Twee-Foton Laser-Geïnduceerde Neurale Verwonding: Een Methode om Axon Degeneratie en Regeneratie in Drosophila Larven te observeren

Overview

Deze video beschrijft twee-foton laser ablatie van axonen in een Drosophila melanogaster larve en een voorbeeld protocol om letsel te induceren en beeld de verwonding site.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Li et al., A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018).

1. Twee-foton Letsel en Confocale Beeldvorming

1. Microscoop setup
   OPMERKING: Voor dit experiment werd een confocale laserscanmicroscoop met een tweefotonenlaser gebruikt, maar ook andere systemen met een gelijkwaardige opstelling zijn voldoende. De twee-foton laser (930 nm) werd gebruikt voor het leveren van letsel en een Argon laser (488 nm) werd gebruikt voor confocale beeldvorming van GFP.
   1. Schakel aan het begin van elke sessie de tweefotonlaser en/of de confocale laser(s) en de microscoop in. Open de beeldvormingssoftware.
   2. Stel voor letsel met twee foton de volgende parameters in voor beeldvorming van GFP met de tweefotonlaser op 930 nm (1.950 mW).
      1. Selecteer lijnscanmodus. Maak het gat helemaal open. Verhoog de laserintensiteit tot ~20% (390 mW).
      2. Selecteer 512 x 512 als framescan. Gebruik maximale scansnelheid (meestal met een pixel dwell-tijd van 0,77 μs). Zorg ervoor dat het gemiddelde getal 1 is en de bitdiepte 8 bits.
      3. Stel versterking in op ~750 en de offset op 0.
      4. Sla dit vooraf ingestelde experimentele protocol op als 2P GFP 930 Ablatie,zodat het gemakkelijk kan worden hergebruikt in toekomstige experimenten.
   3. Stel voor confocale beeldvorming de volgende parameters in voor beeldvorming GFP met de Argon-laser op 488 nm:
      1. Selecteer het tabblad Acquisitie en vervolgens Z-stack.
      2. Schakel onder "Laser" de voeding voor de 488 nm Argon laser in.
      3. Ga naar Kanalen,selecteer de 488 mm laser en verhoog het laservermogen tot 5-10%. Gebruik voor het pinhole de 1-2 luchtige eenheid (AU). Stel de versterking in op 650.
      4. Selecteer in de acquisitiemodus1024 x 1024 als framescan, gebruik de maximale scansnelheid, een gemiddeld aantal van 2 en een bitdiepte van 8 bits.
      5. Sla dit vooraf ingestelde experimentele protocol op als GFP Imaging.
2. Larven anesthesie met diethylether en montage
   1. Plaats in een zuurkast een glazen schaal van 60 mm in een plastic petrischaal van 15 cm. Vouw en leg een stuk tissuepapier op de bodem van de glazen schaal en plaats vervolgens een druivensap agar plaat op het weefsel. Voeg diethylether toe aan de glazen schaal, tot het punt waar het tissuepapier is gedrenkt en er een laag vloeibare ether in de schaal achterblijven. Houd het deksel te allen tijde aan.
   2. Bereid een glazen glijbaan voor met één druppel halocarbon 27 olie in het midden. Voeg 4 plekken vacuümvet toe aan de vier hoeken van de glijbaan, om later de afdeklip te ondersteunen.
   3. Gebruik een tang om een gereinigde larve op te pakken en op de agarplaat in de glazen schaal van 60 mm te plaatsen. Bedek de glazen schaal met het deksel en wacht tot de larve stopt met bewegen. Voor PNS-letsel/beeldvorming, schakel de larve uit zodra zijn staart stopt met trillen. Wacht voor het CZS tot de hele larve onbeweeglijk wordt, vooral de kopsegmenten.
      OPMERKING: De timing van de blootstelling aan ether is van cruciaal belang. Zie Discussie.
   4. Pak voorzichtig de verdoofde larve op en plaats deze rechtop in de druppel halokoolstofolie op de glijbaan. Voeg een coverslip toe bovenop de dia. Gebruik zachte druk om op de afdeklip te drukken, totdat deze de larve raakt (figuur 1A).
   5. Pas de positie van de larve aan door de deklip voorzichtig naar links of rechts te duwen om de larve te rollen, zodat het neuron / axon / dendriet van belang zich bovenaan en het dichtst bij de microscooplens bevindt.
   6. Voor PNS-letsel monteert u de dorsale kant van de larve naar boven, zodat beide luchtpijpen zichtbaar zijn. Rol vervolgens de larve ~ 30 graden naar links voor het verwonden van klasse III da neuron axonen(figuur 1B en 1C),90 graden voor het verwonden van klasse IV da neuron axonen(figuur 1B en 1E),of ~ 30 graden voor het verwonden van klasse IV da neuron dendrieten ( figuur2A).
   7. Voor CZS-letsel plaatst u de larve perfect ventrale kant naar boven(figuur 3A),zodat het interessegebied zich het dichtst bij de microscooplens in het z-vlak bevindt.
3. Letsel door twee-foton laser
   1. Plaats de glijbaan met de larve onder de microscoop en zet deze vast met de schuifhouder op het podium. Gebruik de 10X (0.3 NA) doelstelling om de larve te vinden.
   2. Voeg 1 druppel objectieve olie toe aan de afdeklip, schakel over naar de 40X (1.3 NA) doelstelling en pas de scherpstelling aan.
   3. Schakel over naar de scanmodus en hergebruik het experimentele protocol 2P GFP 930 Ablatie. Zorg ervoor dat het pinhole helemaal geopend is.
      OPMERKING: De configuratie moet worden geoptimaliseerd op basis van individuele systemen.
   4. Start de livemodus om de regio van belang (ROI) te lokaliseren en verfijn de instellingen om een goede beeldkwaliteit te bereiken met de juiste zoom.
      OPMERKING: Het doel van deze stap is om het neuron / axon / dendriet te vinden om te verwonden, in plaats van het beeld van de beste kwaliteit te nemen. Gebruik daarom de minimale instellingen die voldoende zijn om het doelgebied te visualiseren, om overbelichting of fotobleaching te voorkomen.
   5. Stop live scannen, zodat de knop Bijsnijden beschikbaar komt. Laat het stilstaande beeld dienen als roadmap. Selecteer de functie Bijsnijden en pas het scanvenster aan om scherp te stellen op het te verwonden doel.
   6. Verminder de ROI tot de grootte van de potentiële plaats van letsel. Bedek bijvoorbeeld gewoon de breedte van een axon of een dendriet, om de precisie van het letsel te garanderen en schade aan naburige weefsels te verminderen. Zoom indien gewenst in op de ROI voordat u bijsnijdt, zodat u nauwkeuriger letsel kunt veroorzaken.
   7. Open een nieuw beeldvenster. Verlaag de scansnelheid en verhoog de laserintensiteit. Bepaal de toename van de laserintensiteit op basis van het weefselfluorescentiesignaal dat in de livemodus is gescand.
   8. Stel meestal de laserintensiteit met twee fotonen in vanaf 25% voor PNS-letsel en 50-100% voor VNC-letsel. Voor PNS axon letsel, zorg ervoor dat de laserintensiteit ~480 mW is en de pixel verblijftijd 8,19 μs is. Voor de VNC axon letsel, zorg ervoor dat de laser intensiteit en pixel verblijftijd zijn meestal 965-1930 mW en 8.19-32.77 μs, respectievelijk.
   9. Continue scan starten. Laat de cursor over de knop Continu zweven. Houd het beeld goed in de gaten en stop de scan zodra een drastische toename van fluorescentie wordt waargenomen.
      OPMERKING: Het uiterlijk van de fluorescentiepiek is te wijten aan autofluorescentie op de verwondingsplaats.
   10. Schakel terug naar de livemodus door de instellingen opnieuw te gebruiken. Zoek de regio van belang die net het doelwit was door de focus aan te passen.
       OPMERKING: Een goede indicatie van succesvol letsel is het verschijnen van een kleine krater, ringachtige structuur of gelokaliseerd puin direct op de plaats van de verwonding.
   11. Ga naar het volgende neuron en herhaal vanaf stap 1.3.5, om meerdere neuronen in één dier te verwonden. Of herhaal stap 1.3.5 terwijl u het vermogen geleidelijk verhoogt en/of de scansnelheid verlaagt als het aanvankelijke letsel onvoldoende was.
       OPMERKING: In het geval dat het laservermogen te hoog is, zal een groot beschadigd gebied zichtbaar zijn in het live scanbeeld na het letsel. Te veel letsel kan de dood van de larve veroorzaken.
   12. Herstel de larve door de afdeklip voorzichtig te verwijderen en de gewonde larve over te brengen op een nieuwe plaat met gistpasta. Sloot verschillende grotten op de agarplaat met tang; u kunt ook een eiland van agar in de plaat maken in plaats van de hele plaat te gebruiken, om de kans te verkleinen dat de larve uit de plaat kruipt.
   13. Doe de plaat in een petrischaal van 60 mm met nat weefsel (gedrenkt in 0,5% propionzuuroplossing) en kweek bij kamertemperatuur of 25 °C.
       OPMERKING: De larve blijft ongeveer een extra dag in het larvale stadium bij kamertemperatuur (22 °C) in vergelijking met bij 25 °C.
4. Confocale beeldvorming na letsel
   1. Beeld de gewonde larve op de gewenste tijdstippen in door de larve voor te bereiden met dezelfde procedure van anesthesie en montage als in stap 1.2 en vervolgens beeldvorming met de confocale laser.
      OPMERKING: Beeld de larve in om 24 uur na verwonding (AI) om axonale verwonding te bevestigen en bij 48 uur AI (klasse IV da neuronen) of 72 uur AI (klasse III da neuronen) om regeneratie te beoordelen.
   2. Lokaliseer de larve met behulp van de 10X-doelstelling en schakel vervolgens over naar een 25X (0,8 NA) doelstelling. Hergebruik het experimentele protocol GFP Imaging.
   3. Klik op de live-knop en vind hetzelfde neuron dat eerder gewond is geraakt.
   4. Stel de eerste en laatste Z-posities in het live scanvenster in. Druk op stop en klik op Experiment starten om een Z-stack afbeelding te verkrijgen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat bij het vastleggen van beelden een normalisatiepunt (het axon convergerende punt) wordt opgenomen, zodat kwantificering van regeneratie mogelijk is (figuur 1D, 1F) – dit wordt verder besproken in de sectie gegevensanalyse.
   5. Schakel over naar Beeldverwerking,selecteer de zojuist genomen afbeelding en genereer een projectie met maximale intensiteit. Sla zowel de z-stack als de projectiebeelden met maximale intensiteit op.

Representative Results

Figuur 1: Da neuron axon regeneratie in de periferie geeft klasse specificiteit weer. (A en B) Schematische tekening met de positie van de larven. (C) Schematische tekening van klasse III da neuronen. (D) Axonen van de klasse III da neuronen ddaF, gelabeld met 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, groeien niet opnieuw. (E) Schematische tekening van klasse IV da neuronen. (F) Axonen van de klasse IV da neuronen v'ada, gelabeld met ppk-CD4-tdGFP/+, hergroeien voorbij de laesieplaats. (D en F) Rode lijn geeft de axonlengte aan, terwijl de groene stippellijn de afstand markeert tussen het cellichaam en het axonconverging point (DCAC). De blauwe stip markeert het axon convergerende punt. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Da neuron dendriet regeneratie. (A) Illustratieve weergave van klasse IV da neuronen. (B) Illustratieve weergave van dendrietregeneratie in klasse IV da neuron ddaC, gelabeld door ppk-CD4-tdGFP/+. Laserablatie is gericht op het primaire takpunt en wordt uitgevoerd om 48 uur AEL. Bij 24 uur ai letsel transsectie van de neuriet wordt bevestigd, en bij 72 uur AI regeneratie wordt gekwantificeerd. Dendrieten van ddaC-neuronen vertonen een aanzienlijke hergroei, met nieuwe dendritische takken die uit de afgehakte stengel ontspruiten om de lege ruimte te betegelen. Het is vermeldensgetrouw dat er in deze ontwikkelingsfase voortdurend nieuwe terminale takken worden toegevoegd aan de niet-gewonde dendrieten. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Da neuron axon regeneratie in de VNC. (A) Schematische tekening van een Drosophila larve gemonteerd op een dia en afgebeeld onder de microscoop. Klasse IV da neuron axonen in de VNC gevisualiseerd in een ppk-CD4tdGFP/+ larve. In de ingezoomde afbeelding en de schematische tekening worden twee kandidaatcommissarissegmenten weergegeven. Elk van hen heeft twee verwondingsplaatsen (rode cirkels). (B) Confocale beelden van één gewond segment afgebeeld om 8, 24 en 72 uur na letsel (AI). Rode lijnen verbeelden de hergroeiende axonen. (C) Meting en normalisatie van hergroeiende axonen. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent