Introduction
Aktif bir davranış görev yapan bir uyarı hayvanda nöronal aktivitenin izlenmesi sinir sisteminin fonksiyonunu ve organizasyonunu anlamak için önemlidir. Tek nöronal birimlerinden gelen elektriksel aktivite Hücre dışı kayıt uzun sistemleri nörobilim bir elyaf araç olmuştur ve şu anda kullanımda yaygın hala gelmiştir. Elektrot türleri ve yapılandırmaları çeşitli özel bir deney bilimsel ve teknik taleplerine bağlı olarak mevcuttur. Kronik mikro sürücü implante veya elektrot dizileri genellikle kuşlar, kemirgenler ve insan olmayan primatlar 1-4 de dahil olmak üzere serbest hareket eden hayvanlar, kullanılır. Alternatif olarak, harici bir mikromanipülatör yoluyla, metal veya cam Mikroelektronlar akut girmeler genellikle anestezi veya kafa ölçülü hayvanlardan kaydetmek için kullanılır. Cam mikropipet elektrotlar juxtacellular kullanılan ya da "hücre bağlı" gibi bir avantajı vardır yapılandırma açıkça izole etmek için5 sıralama post-hoc başak komplikasyon olmadan tek nöronların aktivitesi. Onlar boya veya Nöroanatomik izleyiciler küçük mevduat enjekte, hatta tek bir hücre kaydedildi doldurmak için kullanılabilir gibi Bu elektrotlar daha, anatomik tanımlanan hücreleri veya konumlardan kayıt izin. Bu yapılandırma, başarılı bir fare, sıçan ve kuşlar 6-10 uygulanmıştır. Şu anda açıklanan teknik juxtacellular izleme ve uyarı hücre dışı boya mevduat, baş-ölçülü fareler üzerinde duruluyor. Bu boya mevduat hücre morfolojisi veya aksonal projeksiyonlar 11 hakkında bilgi vermemektedir doldurur juxtacellular ki aksine tek hücre Not, ancak uyarı hayvanlarda önemli ölçüde daha yüksek verime sahip, eleştirel, yaklaşık 50 um kesin anatomik lokalizasyon etkinleştirin ve. Yine anatomik etiketlenmesi için alternatif bir strateji olarak sağlanır doldurur juxtacellular tek hücre ile ilgili bilgiler.
Kısaca,protokol üç ana aşamadan oluşmaktadır. İlk aşamada, sıçan 6 günlük bir süre boyunca bir bez çorap (Şekil 1) vücut kısıtlama alıştırıldı edilir. İkinci aşamada ise, bir kafalık cihazı (Şekil 2) ve kayıt odası cerrahi sıçan birden sonraki kayıt seansları (Şekil 3) sırasında sterotaksik düzlemde muhafaza edilebilir şekilde implante edilir; Bu prosedür, standart referans 12 koordinatları dayalı elektrofizyolojik çalışma için beynin belirli alt-kortikal bölgeleri hedef deneyci sağlar. Üçüncü aşama açıkça tek birimleri 6-9 izole juxtacellular nöronal kayıtları, (Şekil 5) kuvars kılcal tüpten elektrot inşa, davranışsal ve elektrofizyolojik deneyleri (Şekil 4) yürütmek yapmak için uygun bir jig sıçan yerleştirerek içerir ve anatomik Locati işaretlemeChicago Sky Blue boya (Şekiller 6 ve 7) ile kayıt site üzerinde. kayıtlar eş zamanlı davranışsal izleme ile yapılır; Bununla birlikte, davranış teknik detayları Her deney bilimsel hedeflerine bağlı olacak ve tek bir protokol kapsamı dışında kalırlar. Birden fazla gün tekrar edilebilir deney prosedürünün tamamlanmasından sonra, hayvan kurban edilir. Beyin parlak alan veya floresan mikroskobu kullanarak standart nöroanatomik tekniklere göre ayıklanır ve işlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Federal reçete hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak - (350 gr 250) ve Kaliforniya San Diego Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi Deneysel protokoller dişi Long Evans fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir.
1. Vücut Kısıtlama için Rat acclimating
NOT: Bir kısıtlı diyet sıçan yerleştirin. Kısıtlama (aşağıda açıklanmıştır) sıçan gelmesini hemen her gün kullanım seansından sonra günde bir kez sıçan besleyin. Ilk ağırlığının% 80 hayvan korumak için yeterli yem sağlayın. Bu miktar 250 g ağırlığında dişi Long Evans fare için günlük besleme bölgesinin yaklaşık 6 gramdır.
- Insanlar tarafından işlenen sıçan alıştırıldı. Yavaşça yaklaşık 5 saniye her 30 sn süre için elle sıçan dizginlemek. 2 gün üst üste 15 dakika bir gün için bunu yapın. Eğitim süresince stres belirtileri günlük sıçan izleyin. İşaretler i mücadele dahilkısıtlama, seslendirme ve diş gevezelik n yanıtı.
- 3. günde, 15 dakika, iki arka arkaya günde bir, günde bir vücuda sınırlayıcı kumaş çorap (Şekil 1), sıçan yerleştirin.
- 5 inci gününde, çorap içine sıçan yerleştirin ve deneysel jig üzerine sert bir tüp (Şekil 4) içine çorap yerleştirin. 2 ardışık günde 15 dakika günde boru sıçan bırakın.
- Her antrenmandan hemen sonra sıçan besleyin. Son oturumda (6. gün) sonunda gıda sınırsız erişim sağlar. Implantasyon için son eğitim gününde aşırı stres belirtileri göstermeye yok sadece bu sıçan seçin.
NOT: implantasyon için sıçanların seçimi bizim elimizde, subjektif olmasına rağmen sıçanların% 90'ın üzerinde bağımlılığına duyarlı ve implantasyonu geçmesi mümkün bulundu.
2. Kayıt Odası ve Baş-kısıtlama Mekanizması implante
- Bir yeniden yapınBir pin konnektörüne çıplak paslanmaz çelik tel lehim teli fark olmamas. 3-5 mm kalıntıları pin tarafından ortaya böylece tel kesin. Tüm cerrahi aletler ile birlikte, referans tel otoklavlayın.
- Ketamin / ksilizin anestezi yönetme. 95 mg / intraperitoneal / kg ksilizin 5 mg ile karışık kg ketamin yönetme. başlangıç dozu 1 ½ 2 saat boyunca devam eder. Gerektiği gibi, her 30-45 dk sonra anestezi Supplement. Bir göz merhem ile hayvanın gözlerini yağlayın.
- Anestezi uçağı belirlemek ve gerekli anestezi korumak için ayak çekme refleksini kontrol edin.
- Kulak çubukları ile bir stereotaksik tutma çerçeve içinde sıçan yerleştirin (Şekil 3A). Kafasına saç tıraş ve povidon-iyot (% 10 solüsyon) ile yara sitesi dezenfekte edin. Onlar kulak zarını zarar vermez, böylece uygun kulak çubukları eklemek için özen gösterin. Künt uçlu kulak çubukları tercih edilir.
- Bir neşter Yaklafl bir kesi yapmakk kulak arkasına gözlerin postero-kaudal düzeyden kafatası orta hat boyunca. Kesme ve kesiğin iki tarafında bir deri 2-3 mm'lik şeridinin çıkarılması için makas kullanın.
- Yanal sırtlara dışarı kafatası yüzeyini açığa çıkarmak için periost kazınması. Superglue ince bir tabaka ile maruz kafatası örtün.
- ½ mm çaplı matkap çapak kullanarak, 0-80 vida biraz daha küçük çaplı, küçük bir delik delin (Malzeme bölümüne bakınız). Vida alt daha yanal üst gitmek böylece delik hemen Bregma dikiş yanal sırt karşılar, ve kafatası içine 30-45 ° açıyla yere posterior Matkap.
- 30-45 ° açıyla, delik (yaklaşık 3 tur) bir 0-80 düz taban makine vida vidalayın. Altta yatan beyin dokusu zarar vermemek için çok derin bir vida için dikkatli olun.
- Gösterilen konfigürasyonda 6 ek vidalar için bu işlemi tekrarlayın
- Stereotaksi manipülatör bir şırınga iğnesi yerleştirin. Bir referans işareti olarak, istenen kraniotomi konumu Bregma dikiş itibaren ölçün ve yakın iğne ile kafatası bir göçük yapmak, ama dışarıda.
NOT: Bu gösteri, markanın stereotaksik koordinatları 3 mm arka ve Bregma dikiş lateral 1 mm. - Kalıcı bir kalem ile göçük işaretleyin. Bir stereotaksik referans noktası olarak hizmet verecek gibi, marka stereotaksik koordinatlarını Not (Şekil 3B).
- İstenen koordinatları (3 mm posterior ve bu örnekte bregma yanal 3 mm) üzerinde merkezlenmiş bir kranyotomi yapın. Sağlam dura mater bırakın. Tadil edilmiş yapay beyin omurilik sıvısı kraniyotomi Kapak (125 mM NaCI, 10 mM glukoz, 10 mM HEPES, 3.1 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2, pH 7.4) içinde 13 (Şekil 3C). 4 0.2 ml santrifüj tüp Cut - uzunluğu 5 mm, ve kapağı kesti. Kafatası üzerinde tüp yerleştirin ve Kraniotomi üzerine merkezi.
- Kafatasına tüpün tabanını mühürlemek için tüpün alt etrafında diş çimento uygulayın. Maruz Kraniotomi (Şekil 3D) içine çimento sızıntı dikkatli olun.
- Kontralateral kranial plaka başka bir küçük delik (yaklaşık ½ mm çapında) delin ve dikkatle referans teli takın. (Donatımı bölümüne bakınız) telin ucuna kayıt amplifikatör ile arabirimleri bir iğne lehim teli referans Construct. Referans tel hareket etmeyin bu neden olabileceği hasar olarak beyinde bir kez.
- Tel sokulduğu bir delik superglue uygulanır. Bu geçici bir yerde pin ve tel mühür olacaktır.
- Silikon jel kitinin iki parça karıştırın yaklaşık olarak eşit kısımlar halinde (Malzemeler kısmına bakınız). Karıştırma ve fil için iki dakika bekleyinl santrifüj tüpü yaklaşık ⅓ jel ile dolu.
- Bir dik açı sonrası kelepçesini takın kafalık çubuğuna (Malzeme bölümüne bakınız). Plaka alt hayvanın burun doğru olduğunu böylece 45 ° eğim açısında tutma çubuğunun (Şekil 2B) kafa plakasını (Şekil 2A) takın. Bu deneysel jig (Şekil 4) uyacak şekilde pitch açısını ayarlamak için bir eğimölçere kullanmak yararlı olur.
- Bar kulak çubukları paralel olacak şekilde stereotaksi manipülatör koluna tutma çubuğunu takın. Plaka kaudal-en vidasına lambda dikiş ve ön arka böylece bar ve plaka indirin.
- Ön kafa cıvata kavrayın (bir 8-32 damızlık veya vida, Malzeme bölümüne bakınız) vidanın baş aşağı ve hayvan kuyruk doğru bakacak şekilde, bir yardım eller kol ve kelepçe ile yaklaşık 45 ° 'lik açıyla. O karınca değecek şekilde vidayı indirinerior 0-80 vida (Şekil 3F, G).
- Diş akrilik ile yerde cıvata ve plaka sabitleyin. Kemik vida başlarının etrafında diş akrilik, referans pimini uygulayın ve santrifüj tüpünün yüzüne etrafında. Diş akrilik kuruması için yaklaşık 10 dakika bekleyin (Şekil 3H).
- Implanta cilt çimentolama, diş akrilik kenarlarında diş çimento tabakası uygulayın. Çimento kurumasını bekleyin.
- Santrifüj tüpünün kapağı birkaç delik karıştırmak ve tüp kapağını yerleştirin.
- Yardım eller kelepçe çıkarın. Sonra dikkatlice stereotaksi kafa tutan çubuğunu kaldırmak ve daha sonra bar (Şekil 3I) kafa plaka kaldırmak.
- Stereotaksi hayvan çıkarın ve yürürlükteki tüm kurallar, yönetmelikler, kanunlar ve (uygun post-operatif bakım ve izleme yönetmek, örneğin, Buprenorfin 0.02 mg / kg, 24 en az her 8-12 saatsaat). Inflamasyon implant kenarlarında oluşursa çözülene kadar, günlük etkilenen site antibiyotik merhem ince bir tabaka uygulayın.
Nöronal Birimleri 3. Juxtacellular İzleme
- Bir karbondioksit lazer mikropipet çektirmesi üzerine kuvars kılcal boru çekin az 1 mikron (Şekil 5A) ucu çapları (Ekipman bölümüne bakınız).
NOT: ısıtma parametreler arasında özellikle araca göre değişecektir ve gerekli olan boyun çapının ilgi beyin yapısına bağlı olarak değişecektir ki. Sıçan talamus kayıtları için, mikropipetler 5-7 mm arasında değişen boyunları var. - Uzun çalışma mesafesi hedefleri ile donatılmış bir diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskop altında yerine pipet sabitleyin. Mikroskop sahnede yerinde pipet tutmak için modelleme kil kullanın.
- Mak için kullanılan bir cam parçası, 1 cm kalınlığında - Yavaşça 0.5 cam bloğu (hareketUltra-mikrotom bıçak ing pipet ile görüş alanı içine) uygundur. Sahne mikromanipülatör kullanarak, yavaşça kırmaya neden cama pipet dokunun. Pipet dış çapı 1-3 mikron arasında olana kadar gerekli tekrarlayın (Şekil 5B, C). Bu mikropipetler yaklaşık 5-15 MΩ arasındaki empedanslara sahip olduğundan emin olun.
- Hücre-dışı tuzlu su (135 mM NaCI, 5.4 mM KCI, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaOH ile 5 mM HEPES, pH 7.2) ile 8 Hazırlama Chicago Sky Blue (ağ / hac)% 2 ekleyin. 30 G iğne ya da daha küçük olan bir şırınga kullanılarak, çözelti ile pipet arka uç doldurun. Seçenek olarak ise, tek bir hücre juxtacellular etiketleme için% 2 ilave (ağırlık / hacim) neurobiotin da biyotinile edilmiş dekstran amin (BDA-3000 ya da BDA-10000) ve Chicago Sky Blue yerine tuzlu su çözeltisine ilave edilir.
- Uygun bir deneysel jig üzerinde sert tüp içinde bez çorap içine sıçan yerleştirin (
- Jig karşılık gelen parça sıçan baş-frenleyici plaka takın. Bunu yapmak için, ilk etapta baş kısıtlama plaka pin ve daha sonra bir 4-40 vida kullanarak sabitleyin. Hayvan başına aşırı tork uygulayarak önlemek için sakin beklemek emin olun. Sonraki sıçan implante edilir kafa frenleyici cıvata somunu bir 8-32 yerleştirin. Sonra baş cıvata dişli paslanmaz çelik çubuk vida. Yerine sıkılabilecek bir şekilde (Şekil 4) 'de deneysel jig çubuğun yapıştırın.
NOT: Baş-kısıtlama plaka min yanı sıra baş cıvata ile hayvan güvenliğinidüzeneğin bükme imizes ve kayıt kararlılığını geliştirir. İlk gün başlayabilir kayıt Çoğu durumda hayvan kafa ölçülü olduğunu. Hayvan aşırı kıpırdıyor veya seslendirir Ancak, herhangi bir kayıtları başlamadan önce baş-emniyet alışma eğitimi bir gün sunmak. Bu durumda, 15 dakika boyunca şablon üzerine hayvan bırakın ve daha sonra kafes içinde geri koyun. Ertesi gün bu adımı tekrarlayın ve protokol ile devam edin.- Kayıt odasına açın ve silikon jel çıkarın. Doku Kraniotomi yeniden büyüdü eğer ince forseps kullanarak kraniotomiye temizleyin.
- Motorlu mikromanipülatör pipet takın ve headstage öncesi amplifikatör takın.
NOT: Bu gösteride, headstage küçük bir röle devresi amplifikatör kurşun teller ve yüksek uyum (Şekil 6A-C) ile harici akım kaynağı arasında geçiş yapmak için kullanılır. Bazı amplifikatörler yerleşik bir uygun en yüksek uyum kaynağı olduğunu unutmayın(Tartışma ve Malzeme bölümlerine bakınız).- Kayıt odasında stereotaxically tespit işareti pipet ucu taşımak için motorlu mikromanipülatör kullanın. Bu konumun koordinatlarını unutmayın. Kafatası üzerinde pipet ucu kırmak için değil dikkatli olun.
- Ön-arka ve iç-dış eksende istenilen kayıt konuma pipet taşıyın. Amaçlanan kayıt konumuna yaklaşık 500 mikron dorsal kadar Sonra dura ile ventral pipet ilerlemek.
- Pipet ve referans tel arasında kaydedilen güçlendirilmiş gerilim bir ses monitörde olayları spike için dinlerken yavaşça pipet ilerlemek. Bir kez spiking olaylar tespit edilir, yaklaşık 500 mV gözlenir daha fazla pozitif gidiş gerilim sapması kadar pipet 0-100 mikron hareket devam ediyor.
NOT: elektrot direnci yaklaşık 1,5-10 wh bir faktör artacakBu durumda en.- Bir kez birim ilgi tüm diğer davranışsal ve fizyolojik önlemlerle birlikte, 3.11 adıma göre izole edilmiş kayıt başlayın. Bu gösteride, kendi ürettiği bıyık hareketleri (Malzeme bölümüne bakınız) yüksek hızda videografi ile izlenmektedir.
- Kayıt siteyi etiketlemek için, elektrot akım kaynağına bağlanmak yol açar geçiş. , Yerleşik bir el mevcut amplifikatör kaynağı, ya da (Şekil 6D, bkz adım 3.8 ve Tartışma) - ya bir röle devresi (C Şekil 6A) kullanarak bunu yapmak için birkaç yolu vardır. Geçiş -4 uA% 50 işlem devirinde 2 sn darbeleri ile 4 dakika boyunca iyontoferik pipet ile Chicago Sky Blue enjekte edilmesiyle gerçekleştirilebilmektedir.
- Öldürmek ve standart uygulamaya göre çeşitli etiketleme prosedürlerinden sonra hayvan serpmek. Bölüm olarak gerekli beyin ve counterstain kayıt anatomik konumu oturup tanımlamak içinör. 14 uyarınca sitokrom oksidaz reaktiflik için doku Counterstain. Alternatif olarak, floresan mikroskobu kullanarak Chicago Sky Blue mevduat tespit.
NOT: doğru etiketler arasında pipet çözülmesini olmadan, tüm etiketler aynı gün aynı pipet ile yapılır önemlidir farklı etiketli birimler ayırt etmek. Bu durumda kayıt siteleri her sitenin kaydetti manipülatör koordinatları ile birlikte post-hoc histoloji onların göreceli konumlara göre ayırt edilebilir (adım 3.9 bakınız). Kesin tanımlama için, birbirlerine ve beyin bölgelere göre en fazla 3-5 etiket en az 200 mikron dışında etiketleri işaretleyin. - Jig karşılık gelen parça sıçan baş-frenleyici plaka takın. Bunu yapmak için, ilk etapta baş kısıtlama plaka pin ve daha sonra bir 4-40 vida kullanarak sabitleyin. Hayvan başına aşırı tork uygulayarak önlemek için sakin beklemek emin olun. Sonraki sıçan implante edilir kafa frenleyici cıvata somunu bir 8-32 yerleştirin. Sonra baş cıvata dişli paslanmaz çelik çubuk vida. Yerine sıkılabilecek bir şekilde (Şekil 4) 'de deneysel jig çubuğun yapıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir sıçan aktif çırpma gibi bıyık hareketinin faz kendi ürettiği 15,16 çırpma esnasında kodlamak talamus ventral posterior medial (VPM) nöronal birimler. Şekil 7A bir VPM talamik birimin örnek spike aktivitesini gösterir. Şekil 7B başak bir histogram gösterir Zaman bıyık hareket 17 anlık aşamasına hizada. Çırpma geri çekilme aşamasında daha fazla sivri vardır. Şekil 7C'de gösterildiği gibi Kayıttan sonra, ünitenin yeri, Chicago gök mavisi iyontoforez yoluyla etiketlendi. Doku VPM talamus nöroanatomik sınırlarını ortaya çıkarmak için sitokrom oksidaz aktivitesi için zıt olduğunu. Bu protokolün benzer bir sürümü yakın zamanda özel beyin sapı çekirdekleri 18 çırpma ilgili multiunit nöronal aktiviteyi (10-20 mikron çapında pipet uçları) izlemek için uygulanmıştır.
1 re "src =" / files / ftp_upload / 51.453 / 51453fig1.jpg "/>
Şekil 1: Kumaş kısıtlayıcı çorap drawstrings ve İpli klipsli bir sıçan çorap (A) Fotoğraf.. küçük uç sternum ve kuyruk etrafında geniş ucu etrafında rahatça yerleştirilir. Panel 1A çorap için (B) Tasarım deseni. Boyutlar inç vardır.
Şekil 2: kafalık cihazının mekanik tasarım (A) fareler için bir hassas kafalık plakasının mekanik tasarımı.. Boyutlar inç vardır. (B), panel 2A'da plaka ile kullanım için bir koltuk başlığı çubuğun mekanik tasarımı. protokol bu parçaların iki, aynı perde açıda dik açılı sonrası kelepçeler kullanılarak monte gerektirir."_blank> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 3: Cerrahi prosedür stereotaksik tutma çerçeve içinde (A) Fare (protokol adım 2.4).. (B) implante vidalar ve kafatası işaretler (protokol adım 2.10) ile cerrahi sitesi. (C) kraniotomiler (protokol adım 2.12) ile cerrahi sitesi. (D) kayıt odasına (protokol adım 2.14) ile cerrahi sitesi. (E) referans tel ve silikon jel (protokol adım 2.17) ile cerrahi sitesi. (F, G) yerinde düzenlenen kafalık plakası ve bar (protokol adım 2.20) ile cerrahi sitesi. (H) plaka ve bar ile Cerrahi sitesi yerinde (protokol adım 2.21) 'de pekiştirdi. (I) Final kafa tutma ve kayıt odası implkarınca (protokol adım 2.24). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Elektrofizyolojik ve davranışsal izleme deneyleri için mekanik jig sıçan Deneysel jig Şeması (protokol 3,5-3,6 adımları). jig Şekil 2 barı ve plaka kullanır.
Şekil 5: Mikropipet elektrot inşaat kesintisiz bir mikropipet (protokol adım 3.1) (A) Mikrografik.. Ölçek çubuğu mikroskop altında kırılmamış mikropipet ve cam blok (protokol adım 3.2) panel C (B) mikrografta gibidir.ucun yansıma cam görülebilir. Ölçek çubuğu kırık mikropipet (protokol adım 3.3) panel C (C) mikrografta gibidir. (D) paneli A. Ölçeği bar kutulu bölgede kesintisiz mikropipet ucu mikrograf paneli C'ye kutulu bölgede kırık mikropipet ucu E. (E) Mikrografik panelinde gibidir için tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek.
Şekil 6:. Amplifikatör ve akım kaynağı arasında geçiş için donatım (A) Kurulum (isteğe bağlı) manyetik röle üzerinden akım kaynağına amplifikatör açar geçmek için. Gerilim-kontrollü röle anahtarı içeren bir baskılı devre kartı attac olduğunuamplifikatör kafa aşamasına hed. Panel 6A baskılı devre kartı için (B) Düzen. Yönetim Kurulu amplifikatör açar bağlayan ve mevcut kaynak rölesinin giriş pinlerine yol açar, ve elektrot çıkış pinlerine yol açar. elektrot, röle kontrol pimleri ya 0 veya 5 V uygulayarak akım kaynağı ya da bir amplifikatör ya bağlanır. Alt görüntü. Boyutlar inç vardır. (C) Panel 6B kurulu düzeni üstten görünümü. Manuel (opsiyonel) akım kaynağına amplifikatör açar geçmek için (D) Kurulum (: Ekipman bölümüne de bakın) gösterilen olanlar gibi açık bir pipet tutucu ve esnek kurşun tel gerektirir. Bu yaklaşım, paneller 6A-C röle devresine bir alternatiftir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir ünite (protokol adım 3.12) Deneysel kurulum ve temsili sonuçları (A) Spike ve bıyık hareketi: Şekil 7.. Çırpma döngüsünde faz karşı (B1) Normalize bıyık pozisyon. Her fırçalamak çırpıcı sırasında en kaudal pozisyon sıfır olarak tanımlanır ve en rostral pozisyon biri olarak tanımlanan şekilde normalize edilir. yörünge çırpma döngüsü 17 anlık faz karşı normalize konumunu temsil eder. Bütün tespit çırpma telleri bindirilmiş. (B2) sivri meydana geldiği fırçalamak döngüsünde faz Raster. Dikey eksen üzerindeki her deneme bir tek fırçalamak temsil eder. Aynı ünitede saygı fırçalamak döngüsü evresi ile başak oranları (B3) Histogram. Sitokrom oksidaz counterstaining Chicago Sky Blue boyası (C1) Yer (protokol 3,13-3,14 adımları). (C2- Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deneysel jig İnşaatı
Bu çeşitli şekillerde imal edilebilir deney jig (Şekil 4) oluşturmak için kullanılan mekanik parçaların açıklaması protokol atlandı. Bu gösteri standardında opto-mekanik parça ve destek kelepçeler kafalık bar ve vücut kısıtlama tüp (Malzeme bölümüne bakınız) monte etmek için kullanılır. Benzer opto-mekanik parçalar motorlu mikromanipülatör elektrot tutucu monte etmek için de kullanılabilir. Bu jig üzerine kafalık çubuğu ameliyat sırasında baş-tutma plakası implant kullanılan bar aynı Saha açıyla monte önemlidir. Elektrot, Standart stereotaksik eksen boyunca hareket etmesi ise (daha sonra elektrot x-ekseni baş bağlama çubuğuna paralel hareket etmesi ve toprağa lambda ve bregma ve paralel içeren düzleme dik olan Z ekseni Uygun amplifikatörler ve akım kaynakları Türleri Bu deney için kullanılan, örneğin, ticari amplifikatör ve mevcut kaynakların bir çeşitliliği bulunmaktadır. 1,000X toplam kazanç elde bir akım kelepçe modunda çoğu dışı ve hücre içi elektrofizyoloji amplifikatör uygundur. 1-3 mikron pipetler, en az 1 uA çözünürlükte ve en az 100 V bir uyum ile 10 uA kadar teslim bir akım kaynağı ile Chicago Sky Blue iyontoforez için tavsiye edilir. Bazı ticari yükselticiler var unutmayın uygun yerleşik akım kaynakları (Malzeme bölümünde alternatif parçaları bakınız). Bununla birlikte, uygun bir araya getirilen yükseltici / akım kaynağı gereksinimi aşmak için, bir manyetik röle devresi amplifikatör headstage ön ucu (Şekil 6A - C) bağlı olabilir. Bu tür bir devre o olduğunuptional ama deneyci amplifikatör ve fiziksel elektrodu bozucu olmadan iyontoforez darbeleri sunmak için ayrı bir akım kaynağı arasında geçiş yapmanızı sağlar. Alternatif bir yaklaşım el akım kaynağına bağlanmak olanlarla elektrot kurşun tellerin yerini alacak. Bu durumda, bu pipet üst (kırılmamış sonu) içine değil, ve esnek kurşun tel (Şekil 6D) kullanmak için bir pipet tutucu kullanmak en iyisidir. Uygulama tekrarlanır gerektirebilir Adımlar Master pratik gerektirecek birkaç adım vardır. En maharet gerektiren adım pipet ucu kırma olduğunu. Bu cam ucu yansıması görselleştirmek için cam blok kenarına boya yardımcı olur. Ucu ancak onun yansıması yerine getirene kadar Sonra bir yavaşça blok ve pipet ilerletebilir. Mikropipet paramparça ve uç çapı çok larg yapabilirsiniz çok hızlı bir pipet veya blok ilerlemeke veya düzensiz. Protokolde açıklandığı gibi, kuvars mikropipetler kullanmanızı öneririz. Mikropipetler etkili bir bükme veya kırılma olmadan kronik hazırlanmış Kraniyotomi sağlam sıçan dura nüfuz litre. Bu ek komplikasyonlara neden olabilir dura rezeksiyonu ihtiyacını ortadan kaldırır. Kısa daralan ile borosilikat mikropipetler (<5 mm) de dura nüfuz, ancak bunların kullanımı serebral korteks veya striatum gibi yüzeysel yapılardan kayıt sınırlıdır. Özellikle talamus veya beyin sapında derin yapılardan, kayıt, uzun konik, tercihen kuvars mikropipetler gerektirir. Pratik gerektiren bir ikinci adım, juxtacellular konfigürasyonda pipet konumlandırma olduğunu. Çok hızlı bir hücreye zaman yakın pipet Hareketli zarı yırtılabilir. Bu nedenle, bu ucu farazi bir hücreye yakınken bilmek pipet direncini izlemek için yararlıdır. En az 2-katlık membran direncindeki değişiklikler elektrot ne olabileceğini göstermektedirar veya bir hücre zarı dokunmadan. Ortak tuzaklar Akılda tutulması gereken birkaç ortak tuzaklar vardır. Pipet çok yakın hücreye mutlaka çünkü Birincisi, bu pipet zardan sürükleniyor eğer hücreyi "kaybetmek" mümkündür. Bir hücre tedirgin olmaya veya kayıt yoluyla yarıda yırtmak için ayrıca mümkündür. Öyle ise, başak genişliği ve ateş oranı artabilir ve başak genlik azaltabilir. Bu hücre sağlıksız olabilir göstergeleridir. Hayvan hareketi kaçınılmaz olarak bu olayların kayıtları bazı oranına ne neden olur, ancak hayvan iyi habitüe alarak ve hayvan irkilme titreşimleri gereksiz, ani yüksek sesler çıkıyordu kaçınarak veya neden minimize edilebilir. Protokole Potansiyel değişiklikler Hayvan olduğu ortamlarda bu kayıt ve etiketleme tekniğini kullanmak da mümkündürdavranışsal çeşitli görevleri gerçekleştirmek. Belirli bir davranış görev için eğitim cerrahisini takiben ama kayıt başlamadan önce yapılabilir. Nöronal aktivitenin kraniotomiye hazırladıktan sonra en az 1-2 hafta kaydedilebilir ve iyontoforetik noktalar en az 2-3 gün sürebilir. Bu zaman diliminde, ayrı kayıt oturumları sırasında birden beyin bölgelerinde kayıt içeren deneysel manipülasyonlar, çeşitli izin verir. Bu teknik aynı zamanda kayıt yapıldığı tek nöronlar doldurmak için modifiye edilebilir. Tek nöronların juxtacellular etiketleme Bu alternatif strateji hayvan hala ya anestezi olduğunda sadece elde mekanik kararlılık gerektirir. Bu etiketleme stratejisi için, BDA kullanımı neurobiotin üzerinde tavsiye edilir. BDA önemli neurobiotin fazla başarı oranı artar proteazlar tarafından azaltılmaz. Etiketleme perfüze önceki son kayıt oturumu sırasında denenmelidirhayvan. Juxtacellular protokolün bu ayrıntılı açıklamaları Chicago Sky Blue bizim deneyim İyontoforetik enjeksiyon, uyarı sıçanlarda 8 başarıyla istihdam edilmiştir tekniği görüntü albüm daha önce 6,19 tarif edilmiştir Not önemli ölçüde daha yüksek verim vardır. Chicago Sky Blue ve neurobiotin veya BDA etiketleme aynı hayvanda yapılabilir unutmayın. Bu teknik, çeşitli türlerde için uygun olması muhtemeldir. Juxtacellular kayıtları, örneğin, uyarı farelerin 9 kortikal bölgelerinde yapılmıştır unutmayın. Eğitim, taşıma ve baş-kısıtlama özgü türler iken, bu protokol açıklanan izleme ve etiketleme için özel teknikler aynı kalmalıdır. Son olarak, sadece pipet ve bu teknik, farmakolojik maddeler 20,21 dahil olmak üzere çeşitli moleküllerin, bir iyontoforetik enjeksiyon için kullanılabilir akım darbelerinin parametre sayısını değiştirerek. Bu durumda,Bu teknik aynı zamanda davranıyor hayvanlar dahil nörofarmakolojik çalışmalar için yararlı olabilir. Sonuçlar Genellikle birbirine son derece yakın olan beyin bölgeleri belirgin farklı özelliklere ve / veya işlevlerini 22 olabilir bu durumda. Bu gibi durumlarda, organizma davranış anatomik tanımlanmış bölgelerden tek nöron aktivitesi ile ilgili sinirsel devreleri ve hesaplama anlamak açısından büyük önem taşımaktadır. Bu makale, standart tekniklerin bir kombinasyonu kullanılarak, bunu gerçekleştirmek için bir protokol gösteren ve örnek olarak VPM talamik nöronlarda duyusal kodlama tarif etmektedir. teknik, farklı hayvan modellerinde beyin bölgelerinde ve davranışsal paradigmalarının çeşitli uygun ve mümkün olması muhtemeldir. Bu uyarı hayvanlarda 6,8 tek hücreli juxtacellular etiketleme daha önemli ölçüde daha yüksek başarı oranına sahiptir ve çok ele kullanan teknikler üzerinde daha iyi anatomik çözünürlük avantajı vardırctrode diziler veya Microdrives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Fort Dodge | N/A | |
| Anased (Xylazine solution) | Lloyd Laboratories | N/A | |
| Betadyne (Povidone-Iodine) | CVS Pharmacy | 269281 | |
| Loctite 495 | Grainger Industrial Supply | 4KL86 | 20 - 40 cp cyanoacrylate |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Grip cement powder | Dentsply Intl | 675571 | For the base of the recording chamber |
| Grip cement liquid | Dentsply Intl | 675572 | For the base of the recording chamber |
| Silicone gel | Dow Corning | 3-4680 | |
| Jet denture repair acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Chicago sky blue | Sigma | C8679 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For perfusion and tissue fixation |
| Phosphate-buffered saline | Sigma | P3813 | For perfusion and tissue fixation |
| Cytochrome C | Sigma | C2506 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Diaminobenzidine | Sigma | D5905 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Rat sock | Sew Elegant (San Diego, CA) | N/A | Custom made, Figures 1, 4 |
| PVC tube 2 ½” | U.S. Plastic Co. | 34108 | Figure 4 |
| Subminiature D pins & sockets | TE Connectivity | 205089-1 | Figure 3 |
| Stainless steel music wire 0.010” diameter | Precision Brand Products, Inc. | 21010 | Figure 3 |
| Stereotaxic holding frame | Kopf Instruments | Model 900 | Figure 3 |
| Stereotaxic ear bars | Kopf Instruments | Model 957 | Figure 3 |
| Stereotaxic manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | Figure 3 |
| ½ mm drill burr | Henry Schein | 100-3995 | |
| Quiet-Air dental drill | Midwest Dental | 393-1600 | |
| Stainless steel 0-80 ⅛” screw | Fastener superstore | 247438 | Figure 3 |
| 0.2 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-407-8A | Figure 3 |
| Custom head-holding bar | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Custom head-holding plate | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Right angle post-clamp | Newport | MCA-1 | Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp. |
| 8-32 ¾” screw | Fastener Superstore | 240181 | For head-restraint, Figure 3 |
| 4-40 ¼” screw | Fastener Superstore | 239958 | For head restraint, Figures 3, 4 |
| Quartz capillary tubing | Sutter Instruments | QF-100-60-10 | Figure 5 |
| Carbon dioxide laser puller | Sutter instruments | P-2000 | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Microelectrode amplifier head stage | Molecular Devices | CV-7B | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems | Model 2100 | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Audio monitor | Radio Shack | 32-2040 | |
| Pipette holder | Warner Instruments | #MEW-F10T | Alternate parts: see Discussion, Figure 6A |
| Electrode lead wire | Cooner wire | NEF34-1646 | (optional), Figure 6D |
| Relay for amplifier head-stage | COTO Technology | #2342-05-000 | (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C |
| Digital video camera | Basler | A602fm | (optional) For behavioral monitoring, Figure 7 |
| Puralube vet ointment | Amazon.com, Inc | NC0138063 |
References
- Fee, M. S., Leonardo, A. Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals. Journal of Neuroscience Methods. 112 (2), 83-94 (2001).
- Ventakachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. Ultra-miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted micro-wire implantation for chronic recording from neocortex. Journal of Neuroscience Methods. 90 (1), 37-46 (1999).
- Szuts, T. A. A wireless multi-channel neural amplifier for freely moving animals. Nature Neuroscience. 14 (2), 263-269 (2011).
- Roy, S., Wang, X. Wireless multi-channel single unit recording in freely moving and vocalizing primates. Journal of neuroscience. 203 (1), 28-40 (2012).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8699-8705 (2011).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. Journal of neuroscience. 65 (2), 113-136 (1996).
- Person, A. L., Perkel, D. J. Pallidal neuron activity increases during sensory relay through thalamus in a songbird circuit essential for learning. The Journal of neuroscience. 27 (32), 8687-8698 (2007).
- Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 10481061 (2010).
- Hellon, R. The marking of electrode tip positions in nervous tissue. The Journal of physiology. 214, 12P (1971).
- Furuta, T., Deschênes, M., Kaneko, T. Anisotropic distribution of thalamocortical boutons in barrels. The Journal of Neuroscience. 31 (17), 6432-6439 (2011).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes. Journal of Comparative Neurology. 375 (1), 89-108 (1996).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain research. 171 (1), 11-28 (1979).
- Moore, J. D., Deschênes, M., Kleinfeld, D. Self-generated vibrissa motion and touch are differentially represented throughout ventral posterior medial thalamus in awake, head-fixed rats. Society for Neuroscience Annual Meeting. 41 496.08/TT424 Society for Neuroscience. 41, (2011).
- Khatri, V., Bermejo, R., Brumberg, J. C., Zeigler, H. P. Whisking in air: Encoding of kinematics by VPM neurons in awake rats. Somatosensory and Motor Research. 27 (2), 344-356 (2010).
- Hill, D. N., Curtis, J. C., Moore, J. D., Kleinfeld, D. Primary motor cortex reports efferent control of vibrissa position on multiple time scales. Neuron. 72 (2), 344-356 (2011).
- Moore, J. D. Hierarchy of orofacial rhythms revealed through whisking and breathing. Nature. 497, 205-210 (2013).
- Duque, A., Zaborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing 3. , Springer. 197-236 (2006).
- Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fsubstances.html Forthcoming.
- Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fdyes.html Forthcoming.
- Urbain, N., Deschênes, M. Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. (Kation Scientific), Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. (Kation). Journal of Neuroscience. 27 (45), 12407-12412 (2007).
