Summary
TRPV4의 연구에 일반적으로 사용되는 방법을 보완하기 위해 두 가지 방법이 설명되어 있습니다 : 그것의 mechanosensitivity는 저자 삼투 도전에 따라 형질 전환 효모에서 칼슘 2 + - 애큐 오린 luminometry으로 공부하실 수 있습니다. 그것은 또한 TRPV4-RNA에서 조사 할 수있는 온 - 셀 또는 절제 모드 클램프 전체 셀 두 전극 전압 클램프 또는 패치로 Xenopus의 난자를 주입했다.
Abstract
TRPV4 (과도 수용체 잠재력, 바닐 로이드 가족, 유형 4) 널리 척추 동물의 조직에서 발현되고, 기계적인 힘에 의해 등 여러 가지 자극에 의해 활성화된다. 특정 TRPV4 돌연변이는 인간의 복잡한 유전 뼈 또는 신경 병리의 원인이됩니다. 야생 형 또는 돌연변이 TRPV4 도입 유전자는 일반적으로 배양 된 포유 동물 세포에서 발현과의 Fura-2 형광 측정에 의해 전극에 의해 검사된다. mechanosensitivity 및 질병의 분자 염기의 메커니즘의 측면에서, 현재 문헌들은 혼란과 논란이있다. 기존의 방법을 보완하기 위해, 우리는 TRPV4의 분자 특성을 검사하는 두 가지 추가 방법을 설명합니다. (1) 쥐 TRPV4 및 애큐 오린의 유전자는 신진 효모로 변환된다. 형질 전환 체 인구의 저자 osmtic 충격 TRPV4 채널을 통해 발표로 인해 칼슘 2 +와 애큐 오린의 조합에 luminometric 신호를 얻을 수 있습니다. 여기 TRPV4는 평소 포유류의 파트너 단백질로부터 분리자체 mechanosensitivity을 보여준다. (2) TRPV4의 된 cRNA는 Xenopus의 난자에 주입된다. 배양의 적당한 기간 후에 거시적 TRPV4 전류는 두 전극 전압 클램프로 검사된다. 난자 화장실에서 불활성 농도의 삼투압의 제거시 현재의 상승은 mechanosensitivity 나타낸다. 난자에서 마이크로 암페어 (10-6 10-4) 전류는 명확 quantifications과 자신감 평가를 항복, 배양 된 세포에서 nanoAmpere subnano 대 (10 -10 -9 10) 전류보다 훨씬 크다. 개별 채널 단백질의 활동을 반영 미세한 전류가 직접 온 셀 또는 절제 모드에서, 패치 클램프에 따라 등록 될 수있다. 같은 난자는 더 나은 데이터 복제를 허용, 여러 패치 샘플을 제공합니다. 패치에 적용 흡입구 직접 mechanosensitivity을 평가하기 위해 TRPV4을 활성화 할 수 있습니다. 이러한 방법은 또한 TRP 채널의 다른 유형의 연구에 유용 할 것이다.
Introduction
TRPS (일시적 수용체 전위) 감각 기능 1,2를 제공 양이온 채널의 일곱 아과을 포함한다. 포유 동물, TRPV에서 TRPS의 바닐 로이드 아과는 6 종류가 있습니다. TRPV4 (유형 4) 가열 3,4에 응답, 특정 화학 물질, 삼투압 부종, 또는 전단 응력. TRPV4 유전자 반복 후보 유전자 및 / 또는 5-8 클로닝 식에 의해 단리 하였다. 후자의 방법은 저자 삼투압에 유전자 산물의 응답을 하였다. TRPV4 많은 상이한 세포 유형 3,4의 개발, 생리학, 병리 또는 거의 모든 기관 및 함수로 표현된다.
눈에 띄는 말초 신경 병증 및 / 또는 골격 이형성증 (골격 발달에 이상) 9-11을 일으키는 원인이되는> 50 인간의 염색체 우성 TRPV4 돌연변이입니다. 골격 이형성증의 범위는 가벼운 brachyomia 유형 3 (유형 3 왜소증), spondylometaphyseal 발육 코즐로 스키 형, 세 베리까지이형성증 다시, 일부는 신생아 또는 배아의 죽음을 초래. 메커니즘의 모든 방식이 가능한 것 같다 있지만, 아무도 다양성, 복잡성, 다양성, 이러한 질병 4 가끔 중복 설명하지 않습니다.
다른 TRP 채널 1과 마찬가지로, TRPV4는 사량입니다. 쥐 또는 인간의 TRPV4, 각각의 서브 유닛은 871 잔기로 구성되어있다. 그 중심 요소는 여섯 횡단 가능성 전압 문 K + 채널과 유사한 방식으로 배치되어 나선 (S1-S6)이다. 거기에, S4에 S1은 주변 영역을 형성하고, S5 및 S6은 투과 기공 도메인을 형성한다. S5와 S6 사이의 TRPV4 아마도 양이온 필터를 형성하도록 수렴 중 네 시퀀스 LDLFKLTIGMGDL,이어서 짧은 기공 나선이다. 470 - 잔류 N-말단 세포질 세그먼트는 단백질이나 작은 리간드를 결합하는 것으로 알려져 6 ankyrin 반복이 포함되어 있습니다. C-말단 152-잔류 세포질 부분은 구약 바인딩 가능한 다른 사이트들 사이에 칼 모듈 린 결합 순서를 포함그녀의 요소 3.
TRPV4 본질적 음이온 일을 제외 양이온 채널이다. 생리 학적 기능은 칼슘 2 + 유입 자극을 형질 도입하는 것이지만, 그것은 P 캘리포니아에서 이가 호의를, 또한 아이젠만 IV 투과성 순서와 다른 양이온을 투과 : P 나 7 ~ 12. 단일 채널 컨덕턴스 ~ 90 피코 초 외부와 ~ 40 피코 초 안쪽 6,13,14에 정류한다. 발현 된 (아래) 현재는 저자 삼투 부종, 전단 응력, 또는 온기 (15)에 의해 활성화 될 수 있습니다. 또한 고도 불포화 지방산 (16, 17) 및 합성 phorbal 에스테르 18 4αPDD에 의해 활성화된다. 현재, 모두가 높은 처리량, 작은 분자 화면에 의해 발견, 10-9 10-8 M (20)의 효과가 가장 강력한 효능은 GSK1016790A 19과 길항제 GSK2193874입니다.
TRPV4 연구의 두 가지 핵심 영역은 혼란 남아(1) TRPV4 크게는 mechanosensitivity 공부하더라도으로, 분자 기초는 논쟁의 여지가있다. 한 모델은, 저자 삼투압 어떻게 든 epoxygenase에 의해 산 (EET)를 epoxyeicosatrienoic로 변환되는 고도 불포화 지방산 (PUFA) 아라키돈 산 (AA)을 생산하는 포스 포 리파아제 A2 (PLA2)를 활성화하고 EET의 결합이 TRPV4 16를 활성화 설명 17. 그러나, TRPV4 자체가 직접 간단한 설명을 제공하는 멤브레인 스트레칭 14 (아래)에 대응하기 위해 표시되었습니다. (2) TRPV4 돌연변이 병리 어지러 울 수 있습니다. 기초에, 하나는 질병 손실, 감소 또는 채널 활동의 증가에 기인하는지 여부를 알 필요가있다. 여기에서도, 문학은 명확하지입니다. 여러 골격-이형성증의 대립 유전자는 높은 활성을 가지고보고있는 동안, (이득의 기능, GOF) 4,21은 여러 가지가 활동 (기능 상실, LOF) 10,22을 감소하는 것으로보고되었다. 14 대립 유전자의 체계적인 연구에 발견모든 GOF 수 변이 (아래) 23. TRPV4 기능의 전체 손실에도 불구하고 사소한 결함이 가능한 또는 비옥 녹아웃 마우스,,, - 일부는 LOI들입니다 주장은 trpV4 - /의 표현형을 부정하는 것 같습니다.
이러한 논쟁의 일부는 방법 론적 기원을 가지고 있습니다. 연구소는 다른 방법, 또는 방법의 변형을 사용하고, 다른 심사 기준을 사용한다. 가장 일반적으로, TRPV4는 일시적으로 (HEK, CHO, 헬라) 및 작용제 또는 저장성 자극에 따라 내부 [칼슘 2 +]의 증가는 칼슘 2 +에 민감한 형광 염료의 Fura-2에 등록되어 배양 된 포유 동물 세포에서 발현된다. 이 형광 분석에 과다 의존은 1 비판을 받아왔다. 다른 집단에서 발현 수준은 그 내부에 분포뿐만 아니라 효과적인 염료 농도가 제어되고 기록되어야 할 필요가있다. 보다 안정적인는 직접 전기 생리학 검사입니다. 심지어이 같은 commonly는 연습, 문제없이도 없습니다. 개별 배양 세포에서 발현 수준은 제어가 곤란하기 때문에, 전체 - 셀 전류가 큰 변동이있다. 전류가 작기 때문에 또한, 신뢰할 수있는 통계는 종종 실용적이지 큰 샘플 크기에 의존해야합니다. 패치 클램프 검사는 거의 수행되지 않았습니다. 일부 이러한 기록은 16, 17 통계적 평가는 도전하게 활동 버스트의 클러스터를 보여줍니다.
더 나은 분자 mechanosensitivity을 이해하기 위해, 우리는 TRPV4을 검사하는 두 개의 추가 시스템을 개발했습니다. (1) 거리의 보통 포유류의 파트너 TRPV4를 분리하기 위해, 우리는 효모 (24) 신진에 쥐 TRPV4을 표명했다. 이 진화 적으로 먼 상황에서 TRPV4의 기능적 발현은 여전히 평소 파트너없이 침투 힘에 응답 할 수 있음을 보여 주었다. 효모는 AA 또는 EET으로 더 된 PUFA를하지 않으며, 게놈이 간편 체크인을 더 PLA2 또는 epoxygenase 유전자가 없기 때문에(투약) 소지도 TRPV4는 힘을 감지하기 위해 그들이 필요하지 않습니다 것을 보여줍니다. 분자 생물학적으로 가장 의무가 진핵 생물에서 TRPV4를 갖는 것은 또한 효율적인 앞으로 또는 역방향 유전자 조작 25 수 있습니다. (2) TRPV4의 깊이있는 생물 물리학 적 분석을 위해, 우리는 Xenopus의 난자에 TRPV4을 표명했다. nA의 (10 -10 10 -9 A)의 전류로 서브 - 나를 얻을 배양 된 세포와 달리 난자 μA의 (10-6 10-4)의 전류를 표현한다. 소음에 훨씬 더 큰 신호가 더 나은 정량화하고 자신감 비교를 할 수 있습니다. TRPV4, 그래서 표현도 패치 클램프를 사용하여 개별 분자로 검사 할 수 있습니다. 하나의 난자가 다시 정량보다 안정적 만들기, 반복 패치 샘플링을 할 수 있습니다. 이러한 연구는 TRPV4 채널 자체가 직접 막 스트레치 힘 (14)에 의해 활성화 될 수있는 것으로 나타났다. 분석은 14 대표 골격-발육 대립 유전자는 모든 기능 획득 돌연변이 있다는 것을 보여 주었다. 또한, degr이 제정 칼슘 2 + 누설의 EE는 골격 질환 (23)의 심각도를 평행.
때문에 그들의 참신 및 유용성,이 두 가지 방법의 상세한 절차는 TRPV4 또는 유사한 채널에서 미래의 연구에 복제 할 수 있도록 여기에 조립된다.
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Protocol
1. 효모 Luminometry 방법
사카로 마이 세스 세레 비시 애의 변형 BYYT를 사용합니다. 그것은 BY4741 (마타, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4)의 yvc1-tok1 파생입니다. Batiza 등. 26 Loukin 등. (24)에 설명 된대로, 레 선택할 수 애큐 오린 발현하는 플라스미드 pEVP1/Aeq와 우라 선택 쥐 TRPV4 발현하는 플라스미드 p416GPDV4으로 세포를 변형 플라스미드 건설 및 변환 (27)의 사용 표준 방법 . 효모 균주와 플라스미드의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
- 하룻밤 1M 소르비톨 보충 레 우라 - "DCD"드롭 아웃 매체 (28) (CMD-레 우라 매체 (29)의 황산 고갈 변형)에서 30 ° C의 셰이커 후 로그 상에 효모 세포의 배양 2 ㎖ . luciferi 2 μM 보충 새로운 배지 1.8 ㎖에 이러한 문화의 200 μl를 접종N의 엘렌 테라. 진탕해야만 실온에서 24 시간 동안 어두운 곳에서 재배한다.
- 문화의 삼투압 (아래) (일반적으로 1,400 mOsM) 및 다른 솔루션 증기 압력 osmometer를 사용하여 측정한다.
- 나누어지는 20 단 하나 관 루미의 12mm 루미 튜브에 신선한 문화의 μL.
- 근력 저하 충격 원하는 충격의 정도에 따라 25 mM의 NaEGTA (산도 7.2) 또는 이름 (산도 7.2)과 500-100 밀리미터의 NaCl (1,200-400 mOsM 총 삼투압)를 포함, 용액 200 μl를 추가합니다. 연속적 전에 발광을 모니터하고, 적어도 120 초 삼투 downshock 후에 만 간단한 희석 조작에 의해 중단. 상대 발광 장치 (RUL)와 같은 데스크톱 컴퓨터에 루미 출력을 등록합니다.
하지 형질 전환 TRPV4의 연구이지만, 우리는 효모 균주의 많은 수의 응답을 검사하는 자동화 된 시스템에서 위의 프로토콜의 변형을 사용했다. 연구 오F 저자 30 마이크로 루미를 사용하여 효모 deletome (4,906 효모 단일 유전자 deletants의 컬렉션)의 삼투압 31 자극과 해당 소프트웨어를 분석 반응은 성공적이었다.
2. 3. 난자 전기 생리학 방법
전기 생리학은 기본적인 방법 32을 사용합니다. PCR은 야생형 또는 돌연변이 TRPV4 하이파이 PfuUtra 중합 효소를 사용하여 pGH19 33에 통합의 오픈 리딩 프레임을 증폭. 이것은는 Xenopus β-글로빈 유전자와 T7 RNA 중합 효소 프로모터 하류의 5 '및 3'의 UTRs 간 ORF의 정확한 삽입을 수반한다. 3 'UTR의 하류 및 체외 T7 RNA 중합 효소 반응에서 주형으로 사용되는 구조를 선형화. 표준 분자 생물학적 기법 (34)를 사용합니다.
X.에서 스테이지 V-VI의 난자를 사용 laevis의. 축산 부분 ovariecto내, defolliculation 및 난황 봉투 제거는 표준 절차에게 32,33,35를 따릅니다. 드럼 몬드 Nanoinject II 자동 microinjector를 사용하여 난자 당 cRNA를 솔루션의 2-40 NG를 주입한다. ~ 각 실험 세트 (30) 난 모세포를 주입한다. TRPV4 - cRNA를 주입 한 후, 겐타 마이신 (100 ㎍ / ㎖)으로 ND96 매체에서 난 모세포를 배양하고 1 μM 루테늄 (14) 빨강.
2. 두 개의 전극 전압 클램프
- 개별적으로 피펫 풀러 정밀 일회용 100 μL의 마이크로 피펫에서 붕규산 유리 기록 피펫을 잡아 당깁니다.
- 전압 측정 및 전류 주입 피펫 전극을 모두 당기은 ~ 1 μm의 직경의 팁 구멍을 가지고 당겨진다.
- 2 M KCl을 가진 백필 전극 0.1-0.2 밀리 옴 저항의 결과. 함께 VG-2Ax100 가상 접지 목욕 클램프, Digidata 1440 디지타이저를 통해 GeneClamp 500 앰프 인터페이스에 연결되어 HS2A의 headstages, 그들을 설치합니다. 획득 pClamp10 소프트웨어를 사용하여 데이터.
- 20 배 배율의 해부 현미경의 무대에 장착 된 제작 된 플라스틱 실에서 1 ㎖ 화장실에서 테스트 할 수있는 난자를 놓습니다. 목욕 솔루션은 가상 접지 3 M의 KCl 한천 다리와 가까운 난자에 배치 VG-2A 가상 접지 단에 연결 염소화 실버 와이어입니다.
- 솔루션의 입구와 출구로 플라스틱 호스 연속 관류 챔버를 구축합니다. 입구 튜브가 여섯 50 ㎖ 주사기 껍질 다른 용액으로 채워져 각각의 매니 폴드이다 제조 된 관류 시스템에 연결되어 연결한다. 특정 솔루션의 중력 공급 속도는 제어에 ~ ~ 3 호스의 "켁"램프 클램프를 사용 ㎖ / 분.
- 미세 조작기에 자신의 headstages에 두 전극을 장착합니다. 미세 조작에 의해 난자의 전극 침투를 수행합니다.
3. 직접 Mechanosensitivity의 패치 클램프 검사
"> 피펫 준비, GΩ 인감 형성하고, 온 - 셀 또는 절제 모드의 형성 등의 패치 클램프의 기본 방법은 해밀의 그 외. (36)는 Conn 32입니다.- 98 밀리미터의 KCl, 1 mM의 MgCl2를, 10 mM의 K +-HEPES, pH를 7.2로 끝 ~ 1 μm의 직경의 구멍 (거품 번호 5-6)으로 붕규산 유리 피펫을 입력합니다.
- 또한, 압력계, 5 ML의 주사기에 플라스틱 튜브를 통해 T-조인트를 통해 패치 클램프 피펫을 연결합니다. 전극과 압력계 출력 모두를 처리하기 위해 컴퓨터를 사용합니다. 10 kHz에서 데이터를 수집하고 분석을 위해 1 kHz에서 여덟 폴 베셀 필터를 통해 재생할 수 있습니다.
- 다른 패치는 반복적으로 동일한 난자에서 절제 할 수 있습니다. 이 연습은 TRPV4의 분자 활동의 시험이 더 효율적이고 신뢰할 수 있습니다.
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Representative Results
일반적인 luminometry 실험에서, 400-1,200 mOsM 다운 저장성 충격의 범위는 1,400 mOsM의 문화를 20 ㎕로 다른 낮은 삼투압의 충격 솔루션 200 μl를 추가하여 달성된다. 효모 세포 비어 p416GPDV4 플라스미드 또는 이온 필터에서 돌연변이 (도 1) (24)와 TRPV4 유전자를 포함하는 하나의 형질 전환 : 실험의 RLU는이 음성 대조군에 비해 때 TRPV4 활성은 분명하다.
일반적인 2 전극 전압 클램프 실험에서 난자가 처음 (mm 단위)를 포함 흐르는 등장 목욕 솔루션에 목욕을 66 KMeSO 4, 1.8 바 (메조 4) 2, 5 K +-HEPES (pH를 7.2)와 100 소르비톨. 피크 전류는 -20 MV 매 10 초 보유 전위로부터 +20 MV 100 밀리 테스트 펄스의 끝에서 평가된다. 저장성 반응을 이끌어내는 흐름은 소르비톨 부족 유사한 솔루션으로 변경됩니다. 티 자신의 근력 저하 응답은 소르비톨의 반환에 뒤집을뿐만 아니라 TRP 채널 차단제 루테늄 레드 (그림 2A)로 차단 가능합니다.
패치 피펫 채우는 용액 입욕 용액 동일 (98 밀리미터의 KCl, 1 mM의 MgCl2를, 10 mM의 K +-HEPES, pH를 7.2)이다, 즉 일반적인 패치 클램프 실험에서는 대칭 용액을 사용한다. 여기서, 쥐 TRPV4 식 난자에서 절제 내부 아웃 패치는 +50 MV에서 개최된다. 흡입의 펄스는 주사기에서 생성됩니다. 짧은 흡입구는 지속 시간이 밀리 초 수백, 난자의 막 (37)과 발현 된 TRPV4 (그림 2B) 14 ~ 90 피코 초 단위 전도에 ~ 40 피코 초 단위 전도의 기본을 유도, mm 수은의 수만에 적용.
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그림 1. 쥐 TRPV4는 저장성 충격에 효모 응답 표현. (A) 실험 방법을 보여주는 그림. (B) (750) mOsM 저장성 충격 (화살표 머리) TRPV4 형질 전환에서 (상대 발광 장치, RLU에) 큰 발광 증가를 유발, 그러나 빈 플라스미드 나 플라스미드의 형질 전환에 그 이온 필터 (M680K) 저 삼투압 충격 및 피크 반응 사이. (C) 투여 량 - 반응 관계에있는 돌연변이와 TRPV4 베어링은 (+ SD 평균 N = 3). 2.4 X 10 6 세포 각각 24에서 측정. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 2. TRPV4 활동의 전기 생리학 검사는 heterologously Xenopus의 난자를 표명했다. 두 전극 전압 클램프 검사 저장성 자극에 (A) 전체 - 난자 거시적 전류 응답. 야생 형 TRPV4의 매우 높은 수준을 표현 난자에서 피크 전류 제거에 대한 응답 (삽입) (-20에서 +20 MV 매 10 초) 100 밀리 초 전압 단계에 따라 (5 일간 cRNA를 40 NG의 주입 후) 250 mOsM 목욕 솔루션 (오픈 바) 및 3 μM 루테늄 레드 (; .. 막대 RUR)의 추가 (100 mm x 100 mm 거리)의 소르비톨. 분명 등장 성 용액 또는 채널 차단제 (RUR)를 추가로 반환에 저 삼투압 성 자극 및 감소에 따라 반복 피크 전류가 증가한다. (B) 패치 클램프에서 볼 막 스트레치 야생형 TRPV4 직접 활성화. 함께하는를 보여주는 TRPV4-expreesssing 난자에서 절제 패치에서 평균 품질의 원료 흔적의 샘플60 mmHg로 흡입 (낮은 추적)에 의해 vation은 +50 MV에서 개최 절제 내부 아웃 패치에 적용. 최상층의 추적은 폐쇄 (C) 사이의 단일 현재의 전환을 보여주기 위해 빠른 시간 기준 표시와 두 개의 개방 수준 (O 1 O 2) 14.되어 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
서론에서 언급 한 바와 같이, 일반적으로 TRPV4 기능을 연구하는 데 사용되는 방법은 때때로 모순과 논쟁의 결과. 여기에 설명 된 방법 중 두 세트의 몇 가지 장점을 제공하며, 기존의 방법을 보완 할 수있다. 우리가 TRPV4 만의 연구를 설명하는 동안, 방법은 다른 이온 채널을 연구하기 위해 확장 될 수있다.
1. 효모 Luminometry 방법
신진 효모 지질 조성물 (30)에 영향을 미치는 돌연변이에 의해 증감되는 저자 삼투 충격에 네이티브 칼슘 2 + - 유입 응답이 있습니다. 이 신호는 외부 EGTA로 지울 수 있습니다. 이 킬레이트 제는, 그러나, 채널이 내부 막으로 표현되었는지를 나타내는, 발현 된 TRPV4 (24)로부터 신호를 소거하지 않고, 가장 가능성 CA가 2 +는 삼투압에 세포질로 방출되는 소포체의 그것 충격. 발현 된의 교통채널은 효모에서 연구되지 않았습니다. 이 방법은 다른 TRP 채널 또는 다른 추정 mechanosensitive 채널의 연구로 확장 될 경우, 킬레이트 시험을 실시하고, 기본 시스템의 존재가 마음에 부담해야합니다.
2A. 두 전극 전압 클램프
패치 클램프 실험과 달리, 두 전극 전압 클램프 실험 난황 엔벨로프의 제거 전에, 본래 난자에 수행된다. 현미경 검사 및 용량의 값은 모두 플라즈마 막 균일 구면 아니지만 높은 난황 봉투의 비교적 비탄성 구 아래 invaginated되는 것을 나타낸다. 따라서, hyponicity 기인 기계적 응력 확대 구형 원형질막 단순히 등방성 인플레이션 장력 아니다. 멀리 일에 설립 세포질 첨부 파일에서 구속 난황 봉투 및 / 또는에 대한 멤브레인의 압박에서 스트레스 가능성이 결과증가 삼투압 전자의 얼굴.
TRPV4의 표현, 가능성이 일부 다른 채널은, 아마도으로 인해 칼슘 2 + 누설, 난자에 독성이다. 연속적 채널 차단제, 루테늄 레드의 존재 TRPV4-cRNA를 주입 한 후 난자를 배양하는 것이 중요하다. TRPV4 발현의 정도는 실험 통제하에 완벽하지 않은, 변화를 보여줍니다. "이득의 기능"돌연변이 TRPV4 채널은 상당한 자발적 개방을 표시하는 사람들이 체계적으로 이전 주입 후 자신의 야생 형 대응 23보다 표현된다.
2B. 패치 클램프
Xenopus의 난자는 안쪽 방향으로 정류 기본 mechanosensitive 채널 (~ 50 피코 초 안쪽 ~ 10 피코 초 외부) 표현한다. 한 연구는 TRPC1 (37)의 표현이다 것을 제안합니다. 이 지속적으로 표현 된 기본 채널은 TRPV4, 이종의 보정을 제공합니다의 logous 표현은 항상 성공적으로 패치에서 관찰되지 않을 수 있습니다.
TRPV4가 발생할 확률은 일반적 3-4일 cRNA를 주입 한 후, 배양의 긴 기간 후에 난자 높은 경향. 진행 할 수있는 효율적인 방법은 먼저 난자가 동일한에서 샘플 패치를 복용하기 전에 난황 봉투를 제거하기 위해 진행 한 후 자연 TRPV4 거시적 현재를 표현하고 있는지 확인하고, 두 전극 전압 클램프 실험 (위)를 수행하는 것입니다 난자. TRPV4 활동 캡처 가능성도 큰 보어 (거품 번호 6-7)과 피펫에 탑재 "macropatches"를 사용하여 향상 될 수있다. 이 피펫 (32)를 연마 화재 GΩ 인감을 달성에 도움이 될 것으로 보인다. 씰 형성 한 후, 절제 패치는 매우 높은 저항을 표시 할 수 있습니다 거의 일반적으로 생체막과 관련된 잡음없이 기본 채널 활동. 이 가능성이 가장 높은이중 막 형성을 일어나야. 짧은 공기 노출, 일시적으로 미세 조작에 의해 메 니스 커스 (meniscus) 위의 피펫을 올려 일반적으로 원치 않는 계층을 끊을 수있다. 대안 적으로, 외층 부드럽게 욕에 현탁 경화 실리콘 밀봉의 스레드에 대해 피펫 보어 감동에 의해 제거 될 수있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 우수한 기술 지원을 안드레아 Kremsreiter에게 감사의 말씀을 전합니다. 매디슨 - 우리 실험실에서 작업 NIH GM096088와 위스콘신 대학의 빌라스들에게 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Wescor 5500 | Logan, UT, USA |
| Sirius Single Tube Luminometer | Titertek-Berhold | Sirius | Huntsville, LA, USA |
| Microplate luminometer | Titertek-Berthold | Mithras LB940 | Huntsville, LA, USA |
| Luminometry software | Titertek-Berthold | MikroWin2000 | Huntsville, LA, USA |
| Patch clamp and software | Axon Instrument | HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software | Union City, CA, USA |
| Manometer | Bio-Tec | Winooski, VT, USA | |
| Pipette puller | Sutter Instrument Co | Model P-97 | Novata, CA, USA |
| Microinjector | Drummond Scientific | Nanoinject II | Broomall, PA, USA |
| Luciferin coelenterazine | Invitrogen | Carlsbad, CA, USA | |
| T7 RNA polymerase reaction | Ambion | mMessage mMachine | Austin, TX, USA |
| Gentamicin | Sigma | ||
| Ruthenium red | Sigma | ||
| Micropipettes | Drummond | 100 microliter micropipets | Broomall, PA, USA |
| High-fidelity PfuUtra polymerase | Stratagene | La Jolla, CA, USA |
References
- Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
- Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
- Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
- Nilius, B., Voets, T.
- Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
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