Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Maya lüminometrik ve Published: December 31, 2013 doi: 10.3791/50816
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

Summary

TRPV4 en incelemek için yaygın olarak kullanılan yöntemler tamamlamak için, iki yöntem tarif edilmiştir: Onun mechanosensitivity hipo-ozmotik tehdidi üzerine transgenik maya Ca 2 +-akorinden luminometri ele alınabilir. Ayrıca TRPV4-RNA incelenebilir on-hücre ya da kesilmiş modunda kelepçe bütün hücre iki elektrotlu voltaj kelepçe veya yama ile Xenopus oosit enjekte edilir.

Abstract

TRPV4 (geçici reseptör Potansiyelleri, vanilloid etti, tip 4) omurgalı dokularda yaygın olarak ifade edilir ve mekanik kuvvetlerin de dahil olmak üzere çeşitli uyaranlar tarafından aktif hale gelir. Bazı insan mutasyon TRPV4 karmaşık kalıtsal kemik veya nöronal patolojiler neden olur. Vahşi tip ya da mutant TRPV4 transgenler yaygın olarak kültürlenmiş memeli hücrelerinde ifade edilir ve Fura-2 fluorometri ile ve elektrotlar ile incelenir. Mechanosensitivity ve hastalıkların moleküler bazların mekanizması açısından, mevcut literatür kafa karıştırıcı ve tartışmalıdır. Varolan yöntemler tamamlamak için, biz TRPV4 moleküler özelliklerini incelemek için iki ek yöntemleri açıklanmaktadır. (1) Rat TRPV4 ve aequorin transgen tomurcuklanma maya içine transforme edilir. Transformant nüfusunun hipo-Osmotik şok TRPV4 kanalı üzerinden serbest nedeniyle, Ca 2 + ile aequorin kombinasyonuna lüminometrik bir sinyal verir. İşte TRPV4 her zamanki memeli ortak proteinlerin izole edilirve kendi mechanosensitivity ortaya koymaktadır. (2) TRPV4 of cRNA Xenopus oositlerine enjekte edilir. Uygun bir inkübasyon süresinden sonra, makroskopik TRPV4 mevcut bir iki elektrodlu voltaj kelepçe ile incelenir. Oosit banyosundan atıl ozmotikum uzaklaştırılması üzerine akım yükselme mechanosensitivity göstergesidir. Oositlerden mikroamper (10 A -4 -6 ila 10) akımları net quantifications ve daha emin değerlendirmeler, sonuçta kültürlenmiş hücrelerden nanoAmpere subnano-to (10 -10 A -9 10) akımları çok daha büyüktür. Tek kanal proteinlerin faaliyetlerini yansıtan mikroskobik akımlar da doğrudan doğruya-hücre ya da eksize modunda, bir yama kelepçe altında kayıtlı olabilir. Aynı oosit daha iyi veri replikasyonu sağlayan, birden fazla yama örnekleri sağlar. Yamalar uygulanan emmelerde doğrudan mechanosensitivity değerlendirmek TRPV4 etkinleştirebilirsiniz. Bu yöntemler aynı zamanda TRP kanallarının diğer tip çalışmaya faydalı olmalıdır.

Introduction

TRPS (geçici reseptör potansiyeller) duyusal fonksiyonları 1,2 hizmet katyon kanallarının yedi alt familyaya oluşmaktadır. Memeliler, TRPV olarak, TRPS en vanilloid alt ailesi, altı çeşidi vardır. TRPV4 (tip 4) ısı 3,4 cevap verir, bazı kimyasallar, ozmotik şişme, ya da kayma gerilmesi. TRPV4 gen tekrar tekrar aday geni ve / veya 5-8 ifade klonlama ile izole edilmiştir. Bu ikinci yöntem, hipo-ozmolarite gen ürün tepkisini takip etti. TRPV4 çok farklı hücre tipleri 3,4 gelişimi, fizyoloji, herhangi bir patolojinin hemen hemen tüm organ ve işlevler cinsinden ifade edilir.

Çarpıcı periferal nöropatiler ve / veya iskelet displazileri (iskelet gelişiminde anormallikler) 9-11 neden> 50 insan otozomal dominant TRPV4 mutasyonlar. Iskelet displazisi aralığında hafif brachyomia tip 3 (tip-3 cücelik), spondylometaphyseal displazi Kozlowski tipi, seve dandisplaziler yeniden, bazı neonatal veya embriyonik ölüme neden olur. Mekanizmaların tüm görgü olası görünüyor olsa da, hiçbiri çeşitlilik, karmaşıklık, değişkenliği ve bu hastalıkların 4 zaman zaman çakışmalar açıklıyor.

Diğer TRP kanalları 1 gibi, TRPV4 bir tetramerdir. Sıçan ya da insan TRPV4 olarak, her bir alt birim 871 artıkları oluşmaktadır. Bu temel öğesi altı transmembran olası voltaj kapılı K + kanallarının benzer bir şekilde düzenlenmiş olan bir heliks (S1-S6) 'dir. Orada, S4 S1 çevresel bir etki oluşturur ve S5 ve S6 geçirgenlik, gözenek alanı oluşturur. S5 ve TRPV4 ve S6 arasında muhtemelen katyon filtre oluşturmak için yakınsama dört hangi dizisi LDLFKLTIGMGDL, ardından kısa bir gözenek sarmal olduğunu. 470 artıklı N-terminal segmenti sitoplazmik proteinler ya da küçük ligandların bağlandığı bilinen 6 ankirin tekrarı içerir. C-terminal 152-bakiye sitoplazmik kademeli ot bağlanan diğer olası siteler arasında bir kalmodulin-bağlayıcı sekansı içerirOnun elemanları 3.

TRPV4 esasen 1 anyonları hariç bir katyondur kanalıdır. Fizyolojik fonksiyonu Ca 2 + akınına uyaranlara transdüksiyonu için olsa da, bir P Ca iki değerli lehine, aynı zamanda bir Eisenman IV geçirgenlik sekansı ile diğer katyonlar geçirgen: P Na ~ 7 12. Tek kanallı iletkenliği ~ 90 pS dışa ve ~ 40 PS içe 6,13,14 de düzeltilir. Heterolojik ifade (aşağıda) akım hipo-ozmotik şişme, kayma gerilmesi, ya da sıcaklık 15 ile aktive edilebilir. Ayrıca, çoklu doymamış yağ asitleri 16,17 ve sentetik phorbal ester 18 4αPDD tarafından aktive edilir. Şu anda, her ikisi de, yüksek verim, küçük moleküllü ekran tarafından keşfedilen 10 -9 -8 10 M 20 etkili, en güçlü agonist GSK1016790A 19 ve antagonist olan GSK2193874.

TRPV4 araştırma iki anahtar alanlar kafa kalır: (1) TRPV4 büyük ölçüde mechanosensitivity için çalışılmıştır bile, moleküler temeli tartışmalıdır. Bir model, hipo-osmolarite herhangi bir şekilde epoksijenaz ile asit (EET) epoxyeicosatrienoic dönüştürülür çoklu doymamış yağ asidi (PUFA), arakidonik asit (AA), üretilmesi için fosfolipaz A2 (PLA2) harekete geçirir ve EET bağlanmasını TRPV4 16 aktive tarif 17. Yine de, TRPV4 kendisi doğrudan basit bir açıklama sağlamaktadır, membran streç 14 (aşağıda) yanıt gösterilmiştir. (2) TRPV4 mutant patolojileri şaşırtıcı vardır. Temel olarak, bir hastalık kaybı, azaltılması ya da kanalı faaliyetlerinin artış nedeniyle olup olmadığını bilmek gerekir. Burada bile, edebiyat çok net değil. Birden iskelet-displazi alellerin daha yüksek bir aktiviteye sahip olduğu rapor edilirken, (kazanç fonksiyon-, GOF) 4,21, çeşitli etkinlikler (kayıp-fonksiyon, LOF) 10,22 azalma olduğu bildirildi. 14 alellerin sistematik bir çalışma için onları bulduTüm GOF edilecek mutasyonlar (aşağıda) 23. TRPV4 fonksiyon tam kaybına rağmen sadece küçük kusurları ile canlı veya bereketli nakavt fare, - bazı Lofs olan iddia trpV4-/ fenotip çelişiyor gibi görünüyor.

Bu tartışmalara bir kısmı metodolojik kaynağı vardır. Laboratories farklı yöntemler, ya da bir yöntem varyantlarını kullanımı ve farklı bakarsak standartları kullanır. En sık olarak, TRPV4 geçici (HEK, CHO, HeLa) ve agonist veya hipotonik stimülasyonu üzerine iç [Ca2 +] yükselişi Ca 2 + duyarlı fluoresan boya, Fura-2 ile kayıtlıdır kültürlenmiş memeli hücrelerinde ifade edilir. Bu flüorometrik tahlil üzerinde aşırı güven 1 eleştirilmiştir. Farklı popülasyonlarda ekspresyon seviyesi, bunun içinde dağılım, hem de etkili bir boya konsantrasyonu, kontrol ve belgelenmiş gerekir. Daha güvenilir doğrudan elektrofizyolojik muayenesi olmaktır. Hatta bu gibi commonly uygulanan, sorunsuz da değildir. Kültürlenen hücrelerde ekspresyon seviyeleri kontrol edilmesi zor olduğu için, bütün hücre akımları büyük farklılıklar vardır. Akımlar küçük çünkü Ayrıca, güvenilir istatistikler genellikle pratik değil büyük çaplı, güvenmek zorunda kalacak. Patch-kelepçe muayeneler nadiren yapılmıştır. Bu tür bazı kayıtlar 16,17 istatistiksel değerlendirme zorlu hale aktivite patlamaları kümeleri göstermektedir.

Daha iyi moleküler mechanosensitivity anlamak için, biz TRPV4 incelemek için iki ek sistemleri geliştirdiler. (1) uzakta olağan memeli ortaklarından TRPV4 izole etmek için, biz maya 24 tomurcuklanma sıçan TRPV4 dile getirdiler. Bu evrimsel uzak bağlamda TRPV4 Fonksiyonel ifadesi hala olağan ortaklar olmadan ozmotik kuvvet cevap verebilecek gösterdi. Maya gibi AA veya EET hiçbir PUFAların yapar, ve genom, bu Expre hiçbir PLA2'nin veya epoksijenaz genleri Çünküsalgılanması da TRPV4 kuvveti duyacak için, gerekli olmadığını göstermektedir. Moleküler biyolojik en müsait ökariyotlarda TRPV4 olması da etkili ileri veya geri-genetik manipülasyonlar 25 verir. (2) TRPV4 derinlemesine biyofiziksel analizler için, Xenopus oositlerde TRPV4 ifade edilmiştir. NA (10 -10 10 -9 A) akımları alt-nA verim kültür hücreleri, aksine, bir oosit uA adlı (10 -6 -4 10 A) akımları ifade eder. Gürültü üzerine çok daha büyük sinyali daha iyi ölçümlerini ve daha güvenli karşılaştırılmasını sağlar. TRPV4, bu ifade, aynı zamanda bir kumanda kelepçesi kullanılarak tek tek moleküller olarak incelenebilir. Tek bir oosit tekrar ölçümü daha güvenilir hale tekrarlanan yama örnekleme sağlar. Bu tür çalışmalar TRPV4 kanal kendisi doğrudan membran germe kuvveti 14 ile aktive edilebilir olduğunu gösterdi. Analizler aynı zamanda 14 temsilci iskelet-displazi alellerin tüm kazanç fonksiyon-mutasyonlar olduğunu gösterdi. Bundan başka, degrBu yapısal Ca 2 + kaçağı ee iskelet hastalıkları 23 şiddetini paraleldir.

Çünkü onların yenilik ve kullanışlılığı, bu iki yöntemin detaylı prosedürler TRPV4 veya benzeri kanallar gelecekteki araştırmalarda çoğaltmaları izin burada toplanıyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Maya luminometri Yöntemleri

Saccharomyces cerevisiae suşu BYYT kullanın. Bu BY4741 (mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4) bir yvc1-tok1-türevidir. Batiza et al. 26 ve Loukin et al. 24 de tarif edildiği gibi, leu-seçilebilir aequorin-sentezleyen plasmid pEVP1/Aeq ve ura-seçilebilir rat-TRPV4 ifade eden plazmid ile p416GPDV4 hücrelerini dönüştürmek plasmid yapımı ve dönüşüm 27 kullanılması için standart yöntemler . Maya suşu ve plazmalar istek üzerine mevcuttur.

  1. Gece boyunca 1 M sorbitol ile takviye leu-ura-"DCD" Bırakma ortamı 28 (CMD-leu-ura ortamı 29 bir sülfat tükenmiş varyant), bir 30 ° C karıştırıcısı içinde post-logaritmik faza maya hücrelerinin kültürü 2 mi . Luciferi 2 uM ile desteklenmiş taze ortam içinde 1.8 ml, bu kültürlerin 200 ul inokülen coelenterazine. Çalkalamadan 24 saat daha oda sıcaklığında karanlıkta büyütün.
  2. Kültürün ozmolarite (aşağıda) (tipik olarak en mOsM'den 1400) ve diğer çözümleri bir buhar basıncı osmometresi kullanılarak ölçülür.
  3. Tümbölen 20 tek tüp lüminometre için bir 12 mm Lüminometre tüpüne taze kültür ul.
  4. Hipotonik şok için, arzu edilen şok derecesine bağlı olarak, 25 mM NaEGTA (pH 7.2) ya da NaMES (pH 7.2) 500-100 mM NaCl, (1,200-400 mOsm toplam ozmolaritesi) ihtiva eden bir çözelti 200 ul ekleyin. Sürekli önce lüminesans izlemek ve en az 120 saniye ozmotik downshock sonra, sadece kısa seyreltme işlemi tarafından kesildi. Göreli ışık birimi (RUL) gibi bir masaüstü bilgisayarda Lüminometre çıktı kaydettirin.

Transgenik olmayan TRPV4 çalışma için de, biz maya suşu çok sayıda cevapları incelemek için otomatik bir sistem içinde yukarıdaki protokol bir varyantını kullandık. Çalışma of hipo-30 ya da bir mikro-luminometre kullanılarak maya deletome (4906 maya tek gen deletants of toplama) hiperosmotik 31 uyaranlara ve karşılık gelen yazılım programı ile analiz tepkiler başarılı olmuştur.

2. ve 3. Oosit Elektrofizyoloji Yöntemleri

Elektrofizyoloji temel yöntemlerini 32. kullanır. PCR, vahşi tip veya mutant TRPV4 yüksek kalitede PfuUtra polimeraz kullanılarak ve pGH19 33 entegre olan açık okuma çerçevesi yükseltmek. Bu, Xenopus β-globin geni ve bir T7 RNA polimeraz promoterinin alt bölgesinin 5 've 3' UTRs arasındaki ORF kesin bir ekleme gerektirir. 3 'UTR bölgesinin alt baş ve bir in vitro T7 RNA polimeraz reaksiyonunda şablonlar olarak kullanılan yapı linearize. Standart moleküler biyolojik teknikleri kullanarak 34.

X'den Evre V-VI oosit kullanın laevis. Hayvancılık, kısmi ovariectobenim, defolliculation ve vitellin zarf kaldırma standart işlemlerinizi 32,33,35 izleyin. Bir Drummond Nanoinject II otomatik mikropüskürtücüden kullanarak oosit başına cRAN çözümün 2-40 ng enjekte edilir. ~ Her bir deney grubu için 30 oosit enjekte edilir. TRPV4-cRNA enjeksiyonundan sonra, gentamisin (100 ug / ml) ile ND96 ortam içinde inkübe oosit ve 1 uM rutenyum 14, kırmızı.

2. İki elektrotlu voltaj-kıskaç

  1. Ayrı bir pipet çektirmesi ile hassas atılan 100 ul mikropipetler gelen borosilikat cam kayıt pipetler çekin.
  2. Gerilim-ölçme ve akım enjekte pipet iki elektrodu çekin ~ 1 mikron çaplı bir ucu diyafram var çekilir.
  3. 2 M KCI ile Dolgu elektrot 0.1-0.2 MQ direnç ile sonuçlanır. Birlikte VG-2Ax100 sanal-topraklı banyo kelepçe ile, bir Digidata 1440 sayısallaştırıcıdan aracılığıyla Geneclamp 500 amplifikatör arayüzüne bağlı HS2A headstages, onları monte edin. Kazanmak pClamp10 yazılımı kullanarak veri.
  4. 20X büyütme ile mikroskop aşamasında üzerine monte edilen bir fabrikasyon plastik odası içinde bir 1 ml'lik bir banyo içinde, test edilecek oosit yerleştirin. Banyo çözümü sanal-topraklı bir 3 M KCl ağar köprü ve yakın oosit yerleştirilen ve VG-2A sanal toprak aşamaya bağlanan bir klorlu gümüş tel gereğidir.
  5. Çözelti, giriş ve çıkış olarak plastik boru donanımları ile sürekli perfüzyon için bölmeyi oluşturmak. Giriş boru altı 50 ml şırınga gövdesi, farklı bir çözeltisi ile doldurulmuş, her bir manifold bir fabrikasyon perfüzyon sistemine bağlanır bağlayın. Herhangi bir çözeltinin ağırlık besleme hızları kontrol için -2-3 boru donanımları ile ilgili "Keck" rampa kenetlerle ml / min.
  6. Mikromanipülatörler kendi headstages hem elektrotlar monte edin. Mikromanipülasyon ile oosit elektrot penetrasynların gerçekleştirin.

3. Doğrudan Mechanosensitivity Patch Kelepçe incelenmesi

"> Pipet hazırlanması GΩ yapışma oluşumu ve on-hücre ya da kesilmiş modlarının oluşumu da dahil olmak üzere, yamalı kenetleme ve temel yöntem Hamill'e olanlar et al. 36 ve Conn 32 bulunmaktadır.

  1. 98 mM KCI, 1 mM MgCI2 ve 10 mM K +-HEPES, pH 7.2 ile ucunda bir ~ 1 mikron çaplı bir delik (kabarcık sayısı 5-6) borosilikat cam pipetler doldurun.
  2. Ayrıca, bir manometre, bir 5 ml şırıngaya bir plastik boru boyunca ve bir T-bağlantı ile yama kelepçe pipet takın. Elektrot ve manometre çıkışları hem işlemek için bir bilgisayar kullanın. 10 kHz veri Edinme ve daha sonra analiz için 1 kHz sekiz kutuplu Bessel filtre aracılığıyla oynatmak.
  3. Farklı yamalar tekrar tekrar aynı oosit kesilebilir. Bu uygulama TRPV4 moleküler aktivitesinin incelenmesi daha verimli ve güvenilir kılar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tipik luminometri kullanılarak bir deneyde, 400-1,200 mOsM'den aşağı hipotonik şok, bir dizi 1400 mOsm'de kültür 20 ul farklı düşük ozmotik basıncı şok çözümler 200 ul eklenmesi ile elde edilir. Maya hücreleri boş p416GPDV4 plazmid veya iyon filtre bir mutasyon (Şekil 1) 24 ile TRPV4 geni içeren bir transforme: Deneysel RLU iki negatif kontroller ile karşılaştırıldığında zaman TRPV4 aktivitesi belirgindir.

Tipik iki elektrotlu voltaj-kelepçe deneyde, oosit ilk (mM olarak) ihtiva eden bir akıcı izotonik banyo çözeltisi içinde banyo edilir KMeSO 66 4, 1.8 Ba (MESO 4) 2, 5 K +-HEPES (pH 7.2) ve 100 sorbitol. Tepe akımları, -20 mV her 10 saniye bir tutma potansiyelinden +20 mV'a kadar, 100 msan test atımları sonunda değerlendirilmektedir. Hipotonik tepkiler için akış sorbitol dışında benzer bir çözeltisine değiştirilir. T Onun hipotonik yanıt sorbitol dönüşü tersine çevrilebilecek hem de TRP-kanal blokeri rutenyum kırmızısı (Şekil 2A) ile blockable olduğunu.

Yamayı ve pipet doldurma çözeltisi banyo çözeltisi aynı (98 mM KCI, 1 mM MgCI2 ve 10 mM K +-HEPES, pH 7.2) vardır, yani tipik bir patch-clamp deneyde, simetrik çözeltisi kullanılır. Burada, bir sıçan-TRPV4 ifade oosit kesilip iç-yama +50 mV tutulur. Emme atımlar şırıngadan oluşturulur. Kısa emiş, süresi msn yüzlerce, oosit zar 37 ve heterolog ifade TRPV4 (Şekil 2B) 14 ~ 90 pS iletkenlik yekpare için ~ 40 pS iletkenlik yekpare yerli ortaya çıkarmak, mm Hg onlarca uygulanır.

les/ftp_upload/50816/50816fig2.jpg "width =" 600px "/>
Şekil 1. Sıçan TRPV4 hipotonik şok maya cevap veren ifade. (A) Deneysel yöntem gösteren bir diyagram. (B) A 750 mOsM'den hipotonik şok (ok başları) TRPV4 transformantlarında (göreli ışık birimleri, RLU) büyük bir lüminesan bir artış tetikler değil, boş bir plasmid ya da plazmid transformantlarında iyonu filtre (M680K) hipotonik şok ve tepe tepki arasında. (C) bir doz-yanıt ilişkisi içinde bir mutasyona sahip bir TRPV4 taşıyan (+ ortalama ± SD n = 3). 2,4 x 10 6 hücre her 24 Ölçümleri. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

0px "/>
Şekil 2. TRPV4 aktivite elektrofizyolojik incelemeleri heterolog Xenopus oosit ifade edilmiştir. Bir iki elektrodlu voltaj kelepçe ile incelendi hipotonik uyaranlara (A) Tüm-oosit makroskopik akım tepkiler. Vahşi tip TRPV4 çok yüksek seviyelerde ifade eden, bir oosit Tepe akımları kaldırma tepki olarak (ek), (-20 ° C ila +20 mV her 10 saniye için) 100 msn bir voltaj adımları üzerine (5 gün cRNA 40 ng enjeksiyonundan sonra) 250 mOsm banyo çözeltisi (açık çubuklar) ve 3 uM rutenyum kırmızısı (; dolu çubuk RuR) eklenerek 100 mM sorbitol. Belirgin izotonik çözelti ya da kanal blokeri (RuR) ilavesinden dönüş üzerine hipotonik uyaranlara ve düşüşler üzerine tekrar tepe akım artışlardır. (B) bir kumanda kelepçesi altında görülen zar streç tarafından vahşi tip TRPV4 doğrudan aktivasyonu. Acti gösteren bir TRPV4-expreesssing oosit kesilip bir yama, gelen ortalama kalitede ham izleri bir örnek60 mmHg emme (alt iz) tarafından vation +50 mV düzenlenen bir eksize iç-yama uygulanan. Üstteki iz kapalı (C) arasındaki üniter bir akım geçişi göstermek için daha hızlı bir zaman üssünde görüntülenir ve iki açık düzeyleri (O 1 ve O 2) 14. Olduğunu büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Giriş bölümünde belirtildiği gibi, yaygın TRPV4 fonksiyonlarını incelemek için kullanılan yöntemler bazen tutarsızlıklara ve tartışmalar sonuçlandı. Burada açıklanan yöntemlerin iki set bazı avantajlar sunmaktadır ve mevcut yöntem tamamlayabilir. Biz TRPV4 sadece çalışmaları tarif ederken, bu buluşun metodları ve başka iyon kanalları incelemek için uzatılabilir.

1.. Maya luminometri Yöntemleri

Tomurcuklanan maya lipid bileşimin 30 etkileyen mutasyonlar ile hassaslaştırılır hipo-ozmotik şoka yerel bir Ca2 +-akışı tepki veriyor. Bu sinyal, dış EGTA ile silinebilir. Bu kenetleyici Ancak, kanal, bir iç zar içinde eksprese olduğunu gösteren, heterolog ifade TRPV4 24 gelen sinyali silmez, büyük olasılıkla Ca2 + ozmotik üzerine sitoplazma içine salındığı endoplazmik retikulum, bu şok. Heterolog ifade Trafikkanallar maya çalışılmamıştır. Bu yöntemi diğer TRP kanalları veya diğer varsayılan mechanosensitive kanallarının çalışmaya uzatılmalıdır, şelasyon testi yapılacak ve yerel sistemin varlığı akılda gerekiyor.

2A. Iki-elektrotlu voltaj-kıskaç

Patch-clamp deney farklı olarak, iki elektrotlu voltaj-kelepçe deney vitellin zarfın uzaklaştırılmasından önce, sağlam oosit üzerinde gerçekleştirilir. Mikroskopik inceleme ve kapasitesi değerleri her ikisi de plazma zarı düzgün küresel değil, yüksek vitellin zarfın nispeten inelastik kürenin altında invajine olduğ olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, hyponicity kaynaklanan mekanik stres genişletilmiş bir küresel plazma zarının sadece izotropik enflasyonist gerilim değildir. Uzak th kurulan sitoplazmik ekten önleyici vitellin zarf ve / veya karşı zarın presleme gelen gerilme muhtemel sonuçlarıartan ozmotik basınç e yüzü.

TRPV4 ekspresyonu ve muhtemelen diğer bazı kanallar ki tahminen bu, Ca 2 + kaçağı için, oosit için zehirlidir. Bu sürekli kanal blokeri, rutenyum kırmızısı mevcudiyetinde TRPV4-cRNA enjeksiyonundan sonra oositin kuluçkalanması bu nedenle önemlidir. TRPV4 ifade derecesi, deney tamamen kontrol altında olmadığı, değişkenlik gösterir. "Kazanç-fonksiyon" mutant TRPV4 kanalları, önemli kendiliğinden açılmasını gösteriyor ki bu, sistematik olarak daha önceki enjeksiyondan sonra yabani tip meslektaşı 23 daha ifade edilmiştir.

2B. Patch Kelepçe

Xenopus oosit içeri doğru yönde düzelten bir doğal mechanosensitive kanalı (~ 50 pS içe doğru, ~ 10 pS dışa doğru) ifade eder. Bir çalışma, TRPC1 37 salgılanma olduğunu göstermektedir. Bu sürekli dile yerli kanal TRPV4, hetero için bir kalibrasyon sağlarve otolog ifadesi her zaman başarılı yamalar gözlenen olmayabilir.

TRPV4 karşılaşma olasılığı tipik olarak 3-4 gün cRNA enjeksiyonundan sonra, kuluçkalama daha uzun bir süre sonra oositlerde daha yüksek olma eğilimindedir. Devam etmek için verimli bir şekilde ilk oosit aynı numune yamaları almadan önce vitellin zarfı kaldırmak için devam sonra kendiliğinden TRPV4 makroskopik akımını ifade edilir ve emin, iki-elektrot-gerilim-kelepçe deneyi (yukarıda) gerçekleştirmek için oosit. TRPV4 faaliyetleri yakalama olasılığı da daha büyük bir delik (kabarcık sayısı 6-7) ile pipetleri üzerine monte edilmiş "macropatches" kullanılarak geliştirilebilir. Bu pipet 32 parlatma yangın GΩ mühür ulaşmada yardımcı olabilir gibi görünüyor. Conta oluşumundan sonra eksize yama, çok yüksek bir direnç gösterebilir, çok az, genellikle biyolojik zarları ile ilişkili ses, ve herhangi bir yerel kanal aktivitesi. Bu büyük olasılıklaBir çift zar oluşumu dicates. Kısa bir hava pozlama, geçici mikromanipülasyon tarafından menisküs yukarıdaki pipet kaldırarak genellikle istenmeyen ek bir katman kırabilir. Seçenek olarak ise, dış tabaka yavaşça banyosu içinde süspansiyon haline getirilmiş, sertleştirilmiş silikon contanın bir iplik karşı pipet deliğini dokunarak kaldırılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Biz mükemmel teknik yardım için Andrea Kremsreiter teşekkür etmek istiyorum. Madison - Laboratuvarımızda çalışma NIH GM096088 ve Wisconsin Üniversitesi Vilas Trust tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vapor Pressure Osmometer Wescor Wescor 5500 Logan, UT, USA
Sirius Single Tube Luminometer  Titertek-Berhold Sirius Huntsville, LA, USA
Microplate luminometer Titertek-Berthold Mithras LB940 Huntsville, LA, USA
Luminometry software Titertek-Berthold MikroWin2000 Huntsville, LA, USA
Patch clamp and software Axon Instrument HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software Union City, CA, USA
Manometer Bio-Tec Winooski, VT, USA
Pipette puller Sutter Instrument Co Model P-97 Novata, CA, USA
Microinjector Drummond Scientific Nanoinject II Broomall, PA, USA
Luciferin coelenterazine Invitrogen Carlsbad, CA, USA
T7 RNA polymerase reaction Ambion mMessage mMachine Austin, TX, USA
Gentamicin Sigma  
Ruthenium red  Sigma  
Micropipettes  Drummond 100 microliter micropipets Broomall, PA, USA
High-fidelity PfuUtra polymerase  Stratagene La Jolla, CA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
  2. Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
  3. Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
  4. Nilius, B., Voets, T. The puzzle of TRPV4 channelopathies. EMBO Rep.. , (2013).
  5. Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
  6. Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).
  7. Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. Trp12, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).
  8. Delany, N. S., et al. Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2. Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).
  9. Rock, M. J., et al. Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia. Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).
  10. Krakow, D., et al. Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).
  11. Camacho, N., et al. Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia. Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).
  12. Voets, T., et al. Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4. J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).
  13. Watanabe, H., et al. Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2. Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).
  14. Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force. J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).
  15. Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways. J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).
  16. Watanabe, H., et al. Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels. Nature. 424, 434-438 (2003).
  17. Vriens, J., et al. Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).
  18. Vincent, F., et al. Identification and characterization of novel TRPV4 modulators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).
  19. Willette, R. N., et al. Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).
  20. Thorneloe, K. S., et al. An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  21. Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation. Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).
  22. Lamande, S. R., et al. Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet. Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).
  23. Loukin, S., Su, Z., Kung, C. Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations. PLoS One. 6, (2011).
  24. Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids. FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).
  25. Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4. J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).
  26. Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).
  27. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
  28. Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  29. Denis, V., Cyert, M. S. Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).
  30. Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast "deletome" analysis. FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).
  31. Loukin, S. H., Zhou, X. -L., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  32. Conn, P. M. Methods in Enzymology. 294, Academic Press. (1999).
  33. Iverson Rudy, L. E. Methods in Enzymology. 207, Harcourt Brace Jovanovich. 279-298 (1992).
  34. Loukin, S. H., et al. Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1. EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).
  35. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. , (2008).
  36. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  37. Maroto, R., et al. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).

Tags

Temel Protokol Sayı 82 Eukaryota Arkea Bakteri Yaşam Bilimleri (Genel) Mechanosensation İyon kanalları Yağlar yama kelepçe, maya luminometri kuvvet algılama gerilim kelepçe TRPV4 elektrofizyoloji
Maya lüminometrik ve<em&gt; Xenopus</emTRPV4 Moleküler Mechanosensitivity arasında&gt; Yumurta Elektrofizyolojik Sınavları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X.,… More

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X., Kung, C. Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4. J. Vis. Exp. (82), e50816, doi:10.3791/50816 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter