Summary
Citomegalovirus (HCMV), l'infezione umana di neonati rappresenta una importante causa di ritardo mentale, ma gli eventi molecolari che portano alla indotta da virus patogenesi sono ancora poco conosciuti. Per indagare le dinamiche di infezione del cervello, abbiamo adattato tutta-animale
Abstract
Citomegalovirus umano (HCMV o HHV-5) è un agente patogeno mortale in individui immunocompromessi. Su infezione congenita o neonatale, il virus può infettare e replicarsi nel cervello in via di sviluppo, che può indurre gravi danni neurologici, tra cui sordità e ritardo mentale. Nonostante il potenziale gravità dei sintomi, le opzioni terapeutiche sono limitate dalla mancanza di un vaccino e l'assenza di una specifica terapia antivirale. Inoltre, una descrizione precisa degli eventi molecolari che si verificano durante l'infezione del sistema nervoso centrale (SNC) è ancora carente dal osservazioni principalmente derivano dalla autopsia dei bambini infetti. Diversi modelli animali, come macaco rhesus CMV, sono stati sviluppati e importanti conoscenze CMV patogenesi nel SNC. Tuttavia, nonostante la vicinanza evolutiva con gli esseri umani, questo modello è stata limitata dalla procedura di inoculazione intracranica usato per infettare gli animali e controistently indurre infezione del SNC. Inoltre, considerazioni etiche hanno promosso lo sviluppo di modelli alternativi, tra i quali l'infezione neonatale di topi appena nati con citomegalovirus topo (MCMV) ha recentemente portato a significativi progressi. Ad esempio, è stato segnalato che l'iniezione intraperitoneale di MCMV a Balb / c neonati porta all'infezione di neuroni e cellule gliali in aree specifiche del cervello. Questi risultati suggeriscono che l'inoculazione sperimentale di topi potrebbe ricapitolare i deficit indotti da HCMV nei bambini. Tuttavia, un'analisi dinamica di MCMV infezione di neonati è di difficile esecuzione a causa classica metodologia richiede il sacrificio di un numero significativo di animali a differenti tempi di analizzare il carico virale e / o parametri immuno-correlati. Per aggirare questo ostacolo e permettere future indagini di animali mutanti rari, abbiamo applicato nella tecnologia di imaging in vivo per eseguire analisi in tempo-corso della viral disseminazione nel cervello a seguito di iniezione periferica di un MCMV ricombinante esprimente luciferasi di C57BL / 6 neonati.
Introduction
Citomegalovirus umano (HCMV/HHV-5) è un membro della famiglia di β-herpesvirus. HCMV è altamente prevalente, patogeno opportunista che di solito è acquisito durante primi anni di vita come un'infezione asintomatica 1. Come tutti i virus erpetici, HCMV persiste per tutta la vita dell'ospite cui sistema immunitario strettamente controlla la replicazione virale. Gli episodi di riattivazione virale per lo più si verificano in individui immunocompromessi, come i pazienti di trapianto che assumono farmaci per prevenire il rigetto del trapianto 2. Negli adulti, HCMV è anche stato collegato a glioblastomi 3. Inoltre, HCMV è un patogeno importante per i neonati con immunità immaturo 4-6. L'infezione primaria nello sviluppo del feto o il neonato, può avere gravi conseguenze. HCMV infezione è la causa infettiva più comune di difetti congeniti alla nascita e disturbi infantili nei paesi sviluppati. Si stima che l'incidenza di infezione da HCMV neonatale colpisce 0,5-1% of tutti i nati vivi tra i quali il 5-10% soffrirà di sintomi gravi, come la microcefalia o ipoplasia cerebellare. Inoltre, il 10% dei neonati con infezione virale subclinica sarà poi sviluppare sequele che porta a ritardo mentale, perdita, difetti visivi o il sequestro e l'epilessia 7,8 dell'udito.
Al contrario di altri herpesvirus umani come l'herpes simplex 1 (HSV-1/HHV-1) che possono essere inoculati nei topi attraverso diverse vie di iniezione 9, la replica citomegalovirus è specie specifico. Questa caratteristica ha gravemente ostacolato le indagini di HCMV patogenesi che vengono eseguite in diversi modelli animali (topo, ratto, cavia, scimmia rhesus) e le rispettive genuini CMVs ospite-specifici. Tutti CMVs presentano somiglianze significative dimensioni del genoma e organizzazione, tropismo tissutale e regolazione dell'espressione genica. Hanno anche indurre patologie simili nei loro rispettivi host. Nonostante la diversità genomica esseretween HCMV e mouse citomegalovirus (MCMV) (50% delle ORF presenti nel virus umano sono identificati nella murino CMV), il modello di topo ha recentemente dimostrato di essere vantaggioso, soprattutto perché ceppi mutanti possono essere testati per la loro capacità di controllare virale replicazione in vivo. Ciò ha portato ad una schermata genetico che ha consentito una stima del numero di geni di topo espresso allo stadio adulto che compongono il "resistome" per questo virus 10. Complessivamente, questo indica che i topi MCMV infettati rappresentano un interessante modello per lo studio delle interazioni ospite-virus negli adulti. L'esplorazione di infezione congenita da CMV è più complessa, perché le differenze di organizzazione strato placentare tra umani e topi compromettono la trasmissione materno-fetale dell'infezione virale nei topi. Recentemente, l'iniezione diretta di MCMV nella placenta il giorno 12.5 di gestazione ha permesso infezione del cervello di topi neonati che hanno portato alla compromissione dell'udito 11. Tuttavia, la maggior investigations ora usano l'iniezione intraperitoneale di 4-20 hr-vecchi neonati di fornire disseminazione sistemica virale che porta a infezione del cervello ematogena, un modello che è più rilevante di quella di una iniezione intracranica. Questo protocollo importanti conoscenze CMV patogenesi e più in particolare, è stato dimostrato che MCMV infezione di neonati risultati nella replicazione virale in cellule neuronali e gliali situate in focolai infiammatori che vengono infiltrati di cellule mononucleate come macrofagi 12. Questo rapporto descrive anche morfogenesi alterata del cervelletto accompagnato con diminuita proliferazione dei neuroni granulari e la migrazione e l'induzione di geni multipli interferone-stimolati. Il ruolo essenziale delle + cellule T CD8 per il controllo di MCMV nel sistema nervoso centrale è stato anche riportato dallo stesso gruppo 13. Un aspetto importante da considerare quando si analizza l'effetto patologica di un microbo è la dinamica del infettareione. Nel caso di MCMV, è particolarmente importante per esplorare e quantificare la progressione di diffusione virale nel cervello di sviluppo al fine di comprendere e anticipare la grandezza delle future lesioni neurobiologiche. Tradizionalmente, la quantificazione della progressione di un'infezione richiede il sacrificio regolare di animali infetti a titolo patogeno nei tessuti, come il cervello, che sono altrimenti inaccessibili. Questo tipo di protocollo viene ora contestata da necessario miglioramento del benessere degli animali e le 3R (ridurre, perfezionare, Replace) principi 14. Utilizzando tecnologie in vivo imaging può consentire una drastica riduzione del numero di animali che sono necessari in esperimenti di infezione in vivo. Qui, segnaliamo e descriviamo una analisi tempo-corso di diffusione virale nel cervello su intraperitoneale MCMV-Luc iniezione per neonati mouse. Utilizzando gli stessi animali, abbiamo seguito e monitorato in vivo i luoghi di intensa VIreplica ral durante un periodo di 2 settimane.
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Protocol
1. Preparazione della sospensione virale
- Ottenere il ceppo Smith di MCMV esprimere luciferasi (MCMV-Luc 15) dal laboratorio di Ulrich Koszninowski. In questo ricombinante, il gene della luciferasi è inserito nel locus IE2 del genoma MCMV.
- Per amplificare MCMV-Luc, infettare un midollo linea di cellule stromali osseo murino (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) con MCMV a diversa molteplicità di infezione (MOI, 0,001-1) 16. Per questo, aggiungere virus di cellule coltivate in mezzo privo di siero a 37 ° C. Dopo un'ora, rimuovere il supernatante e sostituirlo con DMEM supplementato con 10% siero fetale di vitello (FCS). Cinque giorni dopo, raccogliere il terreno di coltura e di conservare delle aliquote a -80 ° C fino a nuovo uso.
- Titolazione della sospensione virale mediante test placca.
- Dividere 3T3 (ATCC # CRL-1658) in una piastra a 24 a 40.000 cellule / pozzetto in 1 ml di DMEM supplementato con 10% FCS contenente penicillina (200 UI / ml) e steptomycin (200 mg / ml) E incubare 24 ore a 37 ° C.
- Preparare diluizioni seriali (10 -1 a 10 -8) di una aliquota di MCMV sospensione in DMEM e infettare cellule bersaglio (3T3) con 200 ml di diluizione dopo rimuovere coltura cellulare. Incubare per 1 ora a 37 ° C. Aggiungere 1 ml di Top Medium (DMEM 3% FCS, 2% (v / v) gentamicina, 200 IU / ml di penicillina, 200 mg / ml streptomicina, 8 g / L Carbossimetilcellulosa) e incubare 5 giorni a 37 ° C.
- Fissare le cellule aggiungendo 200 microlitri 10% di formaldeide (diluizione della formaldeide con acqua dovrebbe essere fatto in una cappa chimica per evitare inalazioni tossiche) in ciascun pozzetto e incubando 6 ore a temperatura ambiente. Togliere terreno di coltura + fissatore pipettando fuori e aggiungere 200 kit di colorazione delle cellule microlitri (1% di cristallo viola (w / v) in etanolo al 20%). Prima dell'uso, diluire 1 parte con 9 parti di acqua Milli-Q. Incubare 2 minuti a temperatura ambiente, lavare la piastra 3-4x immergendola in acqua, lasciate asciugare e contare il numero di placche con un binocolo.
<li> Diluire MCMV-Luc in DMEM per ottenere 50 PFUs in 50 microlitri e lasciare in ghiaccio fino a nuovo uso. Utilizzando inoculums virali più elevate induce letalità prima che i neonati raggiungano 2-3 settimane di età. Nella nostra esperienza, 500 PFUs causato mortalità nel neonato ogni 5 a 7 giorni dopo l'iniezione.
2. Iniezione di neonati
- Quando i neonati (4-20 hr-topi) sono disponibili, manipolare la lettiera e le feci della gabbia con i guanti prima di maneggiare con cura i cuccioli per evitare la contaminazione con gli odori "estranei" che sottolineare la madre e indurre il rigetto dei cuccioli .
- Eseguire un'iniezione intraperitoneale utilizzando una siringa da insulina (29 G) come mostrato nella Figura 1A. Tenere il neonato con la pelle dorsale. Con il lato ventrale, introdurre l'ago sotto la zampa anteriore e spingere delicatamente per via sottocutanea per raggiungere la cavità peritoneale (un po 'sotto l'ombelico). Al momento Iniettare 1% Blu di metilene diluito in DPBS e monitoriamo la sopravvivenza di practice la tecnica prima di eseguire le infezioni virali. Dal blu di metilene è chiaramente visibile durante il processo di iniezione, si consiglia di eseguire questa iniezione di "allenamento" prima di garantire un'adeguata distribuzione della sospensione virale nella cavità intraperitoneale.
- Eliminare le gocce di sangue molto piccoli che possono sorgere e posizionare il nuovo neonato nella gabbia.
3. Imaging in vivo
- Il giorno 7, di gestire i neonati con la stessa cautele come accennato in precedenza. Iniettare per via intraperitoneale una miscela di anestetici (4 mg / ml di ketamina, 0,8 mg / ml xilazina) e luciferina (0,15 mg / g di peso corporeo) in 50 microlitri in ciascun animale. Peso medio corporeo degli animali è di 1-2 g e la dose di anestetici per animale è: ketamina 40 mcg, xylazina 8 mcg Attendere 12-15 minuti fino a quando luciferina raggiunge il suo massimo di emissione. Questo deve essere determinato in anticipo e dipende dal provider luciferina e il sistema di imaging utilizzato.
- Mentre i cuccioli sono anesthetized, le tag per l'identificazione futuro e raccogliere un piccolo pezzo di tessuto che può quindi essere utilizzato per future genotipizzazione se si utilizzano animali mutanti.
- Collocare i cuccioli nel sistema di imaging ed eseguire acquisizione della luce emessa dal corpo intero. Sette giorni dopo l'infezione, il virus si è replicato in numerose copie negli organi bersaglio come fegato, reni, polmoni e delle ghiandole salivari, pertanto, la durata dell'esposizione dovrebbe essere breve. Nel nostro caso, eseguiamo l'acquisizione per 10 a 20 secondi (Figura 1B). La piattaforma nella camera di acquisizione del dispositivo di imaging deve essere riscaldato per evitare un eccessivo raffreddamento della temperatura corporea degli animali anestetizzati. Inoltre, è utile per ottenere immagini a bassa risoluzione di vari animali all'interno di un ciclo di acquisizione e poi, risalire la piattaforma più vicino alla lente della fotocamera in modo da concentrarsi su una parte di un particolare animale o di un organo isolato dopo la dissezione. Il software deve consentire rapidi cambiamentidei parametri (tempo di esposizione, distanza campione / obiettivo, sensibilità), la quantificazione di regioni definite di interesse e il futuro di esportazione di immagini istantanee.
- Per acquisire segnale luminoso da solo la testa, coprire il corpo dei neonati sdraiato lateralmente con una spessa, carta scura che maschera i fotoni emessi al livello degli organi dove avviene la replicazione virale elevata (fegato, polmoni, ghiandole salivari) ed effettuare acquisizione di 5 a 10 min (Figura 1C). Eseguire acquisizione del lato opposto dell'animale nelle stesse condizioni.
- Reintrodurre i cuccioli nella gabbia e posizionare una lampada riscaldante in alto per evitare un eccessivo raffreddamento dei neonati anestetizzati. Monitorare regolarmente il recupero post-anestetico. Con la dose indicata, anestesia attualmente dura 30 min.
- Ripetere la stessa procedura nei giorni 9, 11 e 14. Nei giorni 11 e 14, modificare la dose di anestetici (6 mg / ml di ketamina, 1,2 mg / ml xylazina).
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Representative Results
Un esperimento rappresentativo è illustrato in Figura 1. A seguito di iniezione intraperitoneale di 50 PFUs di MCMV-Luc (Pannello A mostra una iniezione simile esercitata con blu di metilene di visualizzare via sottocutanea dell'ago), neonati sono stati anestetizzati e ricevuti simultaneamente 0,3 mg del substrato di luciferasi (Luciferin, compasso). Quindici minuti dopo, gli animali sono stati posti lato ventrale nella camera di acquisizione del IVIS 50 (In Vivo Imaging System, calibro) e la luce emessa dal intero animale è stato catturato durante una esposizione 10 sec. Pannello B mostra le immagini delle istantanee scattate nei giorni 7, 9, 11 e 14 con il software (Living Immagine 3.2, Pinza), dedicato per l'analisi. Le immagini sono state calibrate con le stesse impostazioni: Max emissione è fissato a 10 7 fotoni al secondo (p / s) e 10 min a 6 p / sec. Da queste immagini, sembra che il titolo virale complessiva nell'intera animale diminuisce nel tempo. Quantificazione dei la luminescenza eseguita con lo stesso software conferma questa osservazione (non mostrato). Successivamente, abbiamo coperto tutto il corpo, tranne la testa, dell'animale con una spessa carta scura che impedisce i fotoni emessi da organi come polmoni, fegato, reni e le ghiandole salivari per essere rilevati dalla fotocamera digitale. Ciò consente di esposizione più lungo (5 min nel nostro caso) e rivela una macchia discreta a livello dell'orecchio sinistro cui intensità aumenta tra il giorno 7 e il giorno 14 (pannello C). Un segnale appare anche nella mandibola e il naso dell'animale. Le immagini sono state impostate con un massimo a 2.000 p / sec e min a 100 p / sec. Questo esperimento, eseguito lo stesso animale tra il giorno 0 e al giorno 14, indica che l'evoluzione della infezione virale può essere registrato e quantificato con questa tecnologia e che la diffusione di MCMV al cervello può essere osservato dinamicamente in vivo.
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Figura 1. Analisi tempo-corso di un neonato rappresentante del mouse infettati sperimentalmente con un citomegalovirus luminescente. A. intraperitoneale metilene iniezione blu nei neonati. L'immagine ingrandita (a destra) mostra il percorso di iniezione sottocutanea sul torace. B. imaging in vivo dello stesso neonato dal giorno 7 al giorno 14 dopo l'iniezione MCMV-Luc. Luminescenza da tutto l'animale anestetizzato è visualizzato su di luciferina iniezione e 10 secondi di esposizione. C. luminescenza emessa dalla testa (lato sinistro) dello stesso animale a 7 a 14 giorni. Tempra i fotoni dal resto del corpo con una carta scura abilita esposizione più lungo (5 min).
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Discussion
Utilizzando la tecnologia di imaging in vivo per monitorare MCMV-Luc diffusione in topi neonati, siamo stati in grado di osservare la diffusione virale nel cervello di animali mutanti, al contrario di wild-type. Ulteriore dissezione dell'animale e di imaging ex vivo del cervello ha confermato la presenza del virus luminescente nel sistema nervoso centrale. Inoltre, abbiamo anche effettuato immunoistochimica (non mostrato) su sezioni sottili cerebrali con un anticorpo specifico per la proteina precoce MCMV E1 e osservato che in effetti, MCMV è presente nelle stesse aree come quelle in cui è stato rilevato luminescenza, indicando così che la visualizzazione macroscopica la luce emessa da interi, animali anestetizzati vivi realtà riflette le caratteristiche di infezione virale che si verifica in vivo.
Tale analisi è stata ampiamente usata per animali adulti, per esempio per controllare la crescita del tumore dopo l'impianto delle cellule luminescenti. Nel nostro caso, la sfida era quella di utilizzare NeonaTES per i quali l'anestesia gassosa con isoflurano consegnato l'animale all'interno della camera di acquisizione non è stato possibile per motivi tecnici. Pertanto, siamo stati costretti ad utilizzare l'iniezione di ketamina / xylazina e abbiamo adattato la dose per le piccole dimensioni delle neonati. Abbiamo anche maneggiati con cura i cuccioli per evitare il rischio di rigetto da parte della madre. Seguendo le raccomandazioni e le dosi descritte qui, e che sono fondamentali per la manipolazione sicura e l'esito dei cuccioli, l'anestesia dei neonati diventa una valida opzione alternativa che consente lunghi periodi di immobilità necessarie per eseguire l'imaging in vivo.
Inoltre, poiché il livello di luminescenza può essere quantificato con il software appropriato, abbiamo dimostrato che la progressione dell'infezione durante un periodo di 2 settimane è caratterizzato da un carico virale diminuita negli organi peritoneali (fegato, milza, reni) ed i polmoni, mentre la diffusione del virus nel cervello può progressivamente essere evidenziato. Thè l'osservazione, che potrebbe essere notato in animali mutanti e non nei controlli, sarà documentata con maggiori dettagli e un analisi statistica in un manoscritto in preparazione, dove si discuterà anche della natura del gene mutato. Tuttavia, il nostro metodo di imaging rappresenta un notevole miglioramento rispetto alle tecniche classiche che richiede l'eutanasia di più animali per ogni punto di tempo, seguito da metodi di tempo e di risorse che consumano (saggio di placca o PCR quantitativa) per misurare titoli virali in omogenati preparati con diverso organi ai dissezione. Ciò è anche in linea con i principi etici che regolano la sperimentazione animale, che richiedono uno sforzo costante per ridurre al minimo i numeri sufficienti per raggiungere la significatività statistica. Infine, un altro vantaggio di seguire lo stesso animale (targhetta al giorno 7) durante l'intera durata dell'esperimento è ridurre inter-variazioni individuali. Come risultato, quantificazione effettuata ad ogni punto temporale (giorni 7, 9, 11 e 14) perfOrmed su un gruppo di sei neonati migliora notevolmente la significatività statistica dei risultati (dati non mostrati).
Al momento stiamo utilizzando questa metodologia per analizzare l'impatto di mutazioni nei topi sulla diffusione di MCMV e un manoscritto attualmente in rapporti di preparazione aumentata diffusione virale nel cervello di animali mutanti. La nostra esperienza indica che a confronto un gruppo di 5-6 mutanti a un gruppo equivalente di neonati di controllo fornisce dati di alta qualità e di significativo. Non sappiamo, tuttavia, consideriamo questa metodologia adatta per la proiezione di phenodeviants generati da un programma di mutagenesi casuale.
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza di competizione interesse finanziario.
Dichiarazione etica
Gli animali sono stati mantenuti in condizioni esenti da organismi patogeni nella funzione di cura degli animali della Institut d'Immunologie et d'Hématologie. Manipolazione dei topi e delle procedure sperimentali sono state condotte in conformità con la legge francese per la protezione di animali da laboratorio. La procedura è stata approvata dal servizio veterinario della Prefettura du Bas-Rhin (Francia) con il numero di autorizzazione A-67-345.
Acknowledgments
Ringraziamo Lee Tuddenham (IBMC, Strasburgo) per amplificare e titolazione MCMV-Luc e Thomas Baumert (INSERM U748, Strasburgo) per il permesso di utilizzare la struttura animale dell'Istituto di Virologia. Il sostegno finanziario da INSERM, Université de Strasbourg e Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) è riconosciuto. La partecipazione iniziale di Sonia Beroud e Laetitia Lelieur durante la loro progetto Master è inoltre riconosciuto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylen blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer | ||
References
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