Introduction
Suivi de l'activité neuronale chez un animal d'alerte activement engagé dans une tâche comportementale est essentiel pour comprendre la fonction et l'organisation du système nerveux. Enregistrement extracellulaire de l'activité électrique des unités neuronales simples a longtemps été un outil de base des systèmes neurosciences et est encore largement en usage à l'heure actuelle. Une variété de types et de configurations électrodes sont disponibles selon les exigences scientifiques et techniques d'une expérience particulière. Chroniquement implanté Microdrive ou réseaux d'électrodes sont souvent utilisés chez les animaux se déplacent librement, y compris les oiseaux, les rongeurs et les primates non humains 1-4. Alternativement, pénétrations aigus avec métal ou en verre microélectrodes via un micromanipulateur externe sont souvent utilisés pour enregistrer à partir d'animaux anesthésiés ou tête-retenu. Verre électrodes de micropipette ont l'avantage qu'ils peuvent être utilisés dans la juxtacellulaire ou "cellule attachés" configuration à isoler sans ambiguïté laactivité de neurones individuels sans les complications de pic post-hoc de tri 5. Ces électrodes permettent en outre l'enregistrement à partir de cellules ou les emplacements identifiés anatomiquement, car ils peuvent être utilisés pour injecter des petits dépôts de colorants traceurs ou neuro-anatomiques, ou même de remplir la cellule individuelle enregistrée. Cette configuration a été appliquée avec succès dans les rats, les souris et les oiseaux 6-10. La technique décrite ici se concentre sur le suivi juxtacellulaire et des dépôts de colorant extracellulaires en alerte, les rats de tête-retenu. Notez que contrairement à cellule unique juxtacellulaire remplit, ces dépôts de colorants ne fournissent pas d'informations sur la morphologie cellulaire ou projections axonales 11, mais ils permettront localisation anatomique exacte à environ 50 um et, surtout, avoir un rendement significativement plus élevé chez les animaux d'alerte. Les informations concernant une seule cellule remplit juxtacellulaire est néanmoins fourni comme une stratégie alternative pour l'étiquetage anatomique.
En bref, leprotocole se compose de trois grandes phases. Dans la première phase, le rat est acclimaté à la retenue du corps dans une chaussette de tissu (Figure 1) sur une période de 6 jours. Dans la deuxième phase, un dispositif de retenue de la tête (Figure 2) et la chambre d'enregistrement sont implantés chirurgicalement tels que le rat peut être maintenue dans le plan stéréotaxique au cours de plusieurs sessions d'enregistrement suivantes (figure 3); cette procédure permet à l'expérimentateur de cibler des régions sous-corticales du cerveau pour l'étude électrophysiologique basée sur coordonne référence standard 12. La troisième phase consiste à placer le rat dans un gabarit approprié pour effectuer les expériences comportementales et électrophysiologiques (figure 4), la construction de l'électrode à partir d'un tube capillaire en quartz (Figure 5), la réalisation d'enregistrements de neurones qui isolent juxtacellulaire sans ambiguïté les unités individuelles 6-9, et marquant les Locati anatomiquessur le site d'enregistrement avec Chicago Sky colorant bleu (figures 6 et 7). Les enregistrements ont été effectués avec la surveillance comportementale simultanée; Cependant, les détails techniques du comportement dépendront des objectifs scientifiques de chaque expérience et sont donc au-delà de la portée d'un protocole unique. Après achèvement de la procédure expérimentale, qui peut être répétée sur plusieurs jours, l'animal est euthanasie. Le cerveau est extrait et traitées selon la norme neuroanatomiques techniques utilisant soit lumineux champ ou microscopie à fluorescence.
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Protocol
Les protocoles expérimentaux ont été réalisés sur des rats femelles Long Evans (250-350 g) conformément aux soins des animaux et de l'utilisation des lignes directrices prescrites par le fédéral et ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'Université de Californie à San Diego.
1. Acclimatation Rat Body retenue
REMARQUE: Placez le rat sur un régime restreint. Nourrir le rat une fois par jour immédiatement après chaque séance quotidienne de manutention se acclimater le rat à la retenue (décrit ci-dessous). Fournir suffisamment de nourriture pour maintenir l'animal à 80% de son poids initial. Ce montant est d'environ 6 grammes de nourriture par jour pour une femme de 250 g Long Evans rat.
- Acclimater le rat à être manipulés par les humains. Freiner doucement le rat à la main pour des périodes d'environ 5 secondes toutes les 30 secondes. Pour ce faire, pendant 15 min par jour sur deux jours consécutifs. Surveiller les rats quotidiennement les signes de stress pendant la période de formation. Les signes comprennent mal in réponse à la retenue, la vocalisation, et la dent-bavardage.
- Sur le 3 ème jour, placez le rat dans un corps-contraignante chaussette en tissu (Figure 1) pendant 15 minutes par jour pendant deux jours consécutifs.
- Sur la 5 ème jour, placer le rat à l'intérieur de la chaussette, et placer la chaussette à l'intérieur d'un tube rigide sur le gabarit expérimental (Figure 4). Laissez le rat dans le tube pendant 15 min par jour sur deux jours consécutifs.
- Nourrir le rat immédiatement après chaque session de formation. A la fin de la session précédente (6 ème jour) donner libre accès à la nourriture. Sélectionnez pour l'implantation que les rats qui ne présentent pas de signes de stress excessif sur la dernière journée de formation.
REMARQUE: Bien que la sélection de rats pour l'implantation est subjective, dans nos mains plus de 90% des rats ont été trouvés pour être sensible à l'accoutumance et capable de subir l'implantation.
2. Implanter le Mécanisme chambre d'enregistrement et d'appui-tête
- Faire un reConférence fil par soudure fil d'acier inoxydable nu à un connecteur à broches. Coupez le fil de telle sorte que 3-5 mm vestiges découverts par la broche. Autoclave le fil de référence, avec tous les outils chirurgicaux.
- Administrer la kétamine / xylazine. Administrer 95 mg / kg de kétamine mélangée avec 5 mg / kg de xylazine par voie intraperitoneale. La dose initiale dure 1½ à 2 heures. Compléter l'anesthésie tous les 30 à 45 min par la suite, au besoin. Lubrifier les yeux de l'animal avec une pommade ophtalmique.
- Vérifier le réflexe de retrait de pointe pour déterminer le plan de l'anesthésie, et de maintenir l'anesthésie nécessaire.
- Placez le rat dans un cadre de maintien stéréotaxique avec des barres d'oreilles (Figure 3A). Raser les cheveux sur la tête et désinfecter la plaie avec de la povidone-iode (solution à 10%). Prenez soin d'insérer les barres d'oreilles de manière appropriée afin qu'ils ne endommagent pas le tympan. barres d'oreille avec bouts arrondis sont préférables.
- Faire une incision avec un envi de scalpelmativement le long de la ligne médiane du crâne par rapport au niveau rostro-caudale des yeux à l'arrière de l'oreille. Utilisez des ciseaux pour couper et enlever une bande de 2-3 mm de la peau de chaque côté de l'incision.
- Grattez le périoste pour exposer la surface du crâne sur les crêtes latérales. Couvrir le crâne exposé avec fine couche de colle.
- Percez un petit trou, avec un diamètre légèrement inférieur à 0-80 vis, en utilisant une perceuse bavure ½ mm de diamètre (voir la section Matériaux). Percer le trou postérieur immédiatement à l'endroit où le fil de suture conforme à la bregma arête latérale, et à un angle de 30-45 ° dans le crâne, de sorte que la vis peut entrer avec le plus haut latérale de la partie inférieure.
- Visser une vis 0-80 de la machine à fond plat dans le trou (environ 3 tours), à 30-45 °. Veillez à ne pas visser trop profondément pour éviter d'endommager le tissu cérébral sous-jacent.
- Répétez cette procédure pour 6 vis supplémentaires dans la configuration représentée
- Placer une aiguille de seringue dans le manipulateur de stereotax. Mesurez à partir de la suture de bregma, et faire une brèche dans le crâne avec l'aiguille près, mais en dehors de l'emplacement de craniotomie souhaité, comme une marque de référence.
NOTE: Dans cette démonstration, les coordonnées stéréotaxiques de la marque sont de 3 mm et 1 mm postérieure latérales à la suture de bregma. - Marquer la dent avec un marqueur permanent. Notez les coordonnées stéréotaxiques de la marque, car il servira de point de référence stéréotaxique (Figure 3B).
- Faire une craniotomie centrée sur les coordonnées désirées (3 mm et 3 mm postérieur au bregma latérales dans cet exemple). Laissez la dure-mère intacte. Couvrir avec la craniotomie liquide céphalo-rachidien artificiel modifiée (NaCl 125 mM, glucose 10 mM, HEPES 10 mM, 3,1 mM de CaCl2, 1,3 mM de MgCl2, pH 7,4) 13 (figure 3C). Couper un tube de 0,2 ml de centrifugeuse à 4-5 mm de longueur, et couper le capuchon. Placer le tube sur le crâne et centrer sur la craniotomie.
- Appliquer le ciment dentaire autour de la partie inférieure du tube pour sceller le fond du tube au crâne. Veillez à ne pas fuir ciment dans la craniotomie exposée (Figure 3D).
- Percez un autre petit trou (environ ½ mm de diamètre) dans la plaque crânienne controlatéral et insérez soigneusement le fil de référence. Construire le fil de référence en soudant une broche qui se interface avec l'amplificateur d'enregistrement à l'extrémité du fil (voir la section de l'équipement). Ne déplacez pas le fil de référence une fois qu'il est dans le cerveau, car cela pourrait causer des dommages.
- Appliquer colle au trou dans lequel le fil a été inséré. Ce sera le sceau de la broche et le fil en place temporairement.
- Mélanger les deux parties du kit de gel de silicone (voir la section Matériaux) en parties à peu près égales. Attendez deux minutes pour mélanger et fill le tube de centrifugeuse environ ⅓ complète avec gel.
- Joindre un angle droit après pince (voir la section Matériaux) à la barre de retenue de la tête. Attacher la plaque de tête (figure 2A) à la barre de retenue (figure 2B) à un angle de 45 ° en tangage afin que le fond de la plaque est du côté du nez de l'animal. Il est utile d'utiliser un inclinomètre pour régler l'angle de tangage pour correspondre à celle du gabarit expérimental (Figure 4).
- Fixer la barre de maintien au bras stereotax manipulateur pour que la barre est parallèle aux barres d'oreilles. Abaisser la barre et la plaque de sorte que la plaque est postérieure de la suture lambda et en avant de la vis la plus caudale.
- Saisissez la tête-boulon avant (un plot 8-32 ou à vis, voir la section des matériaux) à environ 45 ° avec un mains bras aider et pince, de sorte que la tête de la vis orientée vers le bas et vers la queue de l'animal. Abaisser la vis jusqu'à ce qu'il touche la fourmierior 0-80 vis (Figure 3F, G).
- Fixez le boulon et la plaque en place avec de l'acrylique dentaire. Appliquer acrylique dentaire autour des têtes de vis à os, broche de référence, et autour des côtés du tube de centrifugation. Attendez environ 10 min pour le acrylique dentaire pour sécher (Figure 3H).
- Appliquer une couche de ciment dentaire autour des bords de l'acrylique dentaire, la cimentation peau à l'implant. Attendre que le béton sécher.
- Poke plusieurs trous dans le bouchon du tube de centrifugeuse, et placer le bouchon sur le tube.
- Retirez la main pince aider. Puis retirez délicatement la barre de la stereotax maintien de tête, puis retirer la plaque de la tête de la barre (figure 3I).
- Retirer l'animal de la stereotax et administrer les soins et le suivi post-opératoire conformément à toutes les règles applicables, les règlements et les lois (par exemple, buprénorphine 0,02 mg / kg, tous les 8-12 h pour un minimum de 24h). Si l'inflammation se développe autour des bords de l'implant, appliquer une fine couche de pommade antibiotique au site affecté tous les jours jusqu'à résolu.
3. Suivi juxtacellulaire d'unités neuronales
- Tirer quartz tube capillaire sur un dioxyde de carbone micropipette extracteur laser (voir la section Matériel) avec des diamètres inférieurs à 1 um (figure 5A) d'extrémité.
Remarque: Les paramètres de chauffage varient en fonction de l'appareil particulier, et que le diamètre du col requis variera en fonction de la structure du cerveau d'intérêt. Pour les enregistrements dans le thalamus de rat, micropipettes ont cou allant de 5 à 7 mm. - Fixez la pipette en place sous un microscope contraste d'interférence différentiel (DIC) équipé d'objectifs de longue distance de travail. Utilisez la pâte à modeler pour maintenir la pipette en place sur la scène du microscope.
- Lentement, déplacez un bloc de verre (de 0,5 à 1 cm d'épaisseur; un morceau de verre utilisé pour making couteaux ultra-microtome est pratique) dans le champ de vue avec la pointe de la pipette. Utilisation du micromanipulateur stade, toucher doucement la pointe de la pipette sur le verre, et la casser. Répéter au besoin jusqu'à ce que le diamètre extérieur de la pointe de la pipette est entre 1-3 pm (Figure 5B, C). Assurez-vous que ces micropipettes ont des impédances entre environ 5-15 MQ.
- Préparer une solution saline extracellulaire (NaCl 135 mM, KCl 5,4 mM, 1,8 mM de CaCl2, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,2 avec NaOH) et ajouter 2 8% (p / v) de bleu de ciel Chicago. En utilisant une seringue avec une aiguille de 30 G ou plus petit, remplir la partie arrière de la pipette avec la solution. Sinon, pour une seule cellule étiquetage juxtacellulaire ajouter 2% (p / v) Neurobiotin ou amine dextran biotinylé (BDA-3000 ou BDA-10000) à la solution saline en place de Chicago Blue Sky.
- Placez le rat intérieur de la chaussette en tissu à l'intérieur du tube rigide sur un gabarit expérimental approprié (
- Fixez la plaque de tête retenue sur le rat à la pièce correspondante sur le gabarit. Pour ce faire, la broche d'abord la plaque appuie-tête en place, puis le fixer avec une vis 4-40. Assurez-vous d'attendre jusqu'à ce que l'animal est calme afin d'éviter l'application d'un couple excessif à la tête. Ensuite, placez un écrou 8-32 sur le boulon à tête de retenue de qui est implantée sur le rat. Visser ensuite une tige filetée en acier inoxydable à la tête boulon. Fixer la tige sur le dispositif expérimental de telle manière (Figure 4) qui peut être serré en place.
REMARQUE: Sécurisation de l'animal avec tête-vis ainsi que l'appui-tête plaque minimizes flexion de l'appareil d'enregistrement et améliore la stabilité. Dans la plupart des cas d'enregistrement peut commencer le premier jour de l'animal est le chef-retenu. Toutefois, si l'animal se agite excessivement ou vocalise, offrir une journée de formation d'habituation appuie-tête avant de commencer tout enregistrement. Dans ce cas, laissez l'animal sur le gabarit pendant 15 min, puis le replacer dans sa cage. Répétez cette étape le lendemain et continuer avec le protocole.- Ouvrir la chambre d'enregistrement et enlever le gel de silicone. Nettoyez la craniotomie en utilisant une pince fine si le tissu a ré-augmenté dans la craniotomie.
- Fixez la pipette à l'micromanipulateur motorisé, et branchez le préamplificateur headstage.
NOTE: Dans la présente démonstration, un petit circuit de relais sur le headstage permet de basculer entre les fils amplificateur de plomb et une source de courant externe avec niveau élevé de conformité (figure 6A-C). Notez que certains amplificateurs ont une appropriée source intégrée élevé de conformité(Voir les sections de discussion et des matériaux).- Utilisez le micromanipulateur motorisé pour se déplacer la pointe de la pipette à la marque stéréotaxique identifié dans la chambre d'enregistrement. Notez les coordonnées de cet emplacement. Veillez à ne pas briser la pointe de la pipette sur le crâne.
- Déplacer la pipette à l'emplacement d'enregistrement souhaité dans les axes antérieur-postérieur et médio-latérales. Puis avancer la pipette ventralement à travers la dure-mère jusqu'à ce qu'il soit environ 500 um dorsale à l'emplacement d'enregistrement prévue.
- Avancer lentement la pipette tout en écoutant pour enrichir les événements sur un moniteur audio de la tension amplifiée enregistré entre la pointe de pipette et le fil de référence. Une fois les événements de dopage sont identifiés, continuent à déplacer le 0-100 um pipette jusqu'à déviations de tension allant positifs supérieurs à environ 500 mV sont observées.
NOTE: La résistance de l'électrode va augmenter par un facteur d'environ 1,5 à 10 WHen ce cas.- Commencer l'enregistrement une fois par unité a été isolé que selon l'étape 3.11, avec toutes les autres mesures comportementales et physiologiques d'intérêt. Dans la présente démonstration, mouvements de vibrisses auto-générés sont surveillés avec vidéographie haute vitesse (voir la section des matériaux).
- Pour marquer le site d'enregistrement, passer l'électrode conduit à se connecter à la source de courant. Il ya plusieurs façons de le faire, en utilisant soit un circuit de relais (figure 6A - C), un haut-source de courant de l'amplificateur, ou manuellement (Figure 6D, voir l'étape 3.8 et discussion). Passez -4 uA avec 2 impulsions sec au cycle de service de 50% pour 4 min pour injecter iontophorèse Chicago Blue Sky à travers la pipette.
- Tuer et perfuser l'animal après plusieurs procédures d'étiquetage selon la pratique standard. Section du cerveau et de contraste que nécessaire pour identifier la localisation anatomique de l'enregistrement se asseoire. Counterstain le tissu pour la cytochrome oxydase réactivité selon 14. Sinon, identifier les dépôts de Chicago ciel bleu en utilisant la microscopie de fluorescence.
NOTE: Pour différencier précisément entre les différentes unités marquées il est important que toutes les étiquettes sont fabriquées avec la même pipette sur le même jour, sans desserrer la pipette entre les étiquettes. Dans ce cas, les sites d'enregistrement peuvent être différenciés par leurs positions relatives en histologie post-hoc avec les coordonnées du manipulateur relevées de chaque site (voir l'étape 3.9). Pour une identification non ambiguë, marquer les étiquettes au moins 200 pm les unes des autres, et pas plus de 05/03 étiquettes par région du cerveau. - Fixez la plaque de tête retenue sur le rat à la pièce correspondante sur le gabarit. Pour ce faire, la broche d'abord la plaque appuie-tête en place, puis le fixer avec une vis 4-40. Assurez-vous d'attendre jusqu'à ce que l'animal est calme afin d'éviter l'application d'un couple excessif à la tête. Ensuite, placez un écrou 8-32 sur le boulon à tête de retenue de qui est implantée sur le rat. Visser ensuite une tige filetée en acier inoxydable à la tête boulon. Fixer la tige sur le dispositif expérimental de telle manière (Figure 4) qui peut être serré en place.
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Representative Results
Unités neuronales dans ventrale médiale postérieure (VPM) du thalamus encodage la phase de mouvement de vibrisses pendant l'auto-généré fouettant 15,16. Figure 7A montre échantillon activité de dopage d'une unité thalamique VPM comme un rat est fouettant activement. Figure 7B montre un histogramme de pic fois alignées sur la phase instantanée du mouvement vibrisses 17. Il ya plus de pointes pendant la phase de rétraction de fouettant. Après l'enregistrement, l'emplacement de l'unité a été marqué par iontophorèse de colorant bleu ciel Chicago, comme représenté sur la figure 7C. Le tissu est ensuite contre l'activité du cytochrome oxydase pour révéler les frontières neuroanatomiques de VPM thalamus. Une version similaire de ce protocole a été récemment appliqué pour surveiller l'activité neuronale liée à plusieurs unités en fouettant (10-20 um conseils diamètre de pipettes) dans les noyaux du tronc cérébral spécifiques 18.
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Figure 1: Tissu retenue chaussette (A) Photographie d'une chaussette de rat avec des cordons et fermoirs de cordon.. La petite extrémité est placée étroitement au corps du sternum, et l'autre extrémité autour de la queue. (B) modèle de conception pour la chaussette dans le panneau 1A. Les dimensions sont en pouces.
Figure 2: la conception mécanique du dispositif de retenue de la tête (A) la conception mécanique d'une plaque de retenue de la tête de précision pour les rats.. Les dimensions sont en pouces. (B) de la conception mécanique d'une barre de retenue de la tête pour une utilisation avec la plaque dans le panneau 2A. Le protocole nécessite deux de ces pièces, monté à l'aide des pinces de poste à angle droit au même angle de tangage._blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Procédure chirurgicale (A) de rat dans un cadre de maintien stéréotaxique (protocole de l'étape 2.4).. (B) du site opératoire avec des vis implantées et marques crâniens (protocole étape 2.10). (C) du site chirurgical avec une craniotomie (protocole étape 2.12). (D) du site opératoire avec la chambre d'enregistrement (protocole de l'étape 2.14). (E) du site chirurgical avec le fil de référence et du gel de silicone (protocole de l'étape 2.17). (F, G) site opératoire avec plaque de retenue de la tête et un bar maintenu en place (protocole étape 2.20). (H) du site opératoire avec plaques et barres cimenté en place (protocole étape 2.21). (I) l'appuie-tête final et enregistrement impl de chambrefourmi (protocole étape 2.24). Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Gabarit expérimental Schéma de rat dans le gabarit mécanique pour des expériences de suivi électrophysiologiques et comportementales (protocole étapes 3.5 à 3.6). Le gabarit utilise la barre et la plaque à la figure 2.
Figure 5: Micropipette construction d'électrode (A) Micrographie d'une micropipette ininterrompue (protocole de l'étape 3.1).. La barre d'échelle est aussi dans le panneau C. (B) micrographie de la micropipette ininterrompue et le bloc de verre sous microscope (protocole étape 3.2).La réflexion de la pointe peut être vu dans le verre. La barre d'échelle est aussi dans le panneau C (C) micrographie de la micropipette cassé (protocole de l'étape 3.3). (D) micrographie de la pointe de la micropipette ininterrompue dans la région encadrée du panneau A. Barre d'échelle est aussi dans le panneau E. (E) micrographie de la pointe de la micropipette cassée dans la région encadrée de panneau C. Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6:. Équipement pour la commutation entre l'amplificateur et source de courant (A) Configuration pour passer les fils de l'amplificateur à la source de courant via un relais magnétique (en option). Une carte de circuit imprimé contenant le commutateur de relais commandé en tension est attached à l'étage de tête de l'amplificateur. (B) Mise en page pour la carte de circuit imprimé dans le panneau 6A. Le conseil relie les fils de l'amplificateur et la source de courant conduit à des broches d'entrée du relais, et l'électrode conduit à des broches de sortie. L'électrode est connectée soit à la source de courant ou l'amplificateur en appliquant une ou l'autre 0 ou 5 V pour les broches de commande de relais. Vue de dessous. Les dimensions sont en pouces. (C) Vue de dessus du modèle de la carte dans le panneau 6B. (D) Setup pour passer les fils de l'amplificateur à la source actuelle manuellement (en option) nécessite un support de pipette ouvert et câble flexible comme ceux montrés (voir aussi: section Équipement). Cette approche est une alternative au circuit de relais dans les panneaux 6A-C. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: Dispositif expérimental et les résultats représentatifs (A) Spikes et le mouvement de vibrisses d'une unité (protocole de l'étape 3.12).. (B1) normalisé vibrisses position en fonction de phase dans le cycle de fouet. Chaque fouet est normalisé de telle sorte que la position la plus caudal pendant le fouet est défini comme étant zéro et la position la plus rostrale définie comme étant une. La trajectoire représente la position normalisée en fonction phase instantanée dans le cycle de fouet 17. Tous les fouets identifiés sont superposées. (B2) Raster de la phase dans le cycle de fouet à laquelle se produisent des pointes. Chaque essai sur l'axe vertical représente un seul fouet. (B3) histogramme des taux de pic avec la phase du cycle égard de fouet pour la même unité. (C1) Lieu de Chicago Blue Sky colorant avec la cytochrome oxydase contre-coloration (protocole étapes 3.13 à 3.14). (C2 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Construction du gabarit expérimentale
La description des éléments mécaniques utilisés pour construire le gabarit expérimental (figure 4) est omis dans le protocole, car il peut être construit de différentes manières. Dans la présente norme de démonstration opto-mécanique pièces et colliers de fixation sont utilisés pour monter la barre d'appuie-tête et le tube de retenue de corps (voir la section des matériaux). Des parties similaires opto-mécaniques peuvent être utilisés pour monter le porte-électrode au micromanipulateur motorisé. Il est important que la barre de retenue de la tête sur le gabarit est monté dans le même angle d'inclinaison que la barre utilisée pour implanter la plaque appuie-tête pendant la chirurgie. Si l'électrode doit être déplacé le long des axes stéréotaxiques standards, puis l'axe des x de l'électrode doit se déplacer parallèlement à la barre appui-tête, et l'axe z perpendiculaire au plan contenant bregma et lambda et parallèle au sol ( Types d'amplificateurs appropriés et les sources de courant Il existe une variété de sources commerciales et des amplificateurs de courant qui peut être utilisé pour cette expérience. La plupart des amplificateurs d'électrophysiologie extracellulaires et intracellulaires avec un mode de pince de courant qui permettent d'atteindre un gain total de 1,000X sont appropriées. Pour iontophorèse de Chicago ciel bleu avec des pipettes de 1-3 pm, une source de courant qui peut fournir jusqu'à 10 uA avec une résolution d'au moins 1 uA et un respect d'au moins 100 V est recommandée. Notez que certains amplificateurs commerciales ont appropriée intégré sources de courant (voir pièces de rechange dans la section Matériaux). Toutefois, pour contourner l'exigence d'un amplificateur / source de courant appropriée combiné, un circuit de relais magnétique peut être fixée à l'extrémité avant de la headstage amplificateur (Figure 6A - C). Un tel circuit est optionnel mais il permet à l'expérimentateur de basculer entre l'amplificateur et une source de courant séparée pour délivrer des impulsions d'iontophorèse sans perturber physiquement l'électrode. Une approche alternative est de remplacer manuellement les fils conducteurs d'électrode avec ceux qui se connectent à la source de courant. Dans ce cas, il est préférable d'utiliser un porte-pipette qui ne enferme pas le top (fin ininterrompue) de la pipette, et d'utiliser souple fil de plomb (Figure 6D). Les mesures qui peuvent nécessiter la pratique répétées Il ya plusieurs étapes qui peuvent nécessiter la pratique à maîtriser. L'étape qui nécessite le plus de dextérité est briser la pointe de la pipette. Il est utile de peindre le bord du bloc de verre de visualiser le reflet de la pointe dans le verre. Alors on peut avancer lentement le bloc et la pipette jusqu'au bout satisfait à peine sa réflexion. Faire progresser la pipette ou un bloc trop vite peut briser la micropipette et de rendre le diamètre de la pointe trop large ou inégale. Nous vous recommandons d'utiliser des micropipettes en quartz, comme décrit dans le protocole. Quarts micropipettes pénétrer efficacement dure de rats intacts dans craniotomies chronique préparés sans tordre ou de casser. Ceci élimine la nécessité pour la résection dure, ce qui peut entraîner des complications supplémentaires. Micropipettes de borosilicate avec cierges courts (<5 mm) pénètrent également la dure, mais leur utilisation est limitée à l'enregistrement des structures superficielles, comme le cortex cérébral ou striatum. Enregistrement à partir de structures plus profondes, en particulier dans le thalamus ou du tronc cérébral, nécessite de longues coniques micropipettes, de préférence quartz. Une deuxième étape qui nécessite la pratique ce est de positionner la pipette dans la configuration juxtacellulaire. Déplacement de la pipette trop rapidement lorsque près d'une cellule peut rompre la membrane. Par conséquent, il est utile de contrôler la résistance de la pipette à savoir lorsque la pointe se trouve à proximité d'une cellule putatif. Les variations de résistance de la membrane d'au moins deux fois indiquent que l'électrode ne peut êtrear toucher ou une membrane cellulaire. Pièges courants Il ya plusieurs points communs à garder à l'esprit. Tout d'abord, parce que la pointe de pipette est nécessairement très proche de la cellule, il est possible de "perdre" la cellule si la pipette se éloigne de la membrane. Il est également possible pour une cellule à devenir agité ou de rupture au milieu de l'enregistrement. Si elle le fait, la largeur de pic et cadence de tir peuvent augmenter et l'amplitude de pic peuvent diminuer. Ce sont des indications que la cellule peut être malsain. mouvement des animaux va inévitablement causer ces événements se produisent sur certains proportion des enregistrements, mais peut être minimisée par l'animal ayant bien habitué et en évitant de faire inutiles, bruits soudains ou causant des vibrations qui surprennent l'animal. Les modifications possibles au protocole Il est possible d'utiliser cette technique d'enregistrement et de marquage dans des contextes où l'animal esteffectuer une variété de tâches comportementales. Formation pour une tâche comportementale particulière peut être effectuée après la chirurgie, mais avant de commencer à enregistrer. L'activité neuronale peut être enregistré au moins 1-2 semaines après la préparation de la craniotomie, et les taches d'iontophorèse peut durer pendant au moins 2-3 jours. Ce laps de temps permet une variété de manipulations expérimentales, y compris l'enregistrement de plusieurs régions du cerveau pendant les sessions d'enregistrement distincts. La technique peut également être modifié pour remplir les neurones individuels à partir desquels les enregistrements sont effectués. Cette stratégie alternative de l'étiquetage juxtacellulaire de neurones simples nécessite la stabilité mécanique qui ne est atteinte que lorsque l'animal est encore ou anesthésié. Pour que cette stratégie de l'étiquetage, l'utilisation de BDA est recommandée Neurobiotin. BDA ne est pas dégradée par les protéases, ce qui augmente de manière significative le taux de succès au cours Neurobiotin. L'étiquetage devrait être tentée au cours de la dernière session d'enregistrement avant la perfusionanimal. Noter que les descriptions détaillées du protocole juxtacellulaire ont été décrits précédemment 6,19 .While la technique a été utilisée avec succès chez les rats alerte 8, dans notre expérience de l'injection iontophorétique de Chicago Blue Sky a un rendement nettement plus élevé. Notez que tant de Chicago Blue Sky et Neurobiotin ou BDA étiquetage peut être fait dans le même animal. Cette technique est susceptible d'être approprié pour une variété d'espèces. Notez que les enregistrements juxtacellulaire ont été réalisés dans les régions corticales de souris alerte 9, par exemple. Bien que la formation, la manipulation et l'appuie-tête sont des espèces spécifiques, les techniques particulières pour le suivi et l'étiquetage décrites dans ce protocole doivent restent les mêmes. Enfin, simplement en changeant la taille de la pointe et les paramètres des impulsions de courant de cette technique peut être utilisée pour l'injection iontophorétique d'une variété de molécules, y compris des agents pharmacologiques 20,21 pipette. Ainsi, latechnique pourrait également être utile pour les études neuropharmacologiques qui impliquent les animaux se comportent. Conclusions Ce est souvent le cas que les régions du cerveau qui sont extrêmement proches les unes peuvent avoir des propriétés et / ou fonctions 22 nettement différentes. Dans de tels cas, concernant l'activité de neurones individuels des régions anatomiquement définies au comportement organismal est essentiel pour comprendre les circuits neuronaux et le calcul. Le présent article montre un protocole d'accomplir cela en utilisant une combinaison de techniques standard et codage sensoriel décrit dans les neurones thalamiques VPM à titre d'exemple. La technique est susceptible d'être pertinent et réalisable dans une variété de régions du cerveau et paradigmes comportementaux dans différents modèles animaux. Il a un taux de réussite nettement plus élevés que seule étiquetage juxtacellulaire cellulaire dans 6,8 alerte animaux, et a l'avantage d'une meilleure résolution anatomique sur des techniques qui utilisent multi-eletableaux de ctrode ou Microdrive.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Fort Dodge | N/A | |
| Anased (Xylazine solution) | Lloyd Laboratories | N/A | |
| Betadyne (Povidone-Iodine) | CVS Pharmacy | 269281 | |
| Loctite 495 | Grainger Industrial Supply | 4KL86 | 20 - 40 cp cyanoacrylate |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Grip cement powder | Dentsply Intl | 675571 | For the base of the recording chamber |
| Grip cement liquid | Dentsply Intl | 675572 | For the base of the recording chamber |
| Silicone gel | Dow Corning | 3-4680 | |
| Jet denture repair acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Chicago sky blue | Sigma | C8679 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For perfusion and tissue fixation |
| Phosphate-buffered saline | Sigma | P3813 | For perfusion and tissue fixation |
| Cytochrome C | Sigma | C2506 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Diaminobenzidine | Sigma | D5905 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Rat sock | Sew Elegant (San Diego, CA) | N/A | Custom made, Figures 1, 4 |
| PVC tube 2 ½” | U.S. Plastic Co. | 34108 | Figure 4 |
| Subminiature D pins & sockets | TE Connectivity | 205089-1 | Figure 3 |
| Stainless steel music wire 0.010” diameter | Precision Brand Products, Inc. | 21010 | Figure 3 |
| Stereotaxic holding frame | Kopf Instruments | Model 900 | Figure 3 |
| Stereotaxic ear bars | Kopf Instruments | Model 957 | Figure 3 |
| Stereotaxic manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | Figure 3 |
| ½ mm drill burr | Henry Schein | 100-3995 | |
| Quiet-Air dental drill | Midwest Dental | 393-1600 | |
| Stainless steel 0-80 ⅛” screw | Fastener superstore | 247438 | Figure 3 |
| 0.2 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-407-8A | Figure 3 |
| Custom head-holding bar | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Custom head-holding plate | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Right angle post-clamp | Newport | MCA-1 | Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp. |
| 8-32 ¾” screw | Fastener Superstore | 240181 | For head-restraint, Figure 3 |
| 4-40 ¼” screw | Fastener Superstore | 239958 | For head restraint, Figures 3, 4 |
| Quartz capillary tubing | Sutter Instruments | QF-100-60-10 | Figure 5 |
| Carbon dioxide laser puller | Sutter instruments | P-2000 | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Microelectrode amplifier head stage | Molecular Devices | CV-7B | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems | Model 2100 | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Audio monitor | Radio Shack | 32-2040 | |
| Pipette holder | Warner Instruments | #MEW-F10T | Alternate parts: see Discussion, Figure 6A |
| Electrode lead wire | Cooner wire | NEF34-1646 | (optional), Figure 6D |
| Relay for amplifier head-stage | COTO Technology | #2342-05-000 | (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C |
| Digital video camera | Basler | A602fm | (optional) For behavioral monitoring, Figure 7 |
| Puralube vet ointment | Amazon.com, Inc | NC0138063 |
References
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