دروسوفيلا تقاطع العصبية والعضلية (NMJ) القياس الكمي: طريقة لتقييم مورفولوجيا متشابك ووظيفة

Overview

يتم استخدام التقاطع العصبي العضلي Drosophila (NMJ) كنموذج لدراسة مورفولوجيا ووظيفة نقاط الاشتباك العصبي. يصف هذا الفيديو السمات الهامة التي يحددها الباحثون لتوصيف NMJ. يوضح بروتوكول المثال برنامجا قادرا على إجراء القياس الكمي تلقائيا.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من Castells-Nobau وآخرون.  (2017).

1. متطلبات قبل معالجة الصور

1. قم بإجراء تحضيرات كتاب Drosophila المفتوحة ليرقات التجول في النجوم الثالثة (L3) ، كما هو موضح سابقا.
2. المشتركة المناعية Drosophila محطات NMJ باستخدام مزيج من علامتين: DLG-1 أو هرب جنبا إلى جنب مع برب للتحليل مع"Drosophila NMJ Morphometrics"، وسيت أو CSP جنبا إلى جنب مع برب للتحليل مع"Drosophila NMJ بوتون مورفومترس".
   ملاحظة: يمكن الجمع بين الأجسام المضادة من نفس النوع عن طريق وضع العلامات المسبقة مع مجموعة أدوات اقتران الأجسام المضادة مثل مجموعات وضع العلامات Zenon Alexa.
3. محطات صورة NMJ باستخدام المجهر المفضل، على سبيل المثال، الفلورسينس (مع أو بدون ApoTome) أو المجهر الكونفوكوكال.
   1. الحصول على مكدس صور 2 قناة من محطة NMJ.
      1. ضبط إعدادات المجهر بطريقة أن القناة 1 يكتسب مناعة محطة NMJ مع Dlg-1 (أو Hrp, Syt, Csp) والقناة 2 مناعة NMJ الطرفية التي تحمل علامة مع Brp.
      2. اختياريا، تحليل الصور ذات القناة الواحدة (من نقاط الاشتباك العصبي المناعية مع الأجسام المضادة واحد) مع وحدات الماكرو. صورة NMJs immunolabeled بشكل فريد مع Dlg-1 أو Hrp للتحليل مع"Drosophila NMJ Morphometrics" ، أو Syt أو Csp ل "Drosophila NMJ بوتون مورفومتري".
         ملاحظة: ليس من الممكن لتحليل نقاط الاشتباك العصبي مناعة ملطخة فقط المضادة Brp.
   2. تصدير الصور التي تم الحصول عليها كملفات .tiff الفردية. عكس ترتيب القناة قبل تشغيل وحدات الماكرو إذا لم يتم الحصول عليها كما هو موضح.

2. متطلبات البرمجيات والتركيب

1. تحميل وحدات الماكرو:"Drosophila NMJ Morphometrics" و"Drosophila NMJ بوتون مورفومترس" من الموقع التالي: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
2. نقل المؤشر إلى المجلد "وحدات الماكرو تحديث 1"، وانقر على الخيار "عرض" الظهور. ستظهر قائمة مع محتوى هذا المجلد. المجلد يحتوي على وحدات الماكرو"Drosophila NMJ مورفومترس" و"Drosophila NMJ بوتون مورفومترس".
   ملاحظة: كل من وحدات الماكرو متوافقة مع إصدارات فيجي 1.4، والتي يتم توفيرها أيضا في نفس المجلد. قد لا يتم تشغيل وحدات الماكرو على الإصدارات الأخيرة. يرجى الاستفادة من الإصدار 1.4 المقدم. ومن غير إشكالية لبدء هذا الإصدار، حتى على أجهزة الكمبيوتر مع إصدار فيجي أحدث المتاحة.
3. انقر على "تحميل كل شيء". سيتم تحميل محتوى المجلد إلى الكمبيوتر كملف .zip. فك ضغط الملف الذي تم تنزيله.
4. نسخ ملفات drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm و Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm إلى دليل Fiji.app/plugins/. عند إعادة تشغيل البرنامج، ستظهر وحدات الماكرو في أسفل القائمة المنسدلة للإضافات.

3. تشغيل Sub-macro "تحويل إلى المكدس" لإنشاء Z-الإسقاطات وHyperstacks من الصور NMJ

1. بدء واجهة رسومية عن طريق اختيار الإضافات في شريط الأدوات واختيار"Drosophila NMJ Morphometrics" في القائمة المنسدلة.
2. تعريف الإعداد "سلسلة ملفات فريدة" في واجهة رسومية الماكرو.
   ملاحظة: يستخدم برنامج المجهر توقيع تعريف لتنظيم الطائرات والقنوات عند تخزين المداخن كملفات .tiff الفردية. يحتاج إعداد سلسلة الملفات الفريدة المدخلة إلى تحديد التوقيع المعين من قبل البرنامج إلى المستوى الأول للقناة الأولى (المهم: يجب الإشارة إلى أدنى مستوى ورقم قناة).
3. حدد فقط الماكرو الفرعي "تحويل إلى كومة" وانقر فوق "موافق" وحدد المجلد حيث توجد الصور. إذا تم تحديد دليل رئيسي يحتوي على العديد من المجلدات الفرعية، ستتم معالجة كافة الملفات الفردية .tiff ضمن الدليل الرئيسي والملف الفرعي المطابق لمعايير سلسلة الملفات الفريدة.
   1. إذا كان المكدس z يحتوي على قناة واحدة فقط، حدد المربع "القناة 1 فقط".
4. لاحظ ظهور ملفين جديدين لكل صورة NMJ، يتم تسميتهما بشكل افتراضي باسم stack_image_name flatstack_image_name. تخزين هذه المكدس فقط و flatstack لمزيد من التحليل. يمكن حذف سلسلة الملفات .tiff في هذه المرحلة، مما يقلل من سعة التخزين المطلوبة ويتجنب مصادر الأخطاء المحتملة.

4. تشغيل Sub-macro "تعريف عائد الاستثمار" لتحديد محطة NMJ من الفائدة

1. بدء واجهة رسومية من"Drosophila NMJ مورفومترس".
2. حدد فقط خانة الاختيار "تعريف عائد الاستثمار" واضغط على "موافق" وحدد الدليل الرئيسي حيث يتم تخزين الصور المعنونة flatstack_name واضغط على "تحديد". الماكرو الفرعي "تعريف ROI" تلقائيا بالبحث خلال كافة المجلدات الفرعية ضمن الدليل الرئيسي المحدد.
3. عند فتح العرض الأول، حدد أداة "التحديدات اليدوية" في شريط الأدوات.
4. باستخدام الماوس رسم التحديد الذي يحتوي حصرا على محطة NMJ كاملة من الفائدة وانقر فوق "موافق" في إطار "تحديد المحطة الطرفية". سيتم متابعة الماكرو مع الإسقاط التالي.
5. حدد عائد الاستثمار التالي وكرر حتى يتم تعريف جميع ROIs. سيتم تخزين ملف صورة عائد الاستثمار، المسمى "roi_image_name"، في نفس الدليل الذي تم إنشاؤه مسبقا ككدسة وصور إسقاط لكل صورة من الصور المعالجة. إخراج هذا الماكرو الفرعي هو صورة ثنائية من ROI باللون الأبيض على خلفية سوداء.

5. تشغيل Sub-macro "تحليل" لتحديد ميزات محطة NMJ

1. انتقل إلى شريط الأدوات، وحدد "الإضافات" واستخدم:
   "Drosophila_NMJ_Morphometrics" عند تحليل نقاط الاشتباك العصبي المناعية التي تحمل علامات مضادة ل Dlg-1 أو Anti-Hrp (القناة 1) جنبا إلى جنب مع مكافحة Brp (القناة 2) ، أو"Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" عند تحليل نقاط الاشتباك العصبي المناعية مع مكافحة سيت أو مكافحة Csp (القناة 1) جنبا إلى جنب مع Brp (القناة 2).
   1. عندما يتم تحليل مداخن صورة قناة واحدة (القناة الهيكلية Dlg-1 أو HRP ل "Drosophila_NMJ_Morphometrics"، أو Syt أو Csp ل"Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics")، حدد المربع "القناة 1 فقط".
2. ضبط المقياس المطابق للصور التي سيتم تحليلها.
   1. إذا كان بكسل واحد في الصورة يتوافق مع 2.5 ميكرومتر، أشر إلى مقياس بكسل = 1، مقياس المسافة في μm = 2.5. في حالة ترك كلا الإعدادين عند 0، سيتم التعبير عن منطقة NMJ والمحيط والطول وأطول طول للفرع بعدد وحدات البكسل.
3. إذا لزم الأمر، قم بضبط إعدادات التحليل الافتراضية للماكرو. قم بإجراء التعديلات فقط في حالة تشغيل الماكرو الفرعي "تحليل" مسبقا بنتائج غير مرضية (راجع نهاية هذا القسم، والقسم 6 للحصول على إرشادات حول كيفية تحسين الإعدادات).
4. حدد خانات الاختيار "تحليل" و "انتظر" واضغط على "موافق".
   1. حدد خانة الاختيار "انتظار" عند تشغيل الماكرو الفرعي "تحليل" على صور قناة 2. وإلا يمكن أن تحدث أخطاء في حساب المنطقة النشطة بسبب قدرات الكمبيوتر المحدودة.
5. كما يفتح إطار جديد "اختيار دليل" ، حدد الدليل حيث توجد الصور واضغط على "حدد". سيقوم الماكرو بتحليل كافة الصور المخزنة في الدليل الرئيسي والمجلدات اللاحقة إذا كان ذلك ممكنا (باستخدام الملفات الثلاثة من تنفيذ وحدات الماكرو الفرعية السابقة: stack_image_name flatstack_image_name و roi_image_name). الماكرو بمعالجة كل صورة بشكل فردي وعلى التوالي. قد يستغرق ذلك عدة دقائق لكل مكدس صور (اعتمادا على سعة الكمبيوتر).
6. بعد تشغيل الماكرو، لاحظ أنه سيتم إنشاء ملف صورة جديد اسمه res_image_name لكل synapse تحليل المخزنة في المجلد الأبوي. سيتم تخزين القياسات الكمية كملف "النتائج.txt".
7. فحص كافة صور النتائج للكشف عن الصور التي بها أخطاء تجزئة واستبعادها. يتم وصف أخطاء التقسيم المحتملة في الجدول 1، بالإضافة إلى نصائح حول كيفية ضبط الإعدادات للتحايل على هذه الأخطاء. يتم توفير الصور الناتجة مع أخطاء التقسيم مثل الأمثلة في الشكل 1.
   ملاحظة: عند تشغيل الماكرو مع الإعدادات الافتراضية التي تمت ملاحظتها في واجهة المستخدم، كانت هناك دقة 95٪ تقريبا عند مقارنة تقييم الماكرو بالتقييم اليدوي.

6. ضبط إعدادات الماكرو للصور

1. عندما تظهر أكثر من 5٪ من الصور أخطاء التقسيم، استكشف الخوارزميات المختلفة لتحديد / اختيار إعدادات الماكرو الأكثر ملاءمة للصور.
2. ضبط قيمة نصف قطر الكرة المتداول
   ملاحظة: تطرح وظيفة نصف قطر الكرة المتداول خلفية الصورة. هذه الوظيفة ذات أهمية حاسمة عند العمل مع الصور المكتسبة على المجاهر الفلورية و / أو عندما تكون الصور عالية الضوضاء الخلفية. سيساعد طرح الخلفية خطوات العتبة التلقائية للماكرو على إنتاج تجزئة كافية لمحطات NMJ.
   1. حدد ثلاث صور NMJ stack_image_name التي تم إنشاؤها بواسطة الماكرو الفرعي "تحويل إلى مكدس". اختر الصور التي تمثل مجموعة بيانات الصور.
   2. في شريط الأدوات، حدد صورة | | الألوان تقسيم القنوات. سيتم إنشاء مكدسين للصور، أحدهما يمثل القناة 1 والآخر القناة 2، على التوالي وحفظهما.
   3. افتح مكدس الصور التابع للقناة 1 المفتوحة، المطابقة ل Dlg-1 أو Hrp أو Syt أو Csp immunolabeling.
   4. تشغيل عامل التصفية "طرح الخلفية" عن طريق تحديد "عملية" في شريط الأدوات متبوعا ب "طرح الخلفية..." في القائمة المنسدلة.
   5. انقر على مربع الاختيار معاينة في النافذة المنبثقة وضبط دائرة نصف قطرها الكرة المتداول إلى القيمة الأنسب للصور. يجب تعديل إعداد "دائرة نصف قطر الكرة المتداول" إلى القيم التي تزيد من التباين بين المشبك والخلفية (انظر الشكل 2A').
      1. راجع الشكل 2 للحصول على مثال. في لوحة A، تظهر أجزاء من المشبك نفس المستويات الرمادية كخلفية، بينما في الشكل 2 لوحة A '"دائرة نصف قطرها الكرة المتداول" من 500 النتائج في تناقض قوي بين المشبك والخلفية.
   6. إنشاء إسقاط z عن طريق تحديد في شريط الأدوات صورة | مكدس| Z-الإسقاط، اختار نوع الإسقاط = الحد الأقصى كثافة وحفظ الصورة الناتجة. عندما يتم تعريف القيمة المناسبة لنصف قطر الكرة المتداول، قم بتشغيل خوارزمية "طرح الخلفية" على الصور التمثيلية المتبقية بنفس قيمة نصف قطر الكرة المتداول. إنشاء إسقاطات Z وحفظها (في أي دليل).
      ملاحظة: يجب أن تكون قيمة نصف قطر الكرة المتداول لصور 8 بت أو RGB كبيرة على الأقل مثل نصف قطر أكبر كائن في الصورة التي ليست جزءا من الخلفية. بالنسبة للصور ذات 16 بت و32 بت، يجب أن يكون نصف القطر متناسبا عكسيا مع نطاق قيمة البكسل.
3. تحديد العتبات التلقائية المختلفة التي سيتم استخدامها
   1. افتح إسقاطات Z المحفوظة في الخطوة السابقة (6.2.6) وحدد الصورة | ضبط | | الحيازة التلقائية حاول كل شيء.
   2. كما ستظهر صورة نتيجة ثنائية عتبة مع جميع الخوارزميات عتبة السيارات المختلفة، وتحديد خوارزمية الأنسب للصور.
      1. عند تشغيل الماكرو لاحقا، تغيير العتبة في إعدادات الماكرو وفقا لذلك.
      2. استخدام عتبات أكثر تقييدا مثل "RenyiEntrophy" أو "لحظات" كما عتبة المخطط التفصيلي NMJ وعتبات أكثر تساهلا مثل "لي" لتحديد الهيكل العظمي NMJ، و "هوانغ" لتحديد المناطق النشطة. عندما تكون الصور حادة جدا مع خلفية ضئيلة أو معدومة ، استخدم "هوانغ" كما" عتبة مخطط NMJ. وإلا قد تكون أجزاء من المشبك مفقودة بعد تجزئة الصورة.
      3. راجع الشكل 2B للحصول على مثال. يتم الحصول على تجزئة مناسبة من المشبك مع السيارات عتبات أبرزها مربعات خضراء. يتم تمييز بعض الأمثلة على العتبات غير المناسبة بواسطة مربعات حمراء (تحقق من نقاط الاشتباك العصبي عند التكبير العالي). في هذا الأخير، إما أجزاء من المشبك مفقودة أو يتم تضمين أجزاء من الخلفية.
4. تحديد الحجم الأقصى للجسيمات الصغيرة
   ملاحظة: ستستبعد هذه الوظيفة جميع الجسيمات التي تم اكتشافها بواسطة عتبة مخطط NMJ و عتبة الهيكل العظمي التي هي أصغر من القيمة المحددة في "إعداد الجسيمات الصغيرة" من التحليل. يتم تعريف هذه القيمة بالبكسل. هذه الوظيفة بمثابة فلتر الضوضاء ومفيدة جدا عندما تكون معدلات عالية من خلفية غير موحدة (مثل بلورات / الغبار) موجودة في الصور التي تم الحصول عليها.
   1. افتح إسقاطات Z المحفوظة في الخطوة 6.2.6. وتعيين المقياس للكشف عن عدد وحدات البكسل عبر تحليل | تعيين مقياس. تطبيق الإعدادات التالية: المسافة بالبكسل = 1، المسافة المعروفة = 1، نسبة العرض إلى الارتفاع بكسل = 1، وحدة الطول = بكسل واضغط على "موافق". انقر على أداة "الاختيار البيضاوي" في شريط الأدوات.
   2. باستخدام الماوس رسم مجموعة مختارة المحيطة عن كثب جزيئات واحدة موجودة في المناعة ولكن لا تنتمي إلى NMJ. اضغط على Ctrl+m لمستخدم Windows أو cmd+m لمستخدمي Mac. ستفتح نافذة نتيجة تشير إلى مساحة الجسيمات المحددة بعدد وحدات البكسل.
   3. كرر الخطوة السابقة عدة مرات مع العديد من القطع الأثرية الموجودة في الصور لتحديد أكبر منطقة ملوثة الجسيمات / القطع الأثرية. ستكون هذه هي القيمة التي سيتم تعيينها في الإعداد عند تشغيل الماكرو لاحقا. عند تشغيل الماكرو تعيين "حجم الجسيمات الصغيرة" كما لاحظ أصغر حجم الجسيمات صديد هامش 25٪.
   4. راجع الشكل 2D للحصول على مثال. أكبر الكريستال المكتشفة لديها مساحة 112 بكسل. يجب تعيين إعداد "حجم الجسيمات الصغيرة"، عند معالجة هذه الصورة مع الماكرو، إلى 125-150.
5. تحديد الحد الأدنى لحجم بوتون
   ملاحظة: ستستبعد هذه الدالة كافة boutons التي تم الكشف عنها بواسطة عتبة المخطط التفصيلي NMJ أصغر من القيمة المعرفة من التحليل. يتم تعريف هذه القيمة بالبكسل.
   1. اتبع نفس الخطوات كما هو موضح في القسم 6.4، ولكن في هذه الحالة رسم تحديد المحيطة أصغر boutons موجودة في محطة NMJ. اختيار أصغر مساحة المقابلة لأصغر بوتون من تلك التي تم قياسها. هذه هي القيمة التي يجب تعيينها في إعداد الحد الأدنى لحجم النوبة عند تشغيل الماكرو لاحقا.
6. تعريف قيمة "ماكسيما التسامح مع الضوضاء"
   1. لتعريف قيمة "البحث عن الحد الأقصى التسامح الضوضاء" للماكرو، افتح القناة 2 Z-المكدس المحفوظة في المقطع 6.2.2.
   2. انتقل إلى علامة التبويب المكونات الإضافية في القائمة المنبثقة، وحدد عملية | الحد الأقصى(3D) ، وعندما يظهر maximum_image_name (والتي يمكن أن يستغرق بضع دقائق) ، وإغلاق مكدس الصورة الأصلية.
   3. حدد Maximum..._image_name (مكدس الصور الذي تم الحصول عليه حديثا) وحدد المكونات الإضافية | | العملية الحد الأدنى (3D) ، عندما الصورة الجديدة الحد الأدنى من Maximum..._image_name apears إغلاق الحد الأقصى... _image_name المكدس.
   4. في شريط الأدوات، حدد معالجة | العثور على ماكسيما.... نافذة جديدة "البحث عن ماكسيما..." ستفتح. انقر فوق خانة الاختيار "معاينة نقطة التحديد..." وملء مربع "التسامح الضوضاء" مع الإعداد الماكرو الافتراضي 50. سيتم الإشارة إلى نقاط الحد الأقصى في الصورة كقليلا من الصلبان.
      1. قم بزيادة قيمة "تحمل الضوضاء" إذا لاحظت وجود زيادة في المناطق النشطة المشروحة، أي الصلبان التي ليست فوق المناطق النشطة التي لا تركز على مستوى المكدس المحدد، أو المناطق النشطة الزائفة التي تم اكتشافها في الخلفية.
         1. ومن ناحية أخرى، إذا لوحظت مناطق نشطة مشروحة بشكل غير كامل، أي المناطق النشطة التي لم يتم التعرف عليها، فإنها تقلل من قيمة "تسامح ماكسيما مع الضوضاء". استمر في تجربة قيم مختلفة باتباع هذا الإجراء حتى تقوم الصلبان بتسمية المناطق النشطة في التركيز بشكل مناسب. ملء "البحث عن الحد الأقصى التسامح الضوضاء" مع هذه القيمة.
         2. راجع الشكل 2C للحصول على مثال. يتم الكشف عن العديد من المناطق النشطة. في الشكل 2C ' يتم الكشف عن المناطق النشطة فقط في التركيز عند زيادة قيمة "ماكسيما التسامح الضوضاء".
   5. قم بتشغيل الماكرو الفرعي "تحليل" للصور التمثيلية المحددة في الخطوة 5.1، مع تحديد الإعدادات في كافة الخطوات السابقة.
7. ضبط عتبة Brp-puncta الدنيا والعتبة العليا
   1. لاحظ أن ملف جديد سوف تظهر بعد تشغيل الماكرو وفقا للخطوة 6.6، تسمى 2_active_zone_stack_image_name. في هذه الصورة كومة المناطق النشطة التي تم الكشف عنها من قبل "البحث عن الحد الأقصى" وظيفة يشار إليها النقاط البيضاء في كل مستوى.
   2. افتح هذا الملف بسحبه وإفلاته في شريط الأدوات وحدد Image | | المكدس Z-مشروع | نوع الإسقاط = شرائح المجموع. وسيتم الحصول على إسقاط 2_active_zone_stack_image_name.
   3. تحديد | الصور ضبط | عتبة. سيتم فتح إطار جديد "عتبة". الشريحة الشريط العلوي لاختيار قيمة عتبة حيث، يتم تصور جميع البؤر المطلوبة / Brp-إيجابية البقع باللون الأحمر.
      ملاحظة: إذا تم تعيين عتبة منخفضة جدا، سيتم حساب فائض من المناطق النشطة. إذا تم تعيين عالية جدا، سيتم تفويت جزء صغير من المناطق النشطة.
      1. راجع الشكل 2E للحصول على مثال. عندما يتم تعيين عتبة إلى 400، لا يتم تضمين معظم المناطق النشطة (يرمز إلى بؤر بكسل 1) في تجزئة، لأنها لا يتم تمييز باللون الأحمر(الشكل 2E). عندما يتم تعيين عتبة إلى قيمة 50 يتم تمييز جميع المناطق النشطة باللون الأحمر(الشكل 2E').
   4. تعريف هذه القيمة كحد أدنى العتبة. اترك "عتبة البونكتا العليا" على القيمة القصوى.
   5. إعادة تشغيل الماكرو الفرعي "تحليل" للصور التمثيلية مع الإعدادات المعرفة في كافة الخطوات السابقة من هذا القسم. تقييم ملفات الصور الناتجة بشكل نقدي والتأكد من أن يتم تجزئة بشكل صحيح. إذا لم تكن هذه هي الحالة إعادة ضبط الإعدادات وفقا لطبيعة أخطاء التجزئة (الشكل 1، الجدول 1).

Representative Results

الشكل 1: أمثلة على نتائج تجزئة الماكرو غير الملائمة. نتائج الصور بعد تشغيل"Drosophila NMJ مورفومترس" أو"Drosophila NMJ بوتون مورفومترس". لا يتم تضمين أجزاء من محطة متشابك في المخطط الأصفر (A). يتم تضمين أجزاء من الخلفية في محطة متشابك من قبل المخطط الأصفر (ب). خط الهيكل العظمي الأزرق يمتد إلى ما وراء محطة متشابك (C - D). يتم الكشف عن العديد من المناطق النشطة(E - E'). بعض المناطق النشطة لا تزال غير مكتشفة من قبل التحليل (G - G '). يتم الكشف عن المناطق النشطة خارج المشبك (F). تجزئة بوتون غير صحيحة (تنطبق فقط عند تشغيل Drosophila NMJ بوتون مورفومتري) ، يتم تفويت boutons (H) أو يتم الكشف عن الكثير من boutons بواسطة تجزئة (I). يتم تضمين جزيئات مثل بلورات أو الغبار التي هي جزء من الخلفية في تجزئة (J). يتم توفير معلومات حول كيفية تغيير الإعدادات لتجنب هذه الأخطاء في الجدول 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: أمثلة على تعديلات إعداد الماكرو وعواقبها على تجزئة الصورة. (أ)طرح معاينة خلفية من المشبك المناعي Dlg-1، في الصورة على المجهر مضان مع ApoTome، عندما يتم تعيين "دائرة نصف قطرها الكرة المتداول" إلى 20 (A) أو 500 (A '). (ب) إخراج الصور التي تم الحصول عليها بعد تشغيل صورة | ضبط | | العتبة التلقائية محاولة كل صورة يوضح تقسيمات الصورة التي حصلت عليها خوارزميات عتبة السيارات 16 مختلفة. (C) "البحث ماكسيما" معاينة عند إعداد "التسامح الضوضاء" في 50 (C) و 500 (C '); يتم تسمية المناطق النشطة التي تم الكشف عنها بواسطة تجزئة بواسطة صليب صغير. (د)قياس "الجسيمات الصغيرة" التي تظهر في خلفية صورة مناعة متشابكة مع المضادة للهرب، في الصورة على المجهر confocal. (ه) إسقاط "شرائح مجموع" التي تم الحصول عليها من 2_active_zone_stack_ima ge_name. يتم تعيين عتبة في 400 (ه) وعلى 50 (هاء '). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تجزئه	الأخطاء الملحوظة	مثل	التعديلات المطلوبة
منطقة ومحيط NMJ (ممثلة بالمخطط الأصفر في صورة النتيجة)	أجزاء من محطة متشابك إما غير مشمولة في المخطط الأصفر أو أجزاء من الخلفية يتم تضمينها في محطة متشابك المبينة باللون الأصفر.	الشكل 2A-B	ضبط قيمة "دائرة نصف قطر الكرة المتداول". انظر القسم 6-1- الاطلاع على الاطلاع على الأقسام 1.1	ضبط 'عتبة المخطط التفصيلي NMJ'. انظر القسم 6-2.
المعلمات ذات الصلة طول NMJ (يمثلها خط الهيكل العظمي الأزرق في صورة النتائج)	خط الهيكل العظمي الأزرق إما يمتد إلى ما وراء أو غير موجود على طول محطة متشابك كامل.	الشكل 2C-D	ضبط قيمة "دائرة نصف قطر الكرة المتداول". انظر القسم 6-1- الاطلاع على الاطلاع على الأقسام 1.1	ضبط 'عتبة المخطط التفصيلي NMJ'. انظر القسم 6-2.
برب إيجابية بونكتا (ممثلة بنقاط في صورة النتائج)	يتم الكشف عن العديد من المناطق النشطة.	الشكل 2E-E'	إنقاص قيمة "البحث عن الحد الأقصى لتحمل الضوضاء". انظر القسم 6-5.
برب إيجابية بونكتا (ممثلة بنقاط في صورة النتائج)	يتم تفويت المناطق النشطة من خلال التحليل.	الشكل 2G-G'	زيادة قيمة "البحث عن الحد الأقصى لتحمل الضوضاء". انظر القسم 6-5.	انخفاض 'برب بونتا عتبة أقل'. انظر القسم 6-6- الاطلاع على
برب إيجابية بونكتا (ممثلة بنقاط في صورة النتائج)	يتم الكشف عن القطع الأثرية المنطقة النشطة خارج محطة متشابك.	الشكل 2F	ضبط "عتبة المنطقة النشطة" القسم 6.2.	زيادة "عتبة أقل Brp-puncta". انظر القسم 6-6- الاطلاع على
جزيئات صغيرة	جزيئات مثل بلورات أو الغبار التي هي جزء من الخلفية يبدو أن تدرج في التجزئة.	الشكل 2J	حدد المربع "إزالة الجسيمات الصغيرة". انظر القسم 6-3.	تحديد الجسيمات الصغيرة الحجم الأقصى. انظر القسم 6-3.
تجزئة بوتون	تجزئة بوتون غير صحيحة (ينطبق فقط على Drosophila NMJ بوتون مورفومترس؛ لا تستخدم Drosophila NMJ مورفومترس للتجزئة بوتون).	الشكل 2H-I	ضبط 'عتبة المخطط التفصيلي NMJ'. انظر القسم 6-1- الاطلاع على الاطلاع على الأقسام 1.1	تحديد 'الحد الأدنى لحجم بوتون'. انظر القسم 6-4.

الجدول 1: دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها لأنواع مختلفة من الأخطاء في تجزئة الصور التي يمكن إنتاجها بواسطة وحدات الماكرو. يصف هذا الجدول أنواعا مختلفة من أخطاء تقسيم الصور التي تنتجها وحدات الماكرو. ويمكن بسهولة الكشف عن هذه الصور في نتائج. يتم عرض أمثلة لكل نوع خطأ في الشكل 1. في "قسم التعديلات" من الجدول، يتم تمييز الإعدادات التي تحتاج إلى تعديل، ويشار إلى المستخدم إلى الخطوة الفرعية الحرجة من القسم 6، والتي تصف كيفية ضبط هذه الإعدادات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Software
FIJI