פרוטוקול זה מדגים שיטות להקים סביבות 2 ד ו 3D ב אישית מעוצבת חדרי electrotactic, אשר יכולים לעקוב אחר תאים<em> In vivo / לשעבר vivo</em> באמצעות זמן לשגות הקלטה ברמת תא בודד, על מנת לחקור galvanotaxis / electrotaxis ותגובות סלולריים אחרים לכוון הנוכחי (DC) שדות חשמליים (EPS).
שדות חשמליים אנדוגני (EPS) להתרחש באופן טבעי in vivo ו לשחק תפקיד קריטי במהלך התפתחות רקמות / איברים והתחדשות, כולל זה של 1,2 מערכת העצבים המרכזית. EFS אנדוגניים אלו מופקים על ידי רגולציה הסלולר התחבורה יונית בשילוב עם ההתנגדות החשמלית של תאים ורקמות. זה כבר דווח כי אפלייד EF הטיפול יכול לקדם תיקון התפקודי של פגיעות בעמוד השדרה אצל בעלי חיים ובני אדם 3,4. בפרט, EF מכוונת נדידת תאים הודגמה במגוון רחב של סוגי תאים 5,6, כולל ובתאים עצביים (NPCs) 7,8. יישום ישיר (DC) EFS הנוכחי אינו טכניקה זמין בדרך כלל ברוב המעבדות. תיארנו פרוטוקולים מפורטים עבור היישום של EFS DC ל תאים בתרביות רקמה בעבר 5,11. כאן אנו מציגים הפגנה וידאו של שיטות סטנדרטיות מבוסס על כוח שדה מחושב להקים 2Dד סביבות 3D עבור NPCs, ולחקור התגובות הסלולר לגירוי EF בצמיחה בשני תנאים בודדים תא 2 ד, ו פרוסה organotypic חוט השדרה ב-3D. Cordslice השדרה הוא רקמה הנמען האידיאלי ללימוד NPC לשעבר ב vivo התנהגויות, לאחר השתלה, כי הארגון רקמות cytoarchitectonic נשמר גם בתוך התרבויות הללו 9,10. בנוסף, מודל זה vivo לשעבר גם מאפשר הליכים כי הם לא ריאלי מבחינה טכנית לעקוב אחר תאים in vivo באמצעות זמן לשגות הקלטה ברמת תא בודד. חשוב באופן קריטי על מנת להעריך התנהגויות סלולריים בסביבה לא רק 2D, אלא גם במצב organotypic 3D אשר mimicks בסביבה vivo. מערכת זו תאפשר ברזולוציה גבוהה הדמיה באמצעות זכוכית המבוססים על מאכלים כיסוי ברקמות או איברים עם התרבות מעקב 3D של נדידת תאים אחת במבחנה לשעבר vivo והוא יכול להיות שלב ביניים לפני שעבר אל ב vivo פרדיגמות.
הפרוטוקולים בהם אנו משתמשים מתבססים על מחקרים קודמים 5,11. התנאים הנוכחיים באמצעות שיטות אלה, תרבות יציבה חשמלי יכול להישמר תוך יישום EF באמצעות גשרים אגר, הפתרון של שטיינברג, ו Ag / AgCl, אלקטרודות לתאי או פרוסות בתרבית תאים electrotactic אישית מעוצבת של ממדים סטנדרטיים ומ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי החברה המלכותית URF מענק UF051616, בריטניה המועצה האירופית למחקר STG מענק 243,261 ל BS. עבודה ב MZ המעבדה נתמך גם על ידי המכון לרפואה של קליפורניה הרגנרציה מענק RB1-01417.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | B.D. Biosciences | 354230 | |
HEPES buffer | Gibco | 15630 | |
McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |