Summary
Tillämpningen av matris-assisterad laserdesorption / jonisering time of flight (MALDI-TOF) masspektrometri (MS) direkt till blododlingsbuljongen påskyndar identifiering av bakterier. Denna metod är en snabb och tillförlitlig metod för identifiering av Gram-negativa bakterier direkt från blododlingsbuljongen.
Abstract
En viktig uppgift för den kliniska mikrobiologiska laboratoriet är att ge snabb identifiering av bakterier som orsakar blodomloppet infektion. Traditionell identifikation kräver subkultur av signalblododlingsbuljong med identifiering endast tillgänglig efter kolonier på fast agar har mognat. MALDI-TOF-MS är en pålitlig och snabb metod för identifiering av de flesta kliniskt relevanta bakterierna när de anbringas på kolonier på fasta medier. Tillämpningen av MALDI-TOF MS direkt till blododlingsbuljong är en attraktiv lösning eftersom det har potential för att påskynda identifieringen av bakteriearter och förbättra klinisk ledning. Men ett viktigt problem att lösa är den pre-analys borttagning av störande hartser, proteiner och hemoglobin som finns i blododlingsprover som, om den inte tas bort, störa MS spektra och kan resultera i otillräckliga eller låga diskriminering identifieringsresultat. Dessutom är det nödvändigt att koncentrera bacterbl.a. att utveckla spektra av tillräcklig kvalitet. Denna metod beskriver koncentrationen, rening och utvinning av gramnegativa bakterier som möjliggör tidig identifiering av bakterier från en signalblododlingsbuljong.
Introduction
Patienter med blodomloppet infektioner (BSI) på grund av bakterier fortsätter att ha höga mortaliteten under sjukhusvistelsen, allt från 6 till 48% 1. Leveransen av lämpliga empiriska antibiotika främjar överlevnad och i den undergrupp av patienter med svår sepsis, varje timmes fördröjning till lämplig terapi korrelerar till minskad överlevnad 2,3. Således är ett centralt mål i kliniska laboratorier för att snabbt upptäcka, identifiera och kommunicera förekomsten av bakterier i blododlingar för att informera kliniska beslut. Det har visats att det mikrobiologiska laboratoriet har det största inflytandet på antimikrobiell behandling vid tidpunkten för redovisning av gramfärgning 4 och nyligen visade en observationsstudie som matris-assisterad laser desorption / jonisering time of flight masspektrometri (MALDI-TOF MS) utföras direkt på blod odlingsbuljonger påverkar förskrivning i mer än en tredjedel av BSI orsakade av gramnegativa bakterier 5.
6,7. Tekniken är nu väl etablerad och har integrerats i många laboratorier för snabb och korrekt identifiering av mikroorganismer som isolerats på fasta medier 6,8. Den direkta tillämpningen av MALDI-TOF MS till blododling (BC) buljong som har signalerat "positiva" för mikroorganismer talar både kliniker och laboratoriechefer på grund av risken för att få en tidigare identifiering av mikroorganismer till låg kostnad.
Den kliniska nyttan av en direkt tillämpning av MALDI-TOF MS till blododlingsbuljong har begränsats av de många känsliga frågor som konstaterats i jämförelse med standard fenotypisk kultur baserade metoder för identifiering, med rapporter om framgångsrik identifiering av gramnegativa bakterier som sträcker sig från 47 till 98,9 % 9-11. Variationen i känslighet sannoliktavser BC buljong sammansättning, initial bakteriekoncentrationen, variation i provberedningsmetoder samt den rad av gramnegativa organismer påträffas i studiepopulationer 9. I jämförelse med dessa andra publicerade protokoll den metod som presenteras här undviker användningen av etanol, ammoniumklorid eller ytterligare (icke-matris) acetonitril. Som ett resultat av den bakteriella pellets kommer att förbli livskraftig (till den punkt av proteinutvinning) som gör det möjligt för potentiella fenotypisk resistens testmetoder som ska tillämpas direkt på dessa organismer i buljong. Dessutom har den presenterade metoden visat sig vara billig, pålitlig och snabb med bakteriell identifiering tillgänglig inom 25 min av de blododlingsGramFärgning resultat, med minimala "händer" tid 12.
Denna metod är en enkel in-house spin-lys-protokollet med användning av myrsyra extraktion appliceras direkt positiva blododlingsbuljongerna för att identifiera gramnegativa bacteria med MALDI-TOF-MS-tekniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Blood odlingsbuljonger Flagga som "positiv"
- Ta det signalerade blododlingsflaskan från kontinuerlig övervakning inkubation skåp och placera den i ett biologiskt säkerhetsskåp. OBS: Flaskor kan innehålla farliga mikroorganismer och universella försiktighetsåtgärder måste följas. På grund av risken för smittsamma aerosoler i provtagningen måste alla provtagningsförfaranden utföras i en biosäkerhet klass II laminärt flöde skåp.
2. Gramfärgning framställes
- Förbered en gramfärgning från signalerade blododlingsbuljong enligt lokala institutionella protokoll. Obs: När gramnegativa organismer identifieras på mikroskopi blododlingsbuljongen behandlas enligt följande metod. När grampositiva organismer identifieras, är ett alternativt molekylär metod riktar genetisk identifiering och resistensmarkörer appliceras på buljong (inte i denna artikel) 13.
- Blanda försiktigt blododlingsflaskan genom att vända 2-3x.
- Inom biosäkerhet skåpet bifoga en 10 ml spruta till en överföringssäkerhet blodenhet.
- Fäst blodöverföringsanordningen till blododlingsflaska och dra tillbaka 5 ml av buljongen i sprutan. Överför aspire BC buljongen i ett serum som skiljer rör.
4. Koncentration av blododlingsbuljong
- Centrifugera serum separerar röret vid 1250 xg under 15 min, som avlägsnar en stor volym av röda blodkroppar.
- Aspirera och kassera supernatanten med en steril överföringspipett var noga med att lämna ca 1 ml av lättcellskoncentratet omedelbart ovanför gelen / vätskan gränssnitt. Anm: De aeroba flaskorna visar en tydlig separation av röda blodkroppar till botten av röret med gel / flytande gränssnitt visas en ogenomskinlig vit färg. När däremotappliceras på den lytiska anaerob blododlingsbuljong gel / vätskegränsytan visas som en djup röd färg på grund av de lyserade röda blodkroppskomponenterna förblir suspenderad i supernatanten.
5. Upprepa Centrifuge Wash Steps
- Blanda försiktigt de sista 1 ml buffy coat vätska ovanför gelen gränssnitt med en steril pipett och sedan överföra hela volymen i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera det nya röret vid 288 x g under 30 sek.
- Överför supernatanten med hjälp av en plast disponibel 1 ml överföringspipett in i en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör och släng röret med pellets. OBS: Det är viktigt i detta steg att försiktighet iakttas för att undvika överföring av pelleten. Detta är särskilt viktigt för ett prov som bearbetas från den anaeroba BC flaskan som den överstående förblir pigmenterade och pelleten inte alltid tydligt.
6. Lys av återstående celler
7. Extraktion av bakterieproteiner
- Aspirera och kassera supernatanten, återigen med hjälp av aspiration med en fin spets pipett se till att så mycket vätska som möjligt tas bort.
- Återsuspendera pelleten i 10 | il myrsyra (70% volym / volym). OBS: Myrsyra kan påverka kroppen, om den inandas eller om det kommer i kontakt med huden. När man förbereder eller manipulera lösningar är recommended att personalen använder dragskåp utöver personlig skyddsutrustning.
- Blanda väl genom att använda pipetten för att säkerställa en homogen suspenderas lösning. Med användning av pipettspetsen för att fysiskt störa pelleten kan vara nödvändigt för att säkerställa en mer homogen lösning.
8. Framställning av MALDI-TOF-måltavla
- Inokulera en ren MALDI-TOF måltavla med 2 | il av det beredda suspensionen per målpunkten. Bered 3 målställen för varje prov för att övervinna den enstaka problemet misslyckats läsningar.
- Låt MALDI-TOF måltavla för att torka. Graden av torkning kan ökas genom att placera plattan på kanten av dragskåpet för att maximera luftflödet tvärs över plattan.
- Overlay varje torkad fläck med ett pl av matrislösning (10 mg / ml α-cyano-4-hydroxikanelsyra (HCCA), 50% acetonitril, 2,5% trifluorättiksyra). OBS: Matrix-lösning kan påverka kroppen, om den inandas eller om det kommer i contact med huden. När man förbereder eller manipulera lösningar rekommenderas att personalen använder dragskåp utöver personlig skyddsutrustning.
- Låt MALDI-TOF måltavla för att torka på kanten av dragskåpet som beskrivits ovan. Säkerställa en homogen beredning fyller var och en av rikt fläckar på plattan.
9. Placera MALDI-TOF måltavla i masspektrometer
- Sätt i MALDI-TOF-måltavlan i MALDI-TOF masspektrometer. Se till att plattan sitter i jämnhöjd med de fjäderbelastade plattor. OBS: Sätt inte i måltavlan tills alla mål fläckar är torra.
- Se till att gummitätningen är ren ludd, damm och hår för att tillåta de erforderliga vakuumförhållanden kan skapas.
- Stäng skede lock MALDI-TOF och tryck sedan på "in / ut"-knappen på framsidan av instrumentet. Locket kommer nu att låsa och möjliggöra nödvändig vakuum ska skapas.
10. MALDI-TOF-MS-Spectra Acquisition
- Öppna MALDI Biotyping och Flexcontrol programvara.
- Inom Typing programvara väljer "ny klassificering" från rullgardinsmenyn med titeln "fil". Namnge projektet och välj sedan "nytt". Välj "Nästa" för att slutföra installationen inom Typing mjukvaran.
- Inom programmet Kontroll identifiera den grafiska skärm av måltavlan. Markera de MALDI-TOF mål fläckar som är i bruk genom att flytta musen över de ympade fläckar samtidigt som du håller ner vänster musknapp.
- Använd höger musknapp för att klicka var som helst på de utvalda målgrupp positioner och välj sedan "lägga Analyter" från rullgardinsmenyn.
- Lägg blod kultur identifieringsuppgifter till "ID" kolumnen för var och en av målgrupp fläckar och klicka på "Nästa" när du är klar.
- Välj den kommersiella "taxonomi" spektra databas och välj "nästa". Notera: Laborier kan utnyttja ytterligare in-house eller kommersiella databaser för att öka antalet referensspektra.
- Klicka på "finish" och MALDI-TOF MS kommer att påbörjas generera spektra. OBS: MALDI-TOF-inställningar var enligt tillverkarens inställningar (linjär positiv läge, 60 Hz laser frekvens, 20 kV accelerationsspänning, 16,7 kV IS2 spänning, 170 ns utvinning fördröjning, och 2,000-20,137 m / z range).
- Om MALDI kontroll programvara misslyckas med att generera toppar, kan manuell förvärv av spektra utföras (metoden inte beskrivs).
11. Inlägg Analys Tolkning av MALDI-TOF MS poäng
- När spektra förvärvas och analysen är klar väljer du "+"-knappen bredvid artbestämning på Typing programvara för att utöka identifieringslista för varje mål.
- Studera de 5 identifikationer, notera om topp 5 är liknande. Disharmoniska topp 5 släkten med poäng ≥ 1.7 i samma målplats tog upp möjligheten av blandade buljonger. OBS: MALDI-TOF-tekniken har dålig känslighet för detektion av blandade buljonger. Till exempel när en buljong innehåller blandad art en hög tilltro värdering kan identifieras för bara en av de blandade arter.
- När en poäng ≥ 2,0 är känd för den högsta matchen på ett mål plats, rapporterar arten.
- När den högsta poängen på ett mål plats är ≥ 1,7, men <2,0, rapporterar bara släkten. Om ytterligare kriterier för de 5 identifieringar är samstämmiga, sedan rapportera till artnivå.
12. Avlägsnande av MALDI-TOF-måltavla
- När alla spektra är klar trycker du på "in / ut"-knappen på MALDI-TOF maskin.
- Öppna MALDI-TOF måltavla kärlet och avlägsna MALDI-TOF måltavla.
- Om du använder en återanvändbar MALDI-TOF måltavla, rena alla mål fläckar som använder alkohol och lagra MALDI-TOF plattan vid rumstemperatur när den är ren och torr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den genererade MALDI-TOF MS-spektra jämförs med den integrerade referensdatabas av spektra. En logaritmisk poäng tilldelas för det förtroende av matchen mellan testisolat och referensdatabasen isolat, med rekommendation av en poäng ≥ 1.7 krävs för sann identifiering till släkten nivå (figur 1) och ≥ 2,0 för sann identifiering av arter (Figur 2). Rapport till artnivå när poängen ≥ 1,7 och de första 5 identifikationer matchas av Typing programvara är konsekvent (figur 1) 12. Figur 3 visar resultatet när en blododlingsbuljong av blandade arter analyseras, i det här fallet Escherichia coli och Serratia marcescens. Notera de 5 matchade spektra är disharmonisk. Det har tidigare visats att blandade släkten endast kommer att identifieras med denna metod i cirka 30% av blandade buljonger 12. Det är viktigt att vara medveten om att det är möjligt med en blandad buljong för en enhetlig rapport av en enda art med ett högt förtroende poäng. Tabell 1 sammanfattar de tidigare publicerade resultat från kontrollundersökning av denna metod, där 91,8% av monomicrobial buljonger uppnådda en MALDI-TOF poäng av> 1,7, med 100% och 97,0% konkordans till släkte och art, respektive 12.
Figur 1. MALDI-TOF MS genererade spektra för Escherichia coli med en logaritmisk poäng på 1.861. Till höger är de första fem matcherna identifierats av Typing mjukvaran. Observera att arten alltid anges som Escherichia coli. Med poängen 1.861 och med de bästa fem matcher är E. coli identifiering anses tillförlitlig till artnivå 12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. MALDI-TOF MS genererade spektra för Pseudomonas aeruginosa med en logaritmisk poäng på 2.216. Till höger är de första fem matcherna identifierats av Typing mjukvaran. Observera att arten alltid anges som Pseudomonas aeruginosa. Med höga poäng av 2.216 identifieringen anses tillförlitliga till artnivå för identifiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. MALDI-TOF MS genererade spektra för en blandad blododlingsbuljong innehållande Escherichia coli och Serratia marcescens. Till höger är de första fem matcherna identifierats av Typing programvara som rapporterar både Escherichia coli och Serratia marcescens i första 5 matchas spektra . Detta blandade släkten är endast identifieras i ungefär en tredjedel av blandade buljongkulturer 12. Förbättrade versioner av programvaran i framtiden kan förbättra upptäckten av blandade kulturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
0 "/>
Tabell 1. Verifierings data som jämför MALDI-TOF MS utföras direkt på blododlingsbuljong med efterföljande fenotypisk identifiering på subkultur kolonier. Concordant identifikation krävs en masspektrometri poäng på blododlingsbuljong ≥ 1,7. Denna tabell är anpassad från en tidigare publikation 12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är viktigt vid tillämpningen av MALDI-TOF MS att blododlingsbuljong som de post centrifugeringssteg utförs med tillräcklig omsorg inte att mixa de separerade komponenterna. Det är särskilt viktigt att ta bort de blododlings beståndsdelar och humana cellproteiner, inklusive hemoglobin, som kan producera spikar stör MALDI-TOF-spektra.
Även om MS tillverkar rekommenderar skärs av poäng på ≥ 2,0 för arter och ≥ 1,7 för genus identifiering, har andra rapporter föreslagit lägre logaritmiska poäng (intervall ≥ 1,4 till ≥ 1,6) kan genomföras när det tillämpas på BC buljong 10,12,14-18. Genomförandet av lägre MS identifieringsresultat i kliniska mikrobiologiska laboratorier bör endast övervägas efter lämpliga lokala regelverk och valideringsförfaranden.
Ibland fattiga spektra genereras av denna metod som antingen inte matchas, eller redovisas med low förtroende poäng. Utföra dubbel eller tredubbel fläckar för varje isolat kan minska olägenheterna av att upprepa experimentet när en enda fläck misslyckas. Sällan kommer alla dubblerade fläckar poäng inte tillräckligt för identifiering. Orsaken till den dåliga identifiering kan bero på ofullständig databasuppsättningar, eller mer allmänt, som ett resultat av en låg utgångskoncentrationen av bakterier i blododlingsbuljongen. I en publicerad valideringsuppsättning för den presenterade metoden en poäng på <1,7 påträffades i 8% av kliniska isolat och hade en liten övervikt när det utförs på anaeroba blododlingsflaskor 12.
MALDI-TOF MS-teknik inte kan separera alla kliniskt stött på gramnegativa bakterier även när isolerade på fasta medier. Till exempel E. coli kommer inte skiljas från Shigella arter och Salmonella släkten kan inte specieras. Som framgår av resultaten är det viktigt att inse thpå vid användning av MALDI-TOF direkt på blododlingsbuljong känsligheten för detektion av blandade arter är låg 11,12,18,19.
Sammantaget erbjuder denna metod en snabb, billig och tillförlitlig metod för identifiering av över 90% av gramnegativ blododlingsisolat inom 25 min av en blododlingsbuljong signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer - Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 ml | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 ml) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
References
- Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
- Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
- Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
- Clerc, O., Prod'hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
- Dekker, J. P., Branda, J. A. MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
- Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
- March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
- Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
- Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
- Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
- Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
- Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
- Novel,, et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
- Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).
