Introduction
積極的に行動のタスクに従事し、アラート、動物における神経活動の監視は、神経系の機能と組織を理解するために重要です。シングルニューロンユニットからの電気的活動の細胞外記録は、長いシステム神経科学の定番ツールとなって、現在で使用されて広くまだいる。電極の種類とさまざまな構成は、特定の実験の科学的·技術的な要求に応じて利用可能です。慢性移植マイクロドライブまたは電極アレイは、多くの場合、鳥類、げっ歯類、非ヒト霊長類を含む1-4、自由に動物を移動させる際に使用される。また、外部のマイクロマニピュレーターを経由して金属やガラス微小電極を伴う急性の貫通部は、多くの場合、麻酔をかけたり頭拘束動物から記録するために使用されます。ガラスマイクロピペット電極は、それらが明確に隔離するjuxtacellularまたは「細胞添付」構成で使用することができるという利点を有する5ソート事後スパイクの合併症のない単一ニューロンの活動。これらは、色素または神経解剖学的トレーサーの小さな堆積物を注入するために、または個々のセルを記録充填するために使用することができるようにこれらの電極はさらに、解剖学的に同定された細胞または場所から記録を可能にする。この構成は、正常に、ラット、マウス、鳥類6-10に適用されている。現在記載の技術は、juxtacellular監視や警告における細胞外の色素沈着、頭部拘束ラットに焦点を当てています。埋めjuxtacellular単一のセルとは異なり、これらの色素の沈着は細胞形態または軸索突起11についての情報を提供していないが、彼 らは約50μmの正確な解剖学的局在を有効にし、批判的に、アラートの動物では有意に高い収量を持っていることに注意してください。それにもかかわらず、解剖学的標識のための代替戦略として提供されて埋めjuxtacellular単一セルに関する情報。
要するに、プロトコルは3主要な段階で構成されています。第一段階では、ラットを6日間にわたって布靴下（ 図1）身体拘束に順応される。第2段階では、ヘッドレスト装置（ 図2）および記録チャンバーは、外科的に、ラットは、複数の次の記録セッション（ 図3）の間に定位面内に維持することができるように注入される。この手順は、標準的な参照が12を座標に基づいて、電気生理学的研究のために、脳の特定のサブ皮質領域を標的とするように実験者が可能になります。第三相は、確実に1つのユニット6-9を分離juxtacellularニューロンの記録を、（ 図5）石英キャピラリー管から電極を構成し、行動および電気生理学的実験（ 図4）を行って製造するための適切な治具にラットを配置することを含む、および解剖locatiマーキングシカゴスカイブルー色素（ 図6および7）と記録部位の上。録音は、同時行動の監視を行っている。しかし、行動の技術的な詳細は、各実験の科学的な目標に依存し、単一のプロトコルの範囲を超えてこのようにある。複数の日に繰り返すことができる実験手順の完了後、動物を安楽死させる。脳は、明視野または蛍光顕微鏡のいずれかを使用して、標準的な神経解剖技術に従って抽出され、処理される。
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Protocol
連邦政府が定める動物の管理と使用ガイドラインに従って - （350gの250）とカリフォルニア大学サンディエゴ校で施設内動物管理使用委員会によって承認された実験的なプロトコルでは、女性のロングEvansラットで行った。
1.ボディ拘束へのラットを順応
注：制限食でラットを置きます。拘束（後述）にラットを順応さただちに各毎日の取り扱いセッションの後一日一回のラットを養う。その初期重量の80％で動物を維持するための十分な供給を提供する。この量は、250グラムのメスのロングエバンスラットのための一日あたりの飼料の約6グラムである。
- 人間によって処理されることにラットを順応さ。ゆっくりと約5秒ごとに30秒の期間の手でラットを拘束。 2日連続で15分間日のためにこれを行います。訓練期間中のストレスの徴候について毎日ラットを監視します。兆候は苦労私を含む拘束、発声、および歯チャタリングn個の応答。
- 3 日目には、2日連続で15分間、一日のために（ 図1）身体を拘束布靴下にラットを置く。
- 5日目に、靴下の中にラットを置き、実験的な治具（ 図4）に剛性管の内側に靴下を置く。 2日連続で15分間の日にチューブでラットのままにしておきます。
- 各トレーニングセッションの直後にラットを養う。最後のセッション（6 日目 ）の終わりに、食品への無制限のアクセスを与える。移植のために最後の訓練の日に過度のストレスの兆候を示していないだけで、これらのラットを選択します。
注：注入用ラットの選択は主観的であるが、我々の手で、ラットの90％以上が慣れに応じて、移植を受けることができることが見出された。
2.録音商工頭部拘束機構を注入
- 再を作るピンコネクタに裸のステンレス鋼線を半田付けすることによりフェレンスワイヤー。 3〜5ミリメートルは、ピンによって発見されたままであるようにワイヤーをカット。すべての手術のツールと一緒に、参照線をオートクレーブ。
- ケタミン/キシラジン麻酔を管理します。 95ミリグラム/腹腔内に5 mg / kgをキシラジンと混合kgのケタミンを管理します。初期投与量は1.5〜2時間持続する。必要に応じて、すべての30〜45分間、その後、麻酔を補足する。眼軟膏で動物の目に注油。
- 麻酔の平面を決定するために、そのTOE引っ込め反射を確認し、必要に応じて麻酔を維持。
- 耳バー付きの定位保持枠にラットを置きます （ 図3A）。頭の毛を剃るとポビドンヨード（10％溶液）で創傷部位を消毒する。彼らは鼓膜を損傷しないように適切に耳バーを挿入するように注意してください。鈍ヒントを耳バーが好ましい。
- メスapproxiで切開するmately耳の後ろに目の吻側 - 尾側レベルから頭蓋の正中線に沿って。切開の両側の皮膚2-3 mmのストリップをカットし、削除するにはハサミを使用してください。
- 横方向の尾根に出て頭蓋の表面を露出させる骨膜を削り取る。瞬間接着剤の薄層で暴露頭蓋をカバーしています。
- ½直径ドリルバリ（ 材料の項を参照）を使用して、0〜80のネジよりもわずかに小さい直径で、小さな穴を開けます。ネジが下よりも横方向のトップで行くことができるように、ブレグマ縫合糸が横尾根を満たしている場所に後方、および30〜45°の角度で頭蓋にすぐに穴を開けます。
- 30〜45°の角度で、穴（約3回転）に0-80平底小ネジにねじ込みます。基盤となる脳組織の損傷を防ぐために、あまりにも深くでネジしないように注意してください。
- 示した構成にさらに6本のネジに対してこの手順を繰り返し
- stereotaxマニピュレータにおける注射針を配置します。基準マークとして、外部の目的の開頭の場所のブレグマ縫合糸から測定し、近くに針で頭蓋内凹みを作るが、。
注：このデモでは、マークの定位座標は、3ミリメートルの後部とブレグマ縫合に横方向の1ミリメートルである。 - 永久的なマーカーで凹みをマークします。その定位基準点となるように、マークの定位座標を注 （ 図3B）。
- 希望する座標（3ミリメートルの後部と、この例ではブレグマへ横3ミリメートル）を中心に開頭術を行います。無傷の硬膜のままにしておきます。修正された人工脳脊髄液（125ミリモルのNaCl、10mMのグルコース、10mMのHEPES、3.1のCaCl 2、1.3のMgCl 2、pH7.4）中13（ 図3C）との開頭術を覆う。 4に0.2ミリリットルの遠心管をカット - 長さ5mm、およびキャップを切断。頭蓋上にチューブを置き、開頭の上にセンター。
- 頭蓋にチューブのベースをシールするために、チューブの底を中心に歯科用セメントを適用します。暴露開頭術（ 図3D）にセメントが漏れないように注意してください。
- 反対側の頭蓋プレート内（直径約1/2）別の小さな穴を開け、慎重に参照線を挿入します。ワイヤの端に記録アンプ（ 設備の項を参照）とのインタフェースピンをハンダ付けして基準線を構築します。それが脳に入ると、これは損傷の原因となり、基準線を移動しないでください。
- ワイヤが挿入された穴に瞬間接着剤を適用します。これは一時的に所定の位置にピンとワイヤーをシールします。
- ほぼ等しい部分に（ 材料の項を参照）シリコーンゲルキットの2つの部分を混ぜる。混合およびFILのために2分待ちゲルとの完全なL遠心管約⅓。
- ヘッドレストバーに（ 材料の項を参照）直角ポストクランプを取り付けます。プレートの底を動物の鼻に向かっているように、45°のピッチ角の保持バー（ 図2B）、ヘッドプレート（ 図2A）を取り付ける。これは、実験的な治具（ 図4）と一致するようにピッチ角を設定する傾斜計を使用することが有用である。
- バーは耳の棒と平行になるようにstereotaxマニピュレータアームに保持バーを取り付けます。プレートは尾最もネジにラムダ縫合糸と前の後部になるようにバーとプレートを下げます。
- ねじの頭がダウンして、動物の尾の方に向くように、援助の手アームとクランプで約45°の角度で（ 材料の項を参照、8-32スタッドまたはネジ）フロントヘッドボルトをつかみ。それはアリに触れるようネジを下げるerior 0-80ネジ （ 図3F、G）。
- 歯科アクリルのある場所にボルトとプレートを固定します。歯科用骨ネジの頭の周りにアクリル、リファレンス·ピン、および遠心管の側面の周りを適用します。歯科アクリルを乾燥するのに約10分を待ちます （ 図3H）。
- インプラントに皮膚を接合し、歯科アクリルのエッジの周り歯科用セメントの層を適用します。セメントを乾燥するのを待ちます。
- 遠心管のキャップにいくつかの穴を突く、チューブのキャップを配置します。
- 援助の手クランプを取り外します。その後、慎重にstereotaxからヘッド保持バーを削除してから、バー（ 図3I）からヘッドプレートを取り外します。
- stereotaxから動物を削除し、術後ケアとモニタリング、該当するすべての規則に従って、規制、法律（ 例えば、ブプレノルフィン0.02 mg / kgを、24の最小ごとに8-12時間を管理する時間）。炎症はインプラントの縁の周りを開発する場合、解決まで毎日患部に抗生物質軟膏の薄い層を適用する。
ニューロンユニットの3 Juxtacellularモニタリング
- 炭酸ガスレーザーマイクロピペットプラー上の石英キャピラリーチューブを引っ張る1μm未満（ 図5A）の先端径を有する（ 機器の項を参照）。
注：加熱パラメータは、特定の機器に応じて変化する、必要なネック径は、関心のある脳構造に依存して変化すること。ラットの視床における記録のために、マイクロピペットは5〜7ミリメートルまでの首を持っている。 - 長作動距離の目標を装備した微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡下で所定の位置にピペットを固定します。顕微鏡のステージ上で所定の位置にピペットを保持するためのモデリング粘土を使用してください。
- makのに使用されるガラス片;厚さ1cm - ゆっくりガラスブロック（0.5を移動ウルトラミクロトームナイフをると、ピペットチップで視野に）便利です。ステージマイクロマニピュレーターを用いて、そっとガラスにピペットチップに触れ、それを破る原因。ピペットチップ外径が1-3ミクロンの間になるまで、必要に応じて繰り返します （ 図5B、C）。これらのマイクロピペットは、約5〜15MΩ間のインピーダンスを有していることを確認してください。
- 細胞外生理食塩水（135のNaCl、5.4のKCl、1.8のCaCl 2、1mMのMgCl 2、5mMのHEPES、NaOHでpH7.2）で8を準備し、シカゴスカイブルー（w / v）の2％を追加します。 30 G針または小さなシリンジを使用して、溶液をピペットの後端を埋める。あるいは、単一セルjuxtacellular標識のためにシカゴスカイブルーの代わりに生理食塩水に2％（w / v）のNeurobiotinまたはビオチン化デキストランアミン（BDA-3000またはBDA-10000）を追加します。
- 適切な実験治具に剛性チューブの内側の布の靴下の中にラットを置きます （
- ジグの対応ピースにラットにヘッド拘束プレートを取り付けます。これを行うには、最初の場所でヘッド拘束プレートをピンしてから、4-40ネジを使用して固定します。動物が頭に過大なトルクを加えないようにするために穏やかになるまで待つようにしてください。次に、ラットに移植されたヘッド·拘束ボルトに8-32ナットを配置します。その後、ヘッドボルトのねじステンレス製の棒にねじ込みます。それが所定の位置に締め付けることができるような方法で実験的な治具（ 図4）にロッドを固定。
注：ヘッドボルトならびに頭拘束プレート分で動物を保護する装置の曲げimizesと記録安定性を向上させる。ほとんどの場合、記録は、動物が頭抑制され、初日に開始することができる。動物が過度にそわそわまたは発声場合は、すべての録音を開始する前に、ヘッド拘束馴化訓練の一日を提供する。この場合は、15分間の治具に動物を残して、そのケージに戻ってそれを配置します。次の日、この手順を繰り返し、プロトコルを続行。- 記録チャンバーを開き、シリコーンゲルを削除します。組織は開頭で再成長してきた場合には罰金ピンセットを用いて開頭術を清掃してください。
- 電動マイクロマニピュレーターにピペットを取り付け、ヘッドステージ前置増幅器に接続します。
注：本デモンストレーションでは、ヘッドステージに小さなリレー回路は、増幅器のリード線と高いコンプライアンス（ 図6A-C）と外部電流源を切り替えるために使用される。いくつかのアンプが内蔵され、適切な高コンプライアンス源を持っていることに注意してください（ ディスカッション · 材料のセクションを参照してください）。- 記録チャンバー内定位的に識別マークにピペットの先端を移動するための電動マイクロマニピュレーターを使用してください。この場所の座標を注意してください。頭蓋にピペットの先端を壊さないように注意してください。
- 後部-前方および内外方向の軸で所望の記録位置にピペットを移動します。それが意図された記録場所に約500μmの背側になるまで続いて硬膜を通して腹側にピペットを進める。
- ピペットチップと基準線との間で記録された増幅された電圧のオーディオモニター上のイベントをスパイクするために聞きながらゆっくりピペットを進める。一度スパイクイベントが識別され、約500μVが観察されているよりも大きな正方向の電圧偏位までピペット0-100ミクロンを移動し続ける。
注記：電極抵抗は、約1.5〜10のwh倍に増加するこれが発生したEN。- ユニットは、関心のあるすべての他の行動や生理的な対策とともに、3.11ステップに従ってとして単離されたら録音を開始。現在のデモンストレーションでは、自己生成された感覚毛の動きは（ 材料の項を参照）、高速ビデオ撮影で監視されている。
- 記録サイトにラベルを付けるには、電極は、電流源に接続するためにつながる切り替える。手動で、内蔵アンプの電流源、または（ 図6D、ステップ3.8および考察を参照） -いくつかのリレー回路（C図6A）のいずれかを使用してこれを行う方法がある。通過-4μAを2秒パルスで4分間、50％のデューティサイクルでイオン泳動ピペットを通してシカゴスカイブルーを注入する。
- 標準的な慣行に従って、いくつかの標識方法の後に動物を殺し、灌流。第記録SITの解剖学的位置を特定するために、必要に応じて脳と対比E。 14あたりとしてシトクロム酸化酵素反応のための組織を対比。代替的に、蛍光顕微鏡を用いてシカゴスカイブルー沈着を識別する。
注：正確には、すべてのラベルはラベル間のピペットをアンクランプすることなく、同じ日に同じピペットを用いて作られていることが重要である異なるラベルのユニットを区別するために。この場合、記録部位は（ステップ3.9参照）、各サイトの注目マニピュレータ座標とともに事後組織学におけるそれらの相対的な位置によって区別することができる。明確な同定のために、互いに離れて少なくとも200ミクロン、及び脳領域あたりせいぜい3-5のラベルをラベルをマークします。 - ジグの対応ピースにラットにヘッド拘束プレートを取り付けます。これを行うには、最初の場所でヘッド拘束プレートをピンしてから、4-40ネジを使用して固定します。動物が頭に過大なトルクを加えないようにするために穏やかになるまで待つようにしてください。次に、ラットに移植されたヘッド·拘束ボルトに8-32ナットを配置します。その後、ヘッドボルトのねじステンレス製の棒にねじ込みます。それが所定の位置に締め付けることができるような方法で実験的な治具（ 図4）にロッドを固定。
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Representative Results
エンコード視床腹側後部内側（VPM）におけるニューロンユニット自己生成15,16を泡立てる時の感覚毛運動の段階。ラットが積極的に泡立てるされる。 図7Bは、スパイクのヒストグラムを示す。図7（a）は、VPM視床単位のサンプルスパイク活性を示す感覚毛の運動17の瞬時位相に合わせ回。泡立ての収縮期の間、よりスパイクがある。 図7Cに示すように記録した後、ユニットの位置は、シカゴスカイブルー染料のイオントフォレーシスを介して標識した。組織は、VPMの視床の神経解剖学的境界を明らかにするために、シトクロム酸化酵素活性のために対比される。このプロトコルに類似した内容が、最近、特定の脳幹核18で泡立てる関連のマルチユニット神経活動（10〜20μmの直径のピペットチップ）を監視するために適用した。
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図1：布拘束靴下ドローストリングと巾着留め金とラット靴下の（A）写真。。小端部は胸骨、および尾の周りの大端部の周りにぴったりと配置されます。 （B）パネル1A靴下のためのデザインパターン。寸法はインチである。
図2：ヘッドレスト装置の機械設計（A）ラット用精密ヘッドレストプレートの機械設計。。寸法はインチである。 （B）パネル2Aのプレートで使用するためのヘッドレストバーの機械設計。プロトコルはこれらの部品のうちの2つを必要とし、同じピッチ角に直角ポストクランプを使用してマウント。_blank ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：手術手順定位保持枠における（A）ラット（プロトコルステップ2.4）。 （B）移植されたネジと頭蓋マーキング（プロトコルステップ2.10）と手術部位。 （C）開頭術（プロトコルステップ2.12）と手術部位。 （D）記録チャンバー（プロトコルステップ2.14）と手術部位。基準線とシリコーンゲル（プロトコールステップ2.17）と（E）手術部位。 （F、G）所定の位置に保持ヘッドレストプレート、バー（プロトコルステップ2.20）と手術部位。 （H）場所（プロトコルステップ2.21）の接合プレート、バーとで手術部位。 （I）最終頭部拘束と記録室独自の実装アリ（プロトコルステップ2.24）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：電気生理学的および行動モニタリング実験のための機械の治具におけるラットの実験的治図（プロトコルは3.5から3.6ステップ）。ジグは、 図2のバーとプレートを利用しています。
図5：マイクロピペット電極構造切れ目のないマイクロピペットの（A）顕微鏡写真（プロトコルステップ3.1）。。スケールバーは顕微鏡下で切れ目のないマイクロピペットとガラスブロックのパネルC.（B）顕微鏡写真（プロトコルステップ3.2）のようになる。チップの反射は、ガラスに見ることができる。スケールバーは、パネルC.壊れたマイクロピペットの（C）顕微鏡写真（プロトコルステップ3.3）のようになる。 （D）パネルA.スケールバーの箱入りの領域での切れ目のないマイクロピペットの先端の顕微鏡写真は、パネルCの箱入りの領域で壊れたマイクロピペットの先端のE.（E）写真パネルのようになるにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
図6：アンプと電流源の切り替えのための機器 （オプション）磁気リレーを介して電流源にアンプからのリード線を切り替える（A）セットアップ。。電圧制御リレースイッチを含むプリント回路基板はATTACあるアンプヘッドステージにHED。 （B）パネル（a）のプリント回路基板のレイアウト。ボードは、増幅器リードを接続し、電流源は、リレーの入力端子につながり、電極が出力端子につながる。電極は、リレー制御端子に0または5 Vを印加することにより、電流源または増幅器のいずれかに接続されている。底面図。寸法はインチである。 （C）パネル6Bのボード·レイアウトの上面図。 （オプション）を手動で電流源にアンプからのリード線を切り替える（D）セットアップは、オープンピペットホルダーと（：機器の項をも参照）に示すもののような柔軟なリード線が必要です。このアプローチは、パネル6A-Cでのリレー回路に代わるものです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7：実験セットアップと代表的な結果（A）スパイクと1単位（プロトコルステップ3.12）から、感覚毛の動き。。泡立て器サイクルにおける位相対（B1）正規化された鼻毛の位置。各泡立て器は泡立て器中に最も尾側の位置をゼロとして定義され、最も吻側位置は1と定義されるように正規化される。軌道は、泡立て器サイクル17における瞬時位相に対して正規化された位置を示している。すべての識別泡立て器が重畳されている。 （B2）のスパイクが発生するで泡立て器サイクルの位相のラスター。縦軸上の各試験は、単一の泡立て器を表す。 （B3）は、同じユニットの尊重泡立て器サイクル相とスパイク率のヒストグラム。シトクロムオキシダーゼ対比シカゴスカイブルー色素の（C1）の場所（プロトコルは3.13から3.14ステップ）。 （C2 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
実験的な治具の構築
それは、様々な方法で構築することができるように、実験治具（ 図4）を構築するために使用される機械部品の説明は、プロトコルから省略されている。このデモでは、標準的な光学機械部品とサポートクランプは（ 材料の項を参照）ヘッドレストバーと身体拘束チューブを取り付けるために使用されている。類似の光学機械部品、電動マニピュレーターに電極ホルダを取り付けるために使用することができる。これは、冶具上のヘッドレストバーは、手術中に頭部拘束板を移植するために使用されるバーと同じピッチ角度で取り付けられていることが重要である。電極は、標準的な定位軸に沿って移動させる場合（、その後電極のx軸は、頭部拘束バーに平行に移動する必要があり、地面にラムダとブレグマと平行を含む平面に垂直なz軸 適切なアンプと電流源の種類 この実験のために使用することができる商業増幅器および電流源の様々なものがある。 1,000倍の合計利得を達成電流クランプモードでほとんどの細胞外および細胞内電気生理学アンプが適切である。 1-3μmのピペットとのシカゴスカイブルーのイオントフォレーシス用、少なくとも1μAと、少なくとも100 Vの遵守の解像度で10μAを供給することができます電流源が推奨されます。いくつかの商用アンプは持っていることに注意し、適切な内蔵の電流源（ 材料セクションの代替部品を参照）。しかし、適切な複合増幅器/電流源の必要性を回避するために、磁気リレー回路は、増幅器のヘッドステージ（ 図6A - C）の前端部に取り付けることができる。このような回路は、Oであるptionalそれは実験者が物理的に電極を摂動することなく、イオン導入パルスを提供するために、アンプと別個の電流源を切り替えることができます。別のアプローチは、手動で電流源に接続するもので、電極リード線を交換することである。この場合には、ピペットの上部（切れ目のないエンド）で囲みせず、柔軟なリード線（ 図6D）を使用するようにピペットホルダーを使用するのが最適です。 反復練習が必要な場合がありますステップ マスターに練習が必要な場合がありますいくつかのステップがあります。ほとんどの器用さを必要とする段階は、ピペットの先端を壊すです。それは、ガラスで、先端の反射を可視化するためにガラスブロックのエッジをペイントすると便利です。先端がかろうじてその反射を満たすまで、1ゆっくりブロックとピペットを進めることができます。マイクロピペットを粉砕し、先端径が大きラーグ作ることができる速すぎピペットまたはブロックを推進eまたは不均一。プロトコールに記載されているように私たちは、石英製のマイクロピペットの使用をお勧めします。マイクロピペットを効果的に曲げたり壊すことなく、慢性的に準備された開頭術で無傷のラットの硬膜を貫通する石英。これは、付加的な合併症を引き起こす可能性が硬膜切除の必要性を排除する。短いテーパ付きホウケイ酸マイクロピペット（<5ミリメートル）も、硬膜を貫通するが、それらの使用は、大脳皮質または線条体のような表面的な構造から記録に制限されています。特に視床や脳幹でより深い構造、からの記録、長いテーパー、好ましくは石英マイクロピペットを必要とします。練習が必要第二段階は、juxtacellular構成でピペットを位置づけている。セルの近くには、膜を破裂させることができたときにあまりにも迅速にピペットを移動する。そのため、先端が推定細胞に近いときに知ってピペットの抵抗を監視すると便利です。少なくとも2倍の膜抵抗の変化は、電極がねであり得ることを示すArまたは細胞膜に触れる。 一般的な落とし穴 心に留めてするには、いくつかの一般的な落とし穴があります。ピペットチップは、必ずしも細胞に非常に近いため、最初、それは、ピペットが膜から離れてドリフトした場合、セルを「失う」ことが可能である。セルが攪拌なったり、記録の途中を破裂させることも可能である。それがない場合には、スパイク幅、発火率を増加させることができ、スパイク振幅が低下することがある。これらは、細胞が不健康かもしれ表示である。動物の動きは必然的にこれらのイベントは、録音のある割合で発生する原因となりますが、よく慣れ、不要な、突然の大きな音を作る回避または動物驚愕の振動を引き起こすことによって動物を持っていることによって最小限に抑えることができる。 プロトコルへの潜在的な変更 これは、動物がである文脈で、この記録及び標識技術を使用することが可能である行動のさまざまなタスクを実行する。特定の行動タスクの訓練は手術後が、記録を開始する前に行うことができる。ニューロンの活性は、少なくとも1~2週間開頭を調製した後に記録することができ、イオン導入スポットは、少なくとも2~3日間続くことができる。この時間枠は、別々のレコーディングセッション中に複数の脳領域から記録を含む実験操作、さまざまなことを可能にする。 技術は、記録が作られる個々のニューロンを満たすように修正することができる。シングルニューロンのjuxtacellularラベリングのこの代替戦略は、動物がまだまたは麻酔をかけたときにのみ達成され、機械的安定性が必要です。このラベリング戦略については、BDAの使用はNeurobiotinをお勧めします。 BDAは著しくNeurobiotinオーバー成功率を増加させるプロテアーゼによって分解されない。標識は、灌流前の最後の記録セッション中に試みるべきである動物。 juxtacellularプロトコルの詳細な説明は、以前に6,19シカゴスカイブルーの我々の経験のイオン導入注入が実質的により高い収率を有するに技術は、8警告ラットで成功して採用されている.While記載されている注意してください。シカゴスカイブルーとNeurobiotinまたはBDAラベルの両方が同じ動物で行うことができることに注意してください。 この技術は、種々の種のために適切である可能性がある。 juxtacellularの録音には、例えば、警報マウス9の皮質領域で行われていることに注意してください。トレーニング、ハンドリング、そして頭部拘束が特定の種であるが、このプロトコルに記載の監視と標識のための特別な技術は同じままにしてください。最後に、単純にピペットチップの大きさと電流パルスのパラメータを変更することによって、この技術は、薬理学的薬剤20,21を含む分子の種々のイオン導入注入のために使用することができる。このように、技術はまた、行動する動物を伴う神経薬理学的研究に有用である可能性があります。 結論 それは、多くの場合、一緒に非常に近接している脳の領域が著しく異なる特性及び/又は機能22を有することができる場合である。このような場合には、生物の行動に解剖学的に定義された領域からの単一ニューロンの活動に関連して神経回路や演算を理解するために重要です。現在の記事では、標準的な技術の組み合わせを使用してこれを達成するためのプロトコルを示し、例として、VPM視床ニューロンにおける感覚エンコーディングについて説明します。技術は、異なる動物モデルにおける脳領域と行動パラダイムの様々な適切かつ実行可能である可能性が高い。それは6,8アラート動物において単細胞juxtacellular標識よりも実質的に高い成功率を有し、およびマルチELEを利用する技術より良い解剖学的解像度の利点を有しているctrodeアレイまたはマイクロドライブ。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Fort Dodge | N/A | |
| Anased (Xylazine solution) | Lloyd Laboratories | N/A | |
| Betadyne (Povidone-Iodine) | CVS Pharmacy | 269281 | |
| Loctite 495 | Grainger Industrial Supply | 4KL86 | 20 - 40 cp cyanoacrylate |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Grip cement powder | Dentsply Intl | 675571 | For the base of the recording chamber |
| Grip cement liquid | Dentsply Intl | 675572 | For the base of the recording chamber |
| Silicone gel | Dow Corning | 3-4680 | |
| Jet denture repair acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Chicago sky blue | Sigma | C8679 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For perfusion and tissue fixation |
| Phosphate-buffered saline | Sigma | P3813 | For perfusion and tissue fixation |
| Cytochrome C | Sigma | C2506 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Diaminobenzidine | Sigma | D5905 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Rat sock | Sew Elegant (San Diego, CA) | N/A | Custom made, Figures 1, 4 |
| PVC tube 2 ½” | U.S. Plastic Co. | 34108 | Figure 4 |
| Subminiature D pins & sockets | TE Connectivity | 205089-1 | Figure 3 |
| Stainless steel music wire 0.010” diameter | Precision Brand Products, Inc. | 21010 | Figure 3 |
| Stereotaxic holding frame | Kopf Instruments | Model 900 | Figure 3 |
| Stereotaxic ear bars | Kopf Instruments | Model 957 | Figure 3 |
| Stereotaxic manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | Figure 3 |
| ½ mm drill burr | Henry Schein | 100-3995 | |
| Quiet-Air dental drill | Midwest Dental | 393-1600 | |
| Stainless steel 0-80 ⅛” screw | Fastener superstore | 247438 | Figure 3 |
| 0.2 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-407-8A | Figure 3 |
| Custom head-holding bar | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Custom head-holding plate | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Right angle post-clamp | Newport | MCA-1 | Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp. |
| 8-32 ¾” screw | Fastener Superstore | 240181 | For head-restraint, Figure 3 |
| 4-40 ¼” screw | Fastener Superstore | 239958 | For head restraint, Figures 3, 4 |
| Quartz capillary tubing | Sutter Instruments | QF-100-60-10 | Figure 5 |
| Carbon dioxide laser puller | Sutter instruments | P-2000 | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Microelectrode amplifier head stage | Molecular Devices | CV-7B | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems | Model 2100 | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Audio monitor | Radio Shack | 32-2040 | |
| Pipette holder | Warner Instruments | #MEW-F10T | Alternate parts: see Discussion, Figure 6A |
| Electrode lead wire | Cooner wire | NEF34-1646 | (optional), Figure 6D |
| Relay for amplifier head-stage | COTO Technology | #2342-05-000 | (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C |
| Digital video camera | Basler | A602fm | (optional) For behavioral monitoring, Figure 7 |
| Puralube vet ointment | Amazon.com, Inc | NC0138063 |
References
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