement de cette image avec la macro, doit être réglé à 125 - 150.
5. Déterminer la taille minimale du bouton
   REMARQUE: Cette fonction exclura tous les boutons détectés par le seuil de contour NMJ qui sont plus petits que la valeur définie de l’analyse. Cette valeur est définie en pixels.
   1. Suivez les mêmes étapes que décrites à la section 6.4, mais dans ce cas, dessinez une sélection autour des plus petits boutons présents dans le terminal NMJ. Choisissez la plus petite zone correspondant au plus petit bouton des plus mesurés. Il s’agit de la valeur à définir dans le paramètre de taille bouton minimum lors de l’exécution de la macro plus tard.
6. Décrivez « Maxima noise tolerance » value
   1. Pour définir la valeur « Trouver la tolérance au bruit maxima » pour la macro, ouvrez le canal 2 Z-stack enregistré dans la section 6.2.2.
   2. Allez à l’onglet plugins dans le menu popup, sélectionnez Process | Maximum (3D), et lorsque le maximum_image_name apparaît (ce qui peut prendre quelques minutes), fermez la pile d’images d’origine.
   3. Sélectionnez le Maximum..._image_name (la pile d’images nouvellement obtenue) et sélectionnez Plugins | Processus | Minimum (3D), lorsque la nouvelle image Minimum of Maximum..._image_name apears fermer le maximum ... _image_name pile.
   4. Dans la barre d’outils, sélectionnez Processus | Trouver maxima .... Une nouvelle fenêtre « Trouver maxima... » s’ouvrira. Cliquez sur la case à cocher « Sélection de points d’aperçu... » et remplissez la case « Tolérance au bruit » avec le paramètre macro par défaut 50. Les points maxima seront indiqués dans l’image sous forme de petites croix.
      1. Augmentez la valeur de la « tolérance au bruit » si vous observez un excès de zones actives annotées, c’est-à-dire des croix qui ne sont pas au-dessus des zones actives qui ne sont pas axées sur le plan de pile sélectionné, ou de fausses zones actives détectées en arrière-plan.
         1. D’autre part, si l’observation de zones actives incomplètement annotées, c’est-à-dire les zones actives au point qui ne sont pas reconnues, diminue la valeur de la « tolérance au bruit Maxima ». Continuez à essayer différentes valeurs à la suite de cette procédure jusqu’à ce que les croix soient correctement étiqueter les zones actives au point. Remplissez la « Tolérance au bruit Maxima trouver » avec cette valeur.
         2. Voir la figure 2C par exemple. Trop de zones actives sont détectées. Dans la figure 2C’seules les zones actives au point sont détectées lors de l’augmentation de la valeur de tolérance au bruit Maxima.
   5. Exécutez la sous-macro « Analyser » pour les images représentatives sélectionnées à l’étape 5.1, avec les paramètres définis dans toutes les étapes précédentes.
7. Ajuster brp-ponncta seuil inférieur et supérieur
   1. Notez qu’un nouveau fichier apparaîtra après l’exécution de la macro selon l’étape 6.6, appelée 2_active_zone_stack_image_name. Dans cette pile d’images, les zones actives détectées par la fonction « Trouver maxima » sont indiquées par des points blancs dans chaque plan.
   2. Ouvrez ce fichier en le faisant glisser et en le laissant tomber dans la barre d’outils et sélectionnez Image | Pile | Projet Z | Type de projection = Tranches de somme. Une projection du 2_active_zone_stack_image_name sera obtenue.
   3. Sélectionnez Image | Ajuster | seuil. Une nouvelle fenêtre « Seuil » s’ouvrira. Faites glisser la barre supérieure pour choisir une valeur seuil où, tous les foyers désirés/ Taches brp-positives sont visualisés en rouge.
      REMARQUE: Si le seuil est fixé trop bas, un excès de zones actives sera compté. Si l’ensemble est trop élevé, une fraction des zones actives sera manquée.
      1. Voir la figure 2E par exemple. Lorsque le seuil est fixé à 400, la plupart des zones actives (symbolisées comme un foyer de 1 pixel) ne sont pas incluses dans la segmentation, puisqu’elles ne sont pas mises en évidence en rouge (figure 2E). Lorsque le seuil est fixé à une valeur de 50, toutes les zones actives sont mises en surbrillance en rouge(figure 2E').
   4. Définissez cette valeur comme seuil minimum. Laissez le « seuil de ponction supérieure » sur la valeur maximale.
   5. Rééd exécuter la sous-macro « Analyser » pour les images représentatives avec les paramètres définis dans toutes les étapes précédentes de cette section. Évaluez de façon critique les fichiers d’images qui en résultent et assurez-vous que la segmentation est effectuée correctement. Si ce n’est pas le cas, réajustez les paramètres en fonction de la nature des erreurs de segmentation (figure 1, tableau 1).

Representative Results

Figure 1 : Exemples de résultats de segmentation macro inappropriés. Résultat des images après avoir couru "Drosophila NMJ Morphometrics " ou "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics « . Certaines parties du terminal synaptique ne sont pas incluses dans le contour jaune (A). Certaines parties de l’arrière-plan sont incluses dans le terminal synaptique par le contour jaune (B). La ligne bleue du squelette s’étend au-delà du terminal synaptique( C - D). Trop de zones actives sont détectées (E - E '). Certaines zones actives ne sont toujours pas détectées par l’analyse (G - G'). Les zones actives sont détectées en dehors de la synapse (F). Segmentation bouton incorrecte (Uniquement applicable lors de l’exécution Drosophila NMJ Bouton Morphometrics), boutons sont manqués (H) ou trop de boutons sont détectés par la segmentation (I). Les particules comme les cristaux ou la poussière qui font partie de l’arrière-plan sont incluses dans la segmentation (J). Des informations sur la façon de modifier les paramètres pour éviter ces erreurs sont fournies dans le tableau 1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Exemples d’ajustements de macro-réglage et de leurs conséquences pour la segmentation de l’image. (A) Soustrayez l’aperçu de fond d’une synapse immunolabeled Dlg-1, photographiée sur un microscope à fluorescence avec ApoTome, lorsque le « rayon de boule roulante » est réglé à 20 (A) ou 500 (A '). (B) Images de sortie obtenues après l’exécution de l’image | Ajuster | Seuil automatique | Essayez toutes les images illustre les segmentations d’image obtenues par les 16 algorithmes différents de seuil automatique. (C) Aperçu « Trouver Maxima » lors de la mise en place de « Tolérance au bruit » à 50 (C) et 500 (C '); Les zones actives détectées par la segmentation sont étiquetées par une petite croix. (D) Mesure des « petites particules » apparaissant dans l’arrière-plan de l’image d’une synapse immunolabeled avec anti-Hrp, photographié sur un microscope confocal. (E) Projection « Tranches de somme » obtenue à partir de la 2_active_zone_stack_ima-ge_name. Le seuil est fixé à 400 (E) et à 50 (E '). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

segmentation	Erreurs observées	exemple	Ajustements requis
Zone et périmètre du NMJ (Représenté par contour jaune dans l’image du résultat)	Certaines parties du terminal synaptique ne sont pas incluses dans le contour jaune ou des parties de l’arrière-plan sont inclus dans le terminal synaptique décrit en jaune.	Figure 2A-B	Ajustez la valeur 'Rolling Ball Radius'. Voir la section 6.1.	Ajuster le seuil de contour de la NMJ. Voir la section 6.2.
Paramètres liés à la longueur NMJ (Représenté par la ligne bleue de squelette dans l’image de résultats)	La ligne bleue de squelette s’étend au-delà ou n’est pas présent le long de l’ensemble du terminal synaptique.	Figure 2C-D	Ajustez la valeur 'Rolling Ball Radius'. Voir la section 6.1.	Ajuster le seuil de contour de la NMJ. Voir la section 6.2.
Ponction brp-positive (Représenté par des points dans l’image des résultats)	Trop de zones actives sont détectées.	Figure 2E-E'	Diminuez la valeur « Trouver la tolérance au bruit maxima ». Voir la section 6.5.
Ponction brp-positive (Représenté par des points dans l’image des résultats)	Les zones actives sont manquées par l’analyse.	Figure 2G-G'	Augmentez la valeur « Trouver la tolérance au bruit maxima ». Voir la section 6.5.	Diminuer le seuil inférieur de Brp-puncta. Voir la section 6.6.
Ponction brp-positive (Représenté par des points dans l’image des résultats)	Les artefacts de zone active sont détectés à l’extérieur du terminal synaptique.	Figure 2F	Ajuster la section 6.2 du seuil de la zone active.	Augmenter le seuil inférieur de Brp-puncta. Voir la section 6.6.
Petites particules	Particules telles que les cristaux ou la poussière qui font partie de l’arrière-plan semblent être inclus dans la segmentation.	Figure 2J	Sélectionnez la boîte 'Supprimer les petites particules'. Voir la section 6.3.	Déterminer la taille maximale des petites particules. Voir la section 6.3.
Segmentation bouton	Segmentation incorrecte de bouton (Uniquement applicable à Drosophila NMJ Bouton Morphometrics; n’utilisez pas Drosophila NMJ Morphometrics pour la segmentation bouton).	Figure 2H-I	Ajuster le seuil de contour de la NMJ. Voir la section 6.1.	Déterminer la « taille minimale du bouton ». Voir la section 6.4.

Tableau 1 : Guide de dépannage pour les différents types d’erreurs dans la segmentation de l’image qui peuvent être produites par les macros. Ce tableau décrit différents types d’erreurs de segmentation d’image produites par les macros. Ceux-ci peuvent facilement être détectés dans les images de résultats. Des exemples de chaque type d’erreur sont indiqués dans la figure 1. Dans la section « ajustements » du tableau, les paramètres qui doivent être ajustés sont mis en surbrillance, et l’utilisateur est référé à la sous-étape critique de la section 6, qui décrivent comment ajuster ces paramètres.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Software
FIJI