To-Photon Laser-induceret neurale skade: En metode til at observere Axon Degeneration og regenerering i Drosophila Larver

Overview

Denne video beskriver to-foton laser ablation af axoner i en Drosophila melanogaster larve og et eksempel protokol til at fremkalde skade og billede skade site.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Li et al.,A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018).

1. To-foton skade og Confocal Imaging

1. Opsætning af mikroskop
   BEMÆRK: Et konfokalt laserscanningsmikroskop med en to-foton laser blev brugt til dette eksperiment, men andre systemer med en tilsvarende opsætning vil også være tilstrækkelige. Den to-foton laser (930 nm) blev brugt til at levere skade og en Argon laser (488 nm) blev brugt til confocal billeddannelse af GFP.
   1. I begyndelsen af hver session skal du tænde for to-fotonlaseren og/eller konfokale lasere og mikroskopet. Åbn billedbehandlingssoftwaren.
   2. For to-foton skade, der er nedsat følgende parametre for billeddannelse GFP med de to-foton laser på 930 nm (1.950 mW).
      1. Vælg linjescanningstilstand. Åbn pinhole hele vejen. Forøg laserintensiteten til ~20% (390 mW).
      2. Vælg 512 x 512 som rammescanning. Brug maksimal scanningshastighed (typisk med pixelboetiden ved 0,77 μs). Sørg for, at det gennemsnitlige antal er 1, og bitdybden er 8 bit.
      3. Indstil gevinst til ~ 750, og forskydningen til 0.
      4. Gem denne forudindstillede eksperimentelle protokol som 2P GFP 930 Ablation, hvilket gør det nemt at genbruge den i fremtidige eksperimenter.
   3. Til confocal imaging skal du konfigurere følgende parametre for billedbehandling af GFP med Argon-laseren ved 488 nm:
      1. Vælg fanen Anskaffelse og derefter Z-stack.
      2. Under "Laser" skal du tænde for strømmen til 488 nm Argon laseren.
      3. Gå til Kanaler, vælg 488 mm laseren, og øg lasereffekten til 5-10%. Til pinhole skal du bruge 1-2 luftig enhed (AU). Juster gevinsten til 650.
      4. I Anskaffelsestilstandskal du vælge 1024 x 1024 som rammescanning, bruge den maksimale scanningshastighed, et gennemsnitligt antal på 2 og bitdybden på 8 bit.
      5. Gem denne forudindstillede eksperimentelle protokol som GFP Imaging.
2. Larver anæstesi med diethyl æter og montering
   1. I en røghætte skal du placere en 60 mm glasskål i en 15 cm plast petriskål. Fold og læg et stykke silkepapir i bunden af glasskålen, og læg derefter en druesaft agarplade på vævet. Tilsæt diethylether i glasfaddet til det punkt, hvor silkepapiret er gennemblødt, og der er et lag flydende æter tilbage i skålen. Hold låget på hele tiden.
   2. Forbered en glasrutsjebane med en dråbe halocarbon 27 olie i midten. Tilsæt 4 pletter vakuumfedt på de fire hjørner af diaset for senere at understøtte coverlipet.
   3. Brug pincet til at afhente en renset larve og læg den på agarpladen i 60 mm glasfad. Dæk glasfaddet med låget og vent, indtil larven holder op med at bevæge sig. For PNS skade / billeddannelse, tegne larven, så snart halen stopper trækninger. For CNS skal du vente, indtil hele larven bliver ubevægelig, især hovedsegmenterne.
      BEMÆRK: Tidspunktet for ætereksponering er kritisk. Se Diskussion.
   4. Tag forsigtigt den bedøvede larve op og placer den med hovedet oprejst i dråben af halocarbonolie på rutsjebanen. Tilføj en coverlip oven på diaset. Brug blidt tryk til at trykke ned på dækslet, indtil det rører larven (Figur 1A).
   5. Juster larvens position ved forsigtigt at skubbe dækslet mod venstre eller højre for at rulle larven, så neuronen/axon/dendrite af interesse er på toppen og tættest på mikroskoplinsen.
   6. For PNS skade, montere larven dorsale side op, således at begge luftrør er synlige. Rul derefter larven ~30 grader til venstre for at skade klasse III da neuron axoner (Figur 1B og 1C), 90 grader for at skade klasse IV da neuron axoner (Figur 1B og 1E), eller ~ 30 grader for at skade klasse IV da neuron dendritter (Figur 2A).
   7. For CNS skade, placere larven til at være helt ventral side op (Figur 3A), således at den region af interesse er tættest på mikroskop linsen i z-plan.
3. Skade ved to-foton laser
   1. Placer rutsjebanen med larven under mikroskopet, og fastgør den på plads med glideholderen på scenen. Brug 10X (0,3 NA) målet at finde larven.
   2. Tilsæt 1 dråbe objektiv olie på coverlip, skift til 40X (1.3 NA) målet og juster fokus.
   3. Skift til scanningstilstand, og genbrug den eksperimentelle protokol 2P GFP 930 Ablation. Sørg for, at pinhole er åbnet hele vejen.
      BEMÆRK: Konfigurationen skal optimeres baseret på individuelle systemer.
   4. Start Live-tilstand for at finde interesseområdet (ROI), og finjuster indstillingerne for at opnå god billedkvalitet med den relevante zoom.
      BEMÆRK: Formålet med dette trin er at finde neuron / axon / dendrite at skade, snarere end at tage den bedste kvalitet billede. Brug derfor de minimale indstillinger, der er tilstrækkelige til at visualisere målområdet, for at undgå overeksponering eller fotobleaching.
   5. Stop Live-scanning, så knappen Beskær bliver tilgængelig. Lad stillbilledet tjene som køreplan. Vælg funktionen Beskær, og juster scanningsvinduet for at fokusere på det mål, der skal komme til skade.
   6. Reducer investeringsafkastet til at være på størrelse med det potentielle skadessted. For eksempel skal du bare dække bredden af en axon eller en dendrite for at sikre skadens præcision og reducere skader på tilstødende væv. Hvis det ønskes, skal du zoome ind på investeringsafkastet, før du beskærer, hvilket giver mulighed for mere præcis skade.
   7. Åbn et nyt billedvindue. Reducer scanningshastigheden, og øg laserintensiteten. Bestem stigningen i laserintensiteten baseret på det vævsfluorescenssignal, der scannes i livetilstand.
   8. Sæt typisk den to-foton laserintensitet fra 25% for PNS-skade og 50-100% for VNC-skade. For PNS axon skade, sikre, at laser intensiteten er ~ 480 mW og pixel ophold tid er 8,19 μs. For VNC axonskaden skal du sikre dig, at laserintensiteten og pixelboet normalt er henholdsvis 965-1930 mW og 8,19-32,77 μs.
   9. Start kontinuerlig scanning. Lad markøren holde markøren over knappen Fortløbende. Hold øje med billedet og stop scanningen, så snart der observeres en drastisk stigning i fluorescens.
      BEMÆRK: Fluorescensspidsens udseende skyldes automatisk fluorescens på skadesstedet.
   10. Skift tilbage til livetilstanden ved at genbruge indstillingerne. Find den region af interesse, der netop var målrettet ved at justere fokus.
       BEMÆRK: En god indikation af vellykket skade er udseendet af et lille krater, ringlignende struktur eller lokaliseret snavs lige ved skadesstedet.
   11. Flyt til den næste neuron og gentag fra trin 1.3.5, for at skade flere neuroner i et enkelt dyr. Eller gentag trin 1.3.5, mens du gradvist øger strømmen og/eller reducerer scanningshastigheden, hvis den første skade var utilstrækkelig.
       BEMÆRK: I tilfælde af, at lasereffekten er for høj, vil et stort beskadiget område være synligt i livescanningsbilledet efter skaden. For meget skade kan forårsage larvens død.
   12. Gendan larven ved forsigtigt at fjerne coverlip og overføre den skadede larve på en ny plade med gærpasta. Grøft flere huler på agarpladen med pincet; Alternativt kan du lave en ø af agar i pladen i stedet for at bruge hele pladen for at reducere muligheden for, at larven kryber ud af pladen.
   13. Pladen anbringes i en 60 mm petriskål med vådt væv (gennemblødt med 0,5% propionsyreopløsning) og kultur ved stuetemperatur eller 25 °C.
       BEMÆRK: Larven forbliver i larvestadiet i ca. en ekstra dag ved stuetemperatur (22 °C) sammenlignet med ved 25 °C.
4. Konfokal billeddannelse efter skaden
   1. Billede den skadede larve på de ønskede tidspunkter ved at forberede larven ved hjælp af samme procedure for anæstesi og montering som i trin 1.2, derefter billeddannelse med confocal laser.
      BEMÆRK: Billede larven på 24 timer efter skade (AI) for at bekræfte axonal skade og ved 48 h AI (klasse IV da neuroner) eller 72 h AI (klasse III da neuroner) for at vurdere regenerering.
   2. Find larven ved hjælp af 10X-målet, og skift derefter til et 25X (0,8 NA) mål. Genbrug den eksperimentelle protokol GFP Imaging.
   3. Klik på Live-knappen og finde den samme neuron såret tidligere.
   4. Indstil den første og sidste Z-position i livescanningsvinduet. Tryk på Stop, og klik på Start eksperiment for at hente et Z-stack-billede.
      BEMÆRK: Sørg for, at et normaliseringspunkt (axonkonvergeringspunktet) medtages, når du tager billeder, så kvantificering af regenerering er mulig (Figur 1D, 1F) – dette diskuteres yderligere i dataanalysesektionen.
   5. Skift til Billedbehandling, vælg det billede, du lige har taget, og generer en maksimal intensitetsprojektion. Gem både z-stack og maksimal intensitet projektion billeder.

Representative Results

Figur 1: Da neuron axon regenerering i periferien viser klasse specificitet. (A og B) Skematisk tegning, der viser larvernes position. (C) Skematisk tegning af klasse III da neuroner. (D) Axoner af klasse III da neuroner ddaF, mærket med 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, undlader at regrow. (E)Skematisk tegning af klasse IV da neuroner. (F) Axoner af klasse IV da neuroner v'ada, mærket med ppk-CD4-tdGFP/+, regrow ud over læsionsstedet. (D og F) Rød linje angiver axonlængden, mens grøn stiplet linje markerer afstanden mellem cellekroppen og det konvergerende axonpunkt (DCAC). Den blå prik markerer axon konvergerende punkt. Skalalinje = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Da neuron dendrite regenerering. (A)Illustrativ repræsentation af klasse IV da neuroner. (B) Illustrativ repræsentation af dendrit regenerering i klasse IV da neuron ddaC, mærket af ppk-CD4-tdGFP/+. Laser ablation er rettet mod den primære gren punkt og udføres på 48 h AEL. Ved 24 timer bekræftes AI-skadestranssektion af neuritten, og ved 72 timer kvantificeres AI-regenerering. Dendritter af ddaC neuroner demonstrere betydelig genvækst, med nye dendritiske grene spirende fra den afskårne stilken til flise den ledige plads. Det er værd at bemærke, at nye terminalgrene løbende føjes til de uskadte dendritter på dette udviklingsstadium. Skalalinje = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Da neuron axon regenerering i VNC. (A) Skematisk tegning af en Drosophila larve monteret på et dias og afbildet under mikroskopet. Klasse IV da neuron axoner i VNC visualiseret i en ppk-CD4tdGFP/+ larve. To kandidat commissure segmenter er vist i zoomet ind billede og skematisk tegning. Hver af dem har to skade steder (røde cirkler). (B) Confocal billeder af en skadet segment afbildet på 8, 24 og 72 timer efter skade (AI). Røde linjer viser de regrowing axoner. (C) Måling og normalisering af genvækstaksler. Skalalinje = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent