Dissociation unicellulaire de Caenorhabditis elegans : une méthode pour isoler des cellules vivantes

- Commencez avec des vers granulés lavés et ajoutez un tampon de lyse contenant du SDS, un détergent, et du DTT, un agent réducteur. Cela décompose la cuticule protectrice du ver, exposant le corps à la dissociation cellulaire. Évitez l’exposition prolongée au tampon de lyse pour minimiser la lyse et la mort cellulaires.

Ensuite, retirez les réactifs de lyse avec plusieurs lavages de tampon d’isolement à froid. Il est important que ce tampon ait la bonne osmolarité pour prévenir la mort cellulaire. Utilisez une enzyme protéase pour briser les connexions entre les cellules. Aidez le processus d’homogénéisation avec l’énergie mécanique en pipetant le mélange contre la paroi du tube.

Ajoutez un milieu contenant du sérum pour arrêter la réaction enzymatique et des antibiotiques pour prévenir la contamination. Granulez et lavez l’échantillon plusieurs fois pour enlever la plupart des débris.

Enfin, placez le tube sur de la glace pour permettre la sédimentation par gravité. Les débris, y compris les restes de la cuticule ou les amas cellulaires, se déposeront, tandis que les cellules dissociées resteront en suspension dans la couche supérieure du support. Ces cellules peuvent être utilisées pour la culture à court terme ou pour isoler des populations cellulaires spécifiques par FACS ou immunoprécipitation.

Dans l’exemple de protocole, nous dissocierons des vers transgéniques exprimant la GFP dans les neurones d’intérêt pour isoler et analyser ces cellules.

- Après avoir recueilli les animaux, centrifugez-les à 1 600 fois g pendant cinq minutes. Retirez tout le surnageant et remettez les vers en suspension dans 1 millilitre de milieu M9. Transférez la suspension dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Centrifugez à 1 600 fois g pendant cinq minutes pour granuler les vers. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon SDS-DDT et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Les vers devraient maintenant sembler être ridés le long du corps s’ils sont observés au microscope optique.

Ensuite, ajoutez 800 microlitres de tampon d’isolation glacé et mélangez en effleurant doucement le tube. Centrifuger à 13 000 fois g et à 4 degrés Celsius pendant une minute pour granuler les vers. Retirez le surnageant et lavez-le avec 1 millilitre de tampon d’isolement.

Répétez ce processus de centrifugation et de lavage cinq fois au total, en veillant à retirer soigneusement le tampon d’isolement à chaque fois. Après cela, ajoutez 100 microlitres de mélange de protéase de Streptomyces griseus dissous dans un tampon d’isolement, à la pastille.

Incuber à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Assurez-vous d’appliquer une perturbation mécanique en pipetant de haut en bas 60 à 70 fois avec la pointe de la micropipette de 200 microlitres contre le fond du tube. Pour déterminer l’étape de la digestion, prélevez 1 à 5 microlitres du mélange de digestion, déposez-le sur une lame de verre et inspectez-le à l’aide d’un microscope de culture tissulaire.

Après cinq à sept minutes, les fragments de vers devraient avoir une cuticule visiblement réduite et une bouillie de cellules sera facilement visible. Arrêtez la réaction en ajoutant 900 microlitres de milieu L15 de Leibovitz disponible dans le commerce, complété par 10 % de FBS et de pénicilline-streptomycine.

Centrifuger à 10 000 fois g et à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes pour granuler des fragments isolés et des cellules. Lavez les cellules granulées deux fois de plus avec un média froid supplémenté en L15 en utilisant 1 millilitre de média par lavage. Remettre les cellules granulées en suspension dans 1 millilitre de milieu supplémenté en L15 et laisser reposer sur de la glace pendant 30 minutes.

Ensuite, prenez la couche supérieure, qui est d’environ 700 à 800 microlitres, et transférez-la dans un tube de microcentrifugation. À l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre, vous pouvez mesurer la densité cellulaire de 10 à 25 microlitres de cellules isolées.