Summary
La aplicación de láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas (MS) directamente a caldo de cultivo de sangre acelera la identificación de bacterias. El método presentado es un método rápido y fiable para la identificación de bacterias Gram negativas directamente desde el caldo de cultivo de sangre.
Abstract
Una función importante de los laboratorios de microbiología clínica es proporcionar una rápida identificación de bacterias causantes de infección del torrente sanguíneo. Identificación tradicional requiere la sub-cultura de la señalada caldo de cultivo de sangre con identificación disponible sólo después de colonias en agar sólido han madurado. MALDI-TOF MS es un método fiable, rápido para la identificación de la mayoría de bacterias clínicamente relevantes cuando se aplica a las colonias en medios sólidos. La aplicación de MALDI-TOF MS directamente al caldo de cultivo de sangre es un enfoque atractivo, ya que tiene el potencial de acelerar la identificación de especies de bacterias y mejorar la gestión clínica. Sin embargo, un problema importante a superar es la eliminación de pre-análisis de interferencia resinas, proteínas y hemoglobina contenidas en las muestras para cultivo de sangre que, si no se elimina, interfieren con los espectros de MS y puede resultar en las puntuaciones de identificación de discriminación insuficientes o bajos. Además, es necesario concentrar bacteria para desarrollar espectros de calidad suficiente. El método que se presenta describe la concentración, purificación y extracción de las bacterias Gram negativas que permitan la identificación temprana de las bacterias de un caldo de cultivo de sangre señalado.
Introduction
Los pacientes con infección del torrente sanguíneo (BSI), debido a las bacterias continúan teniendo una alta mortalidad en el hospital, que van 6-48% 1. La entrega de antibiótico empírico adecuado promueve la supervivencia y en el subconjunto de pacientes con sepsis grave, cada retardo horas a la terapia apropiada se correlaciona con una menor supervivencia 2,3. En consecuencia, un objetivo clave del laboratorio clínico es detectar rápidamente, identificar y comunicar la presencia de bacterias en cultivos de sangre para informar las decisiones clínicas. Se ha demostrado que el laboratorio de microbiología tiene la mayor influencia en la terapia antimicrobiana en el momento de la presentación de informes de la tinción de Gram 4 y, recientemente, un estudio observacional demostró que el tiempo de desorción por láser asistida por matriz / ionización de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) realizado directamente en caldos de cultivo de sangre influir en la prescripción en más de una tercera parte de BSI causadas por bacterias Gram negativas 5.
6,7. La tecnología está ahora bien establecida y se ha integrado en muchos laboratorios para la identificación rápida y precisa de los microorganismos aislados en el 6,8 medios sólidos. La aplicación directa de MALDI-TOF MS para hemocultivo (BC) de caldo que se han señalado "positivo" para los microorganismos apela a los médicos y directores de laboratorio debido a la posibilidad de obtener una identificación más temprana de los microorganismos a bajo costo.
La utilidad clínica de la aplicación directa de MALDI-TOF MS de caldo de cultivo de sangre ha sido limitado por la amplia gama de sensibilidades observados cuando se compara con los métodos basados en la cultura fenotípica estándar de identificación, con los informes de la identificación con éxito de las bacterias Gram negativas que van desde 47 hasta 98,9 9-11%. La variación en la sensibilidad probablese refiere a la composición antes de Cristo caldo, la concentración bacteriana inicial, la variación en los métodos de preparación de muestras, así como la gama de organismos Gram negativos encontrados en las poblaciones de estudio 9. En comparación con estos otros protocolos publicados el método presentado aquí evita el uso de etanol, cloruro de amonio o (no-matriz) acetonitrilo adicional. Como resultado, el sedimento bacteriano se permanecer viable (hasta el punto de extracción de la proteína) que permite métodos potenciales de prueba de susceptibilidad fenotípica a ser aplicados directamente a estos organismos en el caldo. Además, el método que se presenta se ha demostrado para ser de bajo costo, confiable y rápida con la identificación de bacterias disponibles dentro de 25 min de los hemocultivos Gram resultados de la tinción, con un mínimo de "manos en" el tiempo 12.
Este método es un simple protocolo de spin-lisis de la casa utilizando la extracción con ácido fórmico aplicado directamente a los caldos de cultivo de sangre positivo para identificar Gram negativo bacteria con la tecnología MALDI-TOF MS.
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Protocol
1. Hemocultivos Caldos Marcar como "positiva"
- Retire el frasco de hemocultivo señalado desde el gabinete de incubación monitoreo continuo y colóquelo en una cabina de seguridad biológica. Nota: Las botellas pueden contener microorganismos peligrosos y precauciones universales deben ser seguidas. Debido al riesgo de aerosoles infecciosos en el muestreo, los procedimientos de muestreo deben realizarse en una cabina de flujo laminar de bioseguridad de Clase II.
2. Tinción de Gram se prepara
- Preparar una tinción de Gram del caldo de cultivo de sangre señalizado según los protocolos institucionales locales. Nota: Cuando los organismos Gram negativos se identifican en la microscopía del caldo de cultivo de sangre se procesa de acuerdo con el siguiente método. Cuando se identifican los organismos Gram positivos, un método molecular alternativa focalización identificación genética y los marcadores de resistencia se aplica al caldo (no se aborda en este artículo) 13.
- Mezcle suavemente el frasco de hemocultivo invirtiendo 2-3x.
- Dentro de la cabina de bioseguridad adjuntar una jeringa de 10 ml a un dispositivo de transferencia de sangre seguridad.
- Una el dispositivo de transferencia de sangre a la botella de cultivo de sangre y retirar 5 ml de caldo en la jeringa. Transferir el caldo BC aspirado en un tubo de separar el suero.
4. Concentración de Cultura sangre Caldo
- Centrifugar el tubo de separación de suero a 1250 xg durante 15 min que elimina un gran volumen de células rojas de la sangre.
- Aspirar y descartar el sobrenadante usando una pipeta de transferencia estéril teniendo cuidado de dejar aproximadamente 1 ml de la capa leucocitaria inmediatamente por encima de la interfaz de gel / líquido. Nota: Las botellas aeróbicas muestran una clara separación de las células rojas de la sangre a la parte inferior del tubo con la interfaz de gel / líquido que aparece de un color blanco opaco. En contraste, cuandoaplicado al caldo de cultivo de sangre anaeróbica lítico la interfaz de gel / líquido aparece como un color rojo intenso debido a los componentes de las células rojas de la sangre lisadas permaneciendo en suspensión en el sobrenadante.
5. Repita los pasos de centrifugación Wash
- Mezcle suavemente los últimos 1 ml de líquido de la capa leucocitaria por encima de la interfaz de gel con una pipeta estéril y luego transferir todo el volumen en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar el nuevo tubo a 288 g durante 30 seg.
- Transferir el sobrenadante usando una pipeta de transferencia desechable de 1 ml de plástico en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y desechar el tubo con el sedimento. Nota: Es muy importante en este paso que se tiene cuidado de evitar la transferencia de la pastilla. Esto es particularmente importante para un espécimen que se procesa de la botella antes de Cristo anaeróbica como el sobrenadante permanece pigmentada y el sedimento no se ve siempre claramente.
6. La lisis de las células residuales
7. Extracción de Proteínas Bacterianas
- Aspirar y desechar el sobrenadante, utilizando de nuevo la aspiración con una pipeta de punta fina asegurar que se elimina la mayor cantidad de líquido posible.
- Resuspender el precipitado en 10 l de ácido fórmico (70% v / v). Nota: El ácido fórmico puede afectar al organismo si es inhalado o si entra en contacto con la piel. Al preparar o manipular soluciones es recommended que el personal utilizan un gabinete de humos, además de los equipos de protección personal.
- Mezclar bien usando la pipeta para asegurar una solución homogénea resuspendido. Uso de la punta de la pipeta para romper físicamente la pastilla puede ser necesario para asegurar una solución más homogénea.
8. Preparación de MALDI-TOF Target Plate
- Inocular una placa objetivo clean MALDI-TOF con 2 l de la suspensión dispuesta por lugar de destino. Preparar 3 sitios diana para cada muestra para contrarrestar el problema ocasional de lecturas fallado.
- Deje que la placa del objetivo MALDI-TOF se seque. La velocidad de secado se puede aumentar mediante la colocación de la placa en el borde de la campana de humos para maximizar el flujo de aire a través de la placa.
- Superposición de cada punto se secó con 1 l de la solución de matriz (10 mg / ml de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA), 50% de acetonitrilo, ácido trifluoroacético 2,5%). Nota: La solución de la matriz puede afectar al organismo si es inhalado o si entra en contact con la piel. Al preparar o manipular soluciones, se recomienda que el personal utiliza un armario de humos, además de los equipos de protección personal.
- Deje que la placa del objetivo MALDI-TOF se seque sobre el borde de la campana extractora de humos como se describió anteriormente. Asegurar una preparación homogénea llena cada uno de los lugares de destino en el plato.
9. Place MALDI-TOF Target Plate en el espectrómetro de masas
- Inserte la placa del objetivo MALDI-TOF en el espectrómetro de masas MALDI-TOF. Asegúrese de que la placa está sentado a ras con las placas de resorte. Nota: No inserte la placa del objetivo hasta que todos los puntos de destino están secos.
- Asegúrese de que la junta de goma esté libre de pelusa, polvo y el pelo para que las condiciones de vacío requeridas pueden ser creados.
- Cierre la tapa etapa MALDI-TOF y luego presione el botón "in / out" en la parte frontal del instrumento. La tapa ahora bloquear y permitir que el vacío necesario que se creará.
10. MALDI-TOF MS SPECTRA Adquisición
- Abra el MALDI biotipificación y software FlexControl.
- Dentro del software Typing seleccionar "nueva clasificación" en el menú desplegable titulado "archivo". Asigne un nombre al proyecto y, a continuación, seleccione "nuevo". Seleccione "Siguiente" para completar la configuración en el software de mecanografía.
- Dentro de la ventana del software de control de identificar el gráfico en pantalla de la tablilla de puntería. Resalte los puntos objetivo MALDI-TOF que están en uso, moviendo el ratón sobre los puntos inoculados mientras mantiene pulsado el botón izquierdo del ratón.
- Utilice el botón derecho del ratón para hacer clic en cualquier lugar de las posiciones de destino seleccionados y luego seleccione "agregar analitos" en el menú desplegable.
- Añadir sanguíneos cultura datos identificativos de la columna "ID" para cada uno de los lugares de destino y haga clic en "Siguiente" cuando haya terminado.
- Seleccione la "taxonomía" base de datos de espectros comerciales y seleccione "siguiente". Nota: Laborios pueden utilizar adicional en-casa o bases de datos comerciales para aumentar el número de espectros de referencia.
- Haga clic en "Finalizar" y el MALDI-TOF MS se iniciará la generación de espectros. Nota: Los ajustes de MALDI-TOF fueron según la configuración de la producción (modo lineal positiva, 60 Hz de frecuencia láser, 20 kV de tensión de aceleración, 16,7 kV de tensión IS2, 170 de retardo de extracción de nanosegundos, y 2,000-20,137 rango m / z).
- Si el software de control de MALDI no genera picos, se puede realizar la adquisición manual de los espectros (método no se describe).
11. Interpretación Análisis del anuncio de MALDI-TOF MS Partituras
- Una vez que los espectros son adquiridos y el análisis esté completo, seleccione el botón "+" al lado de la identificación de especies en el software de mecanografía para expandir la lista de identificación para cada destino.
- Estudie los 5 mejores identificaciones, observando si el top 5 son similares. Top discordantes 5 géneros con puntuaciones ≥ 1.7 del mismo objetivopunto planteó la posibilidad de caldos mixtos. Nota: la tecnología MALDI-TOF tiene poca sensibilidad para la detección de caldos mixtos. Por ejemplo, cuando un caldo contiene especies mixtas una puntuación alta confianza puede ser identificado por sólo una de las especies mixtas.
- Cuando una puntuación ≥ 2,0 se caracteriza por el mayor partido en el lugar de destino, el informe de la especie.
- Cuando la puntuación más alta en un punto de destino es ≥ 1,7, pero <2,0, sólo informamos de los géneros. Si los criterios adicionales de los 5 mejores identificaciones son concordantes, a continuación, informe a nivel de especie.
12. La eliminación de la placa de MALDI-TOF Target
- Cuando todos los espectros son el botón de "in / out" en la máquina MALDI-TOF de prensa.
- Abra el MALDI-TOF receptáculo tablilla de puntería y retire la placa del objetivo MALDI-TOF.
- Si se utiliza una placa reutilizable diana MALDI-TOF, limpie todos los puntos de destino mediante el alcohol y almacenar la placa de MALDI-TOF a TA una vez que esté limpio y seco.
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Representative Results
La generada MALDI-TOF MS espectros se comparan con la base de datos de referencia integrado de los espectros. Una puntuación logarítmica es asignado por la confianza del partido entre el aislado de prueba y la base de datos de referencia de los aislamientos, con la recomendación de un puntaje ≥ 1,7 requerida para su identificación a nivel de género probable (Figura 1) y ≥ 2,0 para la identificación probable de especies (Figura 2). Informe a nivel de especie cuando la puntuación ≥ 1,7 y los primero 5 identificaciones emparejado por el software de escribir es consistente (Figura 1) 12. La Figura 3 muestra el resultado cuando se analiza un caldo de cultivo de sangre de especies mixtas, en este caso Escherichia coli y Serratia marcescens. Tenga en cuenta los 5 primeros espectros coincidentes son discordantes. Se ha demostrado previamente que los géneros mixtos sólo estará identificado por este método en aproximadamente el 30% de los caldos mixtas 12. Es importante tener en cuenta que con un caldo mixto es posible que un informe consistente de una sola especie con una alta puntuación de confianza. Tabla 1 resume los resultados previamente publicados del estudio de verificación de este método en el que logra el 91,8% de los caldos monomicrobial una puntuación de MALDI-TOF de> 1,7, con un 100% y un 97,0% de concordancia de género y especie, respectivamente 12.
Figura 1. El MALDI-TOF MS genera espectros de Escherichia coli con una puntuación logarítmica de 1.861. A la derecha, los primeros 5 partidos identificados por el software de mecanografía. Tenga en cuenta que la especie se reporta constantemente como Escherichia coli. Con el marcador de 1.861 y con los 5 primeros partidos siendo E. coli se considera la identificación fiable a nivel de especie 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. El MALDI-TOF MS genera espectros de Pseudomonas aeruginosa con una puntuación logarítmica de 2.216. A la derecha, los primeros 5 partidos identificados por el software de mecanografía. Tenga en cuenta que la especie se reporta constantemente como Pseudomonas aeruginosa. Con la alta puntuación de 2,216 la identificación se considera fiable a nivel de especie de identificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. El MALDI-TOF MS genera espectros para un caldo de cultivo de sangre mixta que contiene Escherichia coli y Serratia marcescens A la derecha. Son los primeros 5 partidos identificados por el software de mecanografía, que rinde cuentas Escherichia coli y Serratia marcescens en los primeros 5 espectros emparejado . Esta géneros mixtos sólo se identifica en aproximadamente un tercio de cultivos de caldo mixtos 12. Versiones mejoradas de software en el futuro pueden mejorar la detección de cultivos mixtos. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Datos de la Tabla 1. Verificación comparan MALDI-TOF MS realizan directamente en el caldo de cultivo de sangre, con la consiguiente identificación fenotípica en colonias subcultivados. Identificación concordante requiere una puntuación de espectrometría de masas en la cultura de la sangre caldo ≥ 1,7. Esta tabla está adaptada de una publicación previa 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Es importante aplicar el MALDI-TOF MS de caldo de cultivo de sangre que los pasos posteriores a la centrifugación se llevan a cabo con el cuidado suficiente para no volver a mezclar los componentes separados. Es particularmente importante para eliminar los constituyentes de cultivos de sangre y proteínas celulares humanos, incluyendo la hemoglobina, que pueden producir picos de interferencia con los espectros de MALDI-TOF.
Aunque MS fabrica recomendar cortar de puntuación de ≥ 2,0 para las especies y ≥ 1,7 para la identificación de género, otros informes han sugerido las puntuaciones más bajas (rango logarítmico ≥ 1,4 y ≥ 1,6) se pueden implementar cuando se aplica a BC caldo 10,12,14-18. La implementación de las puntuaciones más bajas de identificación de EM en los laboratorios de microbiología clínica sólo debe considerarse después de procedimientos de normalización y validación locales apropiadas.
Espectros de vez en cuando los pobres son generados por este método que, o bien no se corresponde, ni se reportan con low puntuaciones de confianza. Realización por duplicado o triplicado puntos para cada aislamiento puede reducir las molestias de repetir el experimento cuando falla un solo punto. Con poca frecuencia, todos los puntos duplicados no puntuarán suficiente para su identificación. La causa de la mala identificación puede ser debido a los conjuntos de la base de datos incompletos, o más comúnmente, como resultado de una concentración de partida bajo de bacterias en el caldo de cultivo de sangre. En un conjunto de validación publicada por el método presentado una veintena de <1,7 fue encontrado en el 8% de los aislados clínicos y tenía un ligero predominio cuando se realiza en frascos de hemocultivo anaeróbicas 12.
Tecnología MS MALDI-TOF es incapaz de separar todas las bacterias Gram negativas clínicamente encontradas incluso cuando aísla en medios sólidos. Por ejemplo, E. coli no se distinguirá de las especies de Shigella y los géneros Salmonella no puede ser especiación. Como se indica en los resultados, es importante reconocer ªa cuando se utiliza MALDI-TOF directamente en caldo de cultivo de sangre la sensibilidad para la detección de especies mixtas es baja 11,12,18,19.
En general, este enfoque ofrece un método rápido, barato, y fiable para la identificación de más del 90% de las bacterias Gram cultivo de sangre negativo aísla dentro de 25 min de una señalización de caldo de cultivo de sangre.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer - Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 ml | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 ml) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
References
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