Summary
Der er en mærkbar behov for bedre information om molekylære førere af Barretts øsofagus. Immunfluorescensfarvning er en nyttig teknik til at forstå virkningerne af cellesignalering på cellemorfologi. Vi præsenterer en enkel, effektiv protokol til anvendelse af immunfluorescensfarvning at vurdere terapeutisk behandling i Barretts øsofagus celler.
Abstract
Esophageal adenokarcinom (EAC) har en samlet overlevelse på mindre end 17%, og forekomsten af ØK er steget dramatisk i løbet af de sidste to årtier. En af de primære risikofaktorer for ØK Barretts øsofagus (BE), en metaplastisk ændring af den normale skællede esophagus reaktion på kronisk halsbrand. På trods af den veletablerede sammenhæng mellem ØK og BE, afhøring af de molekylære begivenheder, især ændrede signalveje der involverer progression af BE til ØK, er dårligt forstået. Meget af dette skyldes manglen på egnede in vitro-modeller til at studere disse sygdomme. For nylig har udødeliggjort BE cellelinjer bliver kommercielt tilgængelige giver mulighed for in vitro-undersøgelser af BE. Her præsenterer vi en metode til immunfluorescensfarvning af udødeliggjort BE cellelinjer, så in vitro karakterisering af cellesignalering og struktur efter udsættelse for terapeutiske forbindelser. Anvendelsen af disse teknikker vil Help udvikle indsigt i de mekanismer, der er involveret i at BE ØK progression og give potentielle muligheder for behandling og forebyggelse af ØK.
Introduction
Barretts øsofagus (BE) er en metaplastisk ændring i den normale pladeepitel i spiserøret og en konsekvens af kronisk eksponering for maveindholdet følge af gastroøsofageal refluks sygdom (GERD) 1.. BE menes at være en beskyttende mekanisme som svar på GERD, men tilstedeværelsen af BE bibringer en øget risiko for esophageal adenocarcinom (EAC), en sygdom, som medfører signifikant ringe overlevelse 1. Aktuelle skøn tyder på, at op til 5,6% af den amerikanske befolkning har BE, men som BE er ofte asymptomatisk, menes det, at størstedelen af BE forbliver udiagnosticeret 2. Da forekomst af både Gerd og ØK har oplevet fortsat vækst 3, er det blevet vigtigt at forstå de molekylære mekanismer involveret i udviklingen af BE til ØK, især da disse oplysninger kunne potentielt give terapeutiske tilgange til forebyggelse af progression af BE til ØK.
1. Kronisk betændelse, skade, og genotoksisk skade som følge af langvarig udsættelse for maveindhold lægge selektivt pres på BE læsion fremme neoplastisk progression til ØK. En række genetiske ændringer er blevet identificeret i løbet af BE til ØK progression. Men på trods af dette er der en udpræget mangel på forståelse for de præcise ændringer i celle signalering og efterfølgende virkninger på celle struktur og funktion.
Udødeliggjort i vitro cellelinjer er nyttige værktøjer til at studere effekterne af celle signalering, især i at undersøge effekten af målrettede terapeutiske forbindelser. Den seneste kommercielle tilgængelighed af udødeliggjorte BE cellelinjer giver mulighed for sådanne undersøgelser. Selv high-throughput assays, såsom de udbredte levedygtighed assays, kan være værdifulde i at vurdere virkningerne af målrettede behandlinger upon celledeling og survival 4-6, disse analyser er ikke nyttigt for afhører virkningerne af cellesignalering upon celle morfologi. Immunfluorescensfarvning (IF) er en nyttig teknik til at undersøge effekten af målrettede behandlinger upon de morfologiske, vækst og overlevelse karakteristika af celler og de proteiner, der er involveret. Vores laboratorium har tilpasset disse metoder mod udødeliggjort BE cellelinjer, ved hjælp af IF at evaluere effekten af en klinisk tilgængelig lægemiddel på BE cellelinjer i håb om at afgrænse en mulig chemopreventative behandling og biomarkør for narkotikabehandling 7. Tilsvarende anvendelse af disse teknikker i ØK, BE og udødeliggjorte esophageal cellelinjer har afgrænset kritiske resultater vedrørende BE til ØK progression 8-10. Vi finder IF analyse af BE celler behandlet med målrettede behandlinger har værdi, der giver mulighed for karakterisering af ændringerne i cellestruktur og protein lokalisering. Her præsenterer vi vores metoder til IF af udødeliggjorte BE celler til characterize medicinsk behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellelinje Vedligeholdelse
- Immortaliseret human BE high-grade dysplastiske (CP-B, CP-C, CP-D) og metaplastisk (CP-A) cellelinier ved stabil transfektion af den humane telomerase-revers transkriptase (TERT)-protein 11.
- Oprethold BE cellelinjer i keratinocyt medier suppleret med ekstrakt fra bovin hypofyse (BPE), epidermal vækstfaktor (EGF), 5% føtalt bovint serum (FBS), ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), penicillin-streptomycin-neomycin (PSN), og standard væv dyrkningsbetingelser (37 ° C, 5% CO 2, 98% luftfugtighed).
2.. BE Celleudpladning
- Fremstilling af 12-brønds plade / dækglas. Placer 18 mm dækglas i et glas petriskål og autoklaver. Overførsel autoklaveret 18 mm dækglas i en 12-brønds vævsdyrkningsskål anvendelse af en steril glaspipette fastgjort til et vakuumrør. Vask dækglasset med sterilt PBS og medier.
- Trypsinisér og tælle udødeliggjorte BE celler. Tæl celler using en automatiseret celle tæller eller et hæmocytometer. Fortynd celler i kultur til en koncentration på 20.000-40.000 celler / ml.
- Anbringes 1 ml af celler i hver brønd, der indeholder et dækglas til et samlet celletal på 20.000-40.000 celler / brønd.
- Brug en steril pipettespids skub forsigtigt dækglas til bunden af brønden for at sikre, at celler tillægger dækglasset.
3.. Drug Behandling af BE Cells
- Fortynd valgte lægemiddel i varme (37 ° C) medier til den ønskede koncentration og blandes godt ved at vende røret gange eller ved hjælp af en vortex-blander. Bestemt narkotika koncentrationer empirisk. Begynde behandling 24 timer efter den første udsåning af BE-celler for at tillade celler fastgørelse på dækglasset
- Til sammenligning og kontrol, behandle en ekstra dækglas af BE celler med 0,1% køretøj (dimethylsulfoxid [DMSO] eller middel, der anvendes til at opløse forbindelse) fortyndet i dyrkningsmedier. Label plade med en lab pen til at identificere narkotika og vetøjets behandlede prøver. Placer celler i en cellekultur inkubator indstillet til 37 ° C, 5% CO2, 98% luftfugtighed og inkuberes i de ønskede tidspunkter.
4.. Immunfluorescensfarvning
- Fiksering
- Efter den ønskede inkubationstid på lægemiddelbehandling, aspireres medierne og vaskes dækglassene hurtigt med 1x phosphatpufret saltvand (PBS) ved stuetemperatur (RT, 25 ° C).
- Aspirer PBS og tilsættes 1 ml af PBS indeholdende 4% PFA [4% PFA / PBS] til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Aspirer 4% PFA / PBS og vaske dækglas 3x, 5 min hver med PBS ved RT. Store dækglas i en uge i PBS/0.1% PFA ved 4 ° C, hvis det ønskes.
- Permeabilisering / Blokering
Permeabilisere faste PFA-celler for at tillade antistoffet at gå til det intracellulære mål. For ekstracellulære dukket proteiner, udføre alle efterfølgende trin uden saponin tilføjet til 1x PBS/0.5% BSA-opløsning.- Reducere baggrundsstøj ved inkubering med 50 mM NH4CI fortyndet i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur og vaskes med RT PBS gang i 5 min.
- Inkuber være celler, i 30 minutter i 100-300 pi PBS indeholdende 0,1% saponin og 0,5% bovint serumalbumin (BSA). Fortyndet saponin fra filtersteriliseret 10% lager, tilberedes i vand og opbevaret ved 4 ° C.
- Fremstilling af human Afdeling
- Forbered en firkantet bioassay fad ved lagdeling bunden af kammeret med våde papirservietter og placere et lag af Parafilm på toppen.
- Overføre forsigtigt dækglas celler vender opad, på Parafilm med pincet og en kanyle.
- Markér Parafilm med en lab pen til at identificere dækglas.
- Primary Antibody Inkubation
- Fortynd det primære antistof i PBS indeholdende både 0,5% BSA og 0,1% saponin.
- Dup fra den blokerende opløsning ved anvendelse af en laboratorie-væv, og 100 pi af det primære antistof-opløsning. Inkubér primære antistof på BE cellerne natten over ved 4 ° C.
- Sekundært antistof Inkubation
- Vask slides 3x med PBS/0.5% BSA/0.1% saponin i 5 min hver ved RT.
- Fortyndet sekundært antistof konjugeret med et fluorescerende mærke i PBS/0.5% BSA/0.1% saponin, at den sekundære antistof anerkender de arter, hvor det primære antistof blev rejst.
- Tilsæt 100 ul fortyndet antistof til hvert dækglas. Inkubér det sekundære antistof i 2 timer ved stuetemperatur.
- Vask og Montering af Dækglas
- Vask dækglas 3x, 5 min hver i PBS/0.5% BSA/0.1% saponin. Fjern vaskepuffer, og der tilsættes 100-300 pi PBS til dækglassene.
BEMÆRK: For dobbelt antikrop farvning gentage trin 4,4-4,5 med den ønskede ekstra primære og sekundære antistof ifølge oplysninger skitseret i diskussionen. - Brug pincet, forsigtigt løfte dækglasset og duppes fra PBS ved hjælp af et laboratorium væv eller køkkenrulle.
- Tilføj 15 ul af en passende anti-fade montering medier, der indeholder 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til dækglasset og vend dækglasset, celler nedad, på et objektglas.
- Objektglassene anbringes i et dias mappe og inkuberes væk fra direkte lys natten over ved stuetemperatur for at tillade det hårde sæt anti-fade medium til at helbrede, i henhold til producentens anvisninger. Når anti-fade er stivnet, kan objektglassene opbevares enten ved 4 ° C eller -20 ° C indtil mikroskopisk visualisering.
- Vask dækglas 3x, 5 min hver i PBS/0.5% BSA/0.1% saponin. Fjern vaskepuffer, og der tilsættes 100-300 pi PBS til dækglassene.
5.. Mikroskopisk Visualisering af Dækglas
Farvede celler kan afbildes enten via konfokal mikroskopi eller en IF stand opretstående microscope. Selv konfokal mikroskopi giver billeder i høj opløsning ved diskrete dybder, en opretstående mikroskopisk er i stand til at producere brugbare billeder hurtigere. For kortheds skyld farves en fremgangsmåde til billeddannelse celler ved hjælp af standard mikroskopi præsenteres. I almindelighed billedet fluoresceinisothiocyanat (FITC) eller lignende fluoroforer (dvs. grønt fluorescerende protein), Texas Red og DAPI kræver et mikroskop med filtre er i stand til at skelne disse fluorophorer. Kontroller mikroskopet, før du begynder protokol til at bestemme kompatible fluorophores.
- Imaging på en standard, hvis Microscope
- Fjern lagrede diapositiver / dækglas fra -20 ° C eller 4 ° C, og tillade dem at opvarme til stuetemperatur. Tænd mikroskop og kviksølv bue lampe.
- Anbring objektglas med dækglas vender mod målet på objektbordet. Til brug af en olie immersionsobjektivet, tilsættes en dråbe fordybelse olie på dækglas.
- Vælg DAPI-filter og åbne lukkeren. Fokus målet, mens du kigger gennem okularerne, indtil billedet vises. Da alle celler vil pletten med DAPI bør kernerne være let observerbare.
- Saml billeder med respektive billedbehandling software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på de opnåede resultater fra anvendelsen af de beskrevne procedurer er illustreret i figurerne 1A-D. Dækglas med CP-D og CP-C BE celler blev behandlet i 24 timer med 1 uM af Src familien hæmmer, SKI-606, eller vehikel (DMSO) og farves med ovennævnte procedurer for Adherens Junction og Wnt signalering protein, β -catenin. Visualisering af β-catenin blev opnået ved mærkning med et anti-kanin IgG koblet til en grøn fluorofor, mens mærkning af cellekernen blev opnået ved mærkning med DAPI (blå). Dækglas blev monteret på mikroskopobjektglas hjælp hårdt sat montering og celler blev afbildet ved hjælp af laser scanning konfokal mikroskop bruger en 63X/1.4N plan-Apochromat mål. Den valgte grønne fluorophor blev anslået ved 488 nm og visualiseret ved hjælp af en emission filter ved 505-525 nm. Tilsvarende blev DAPI exciteret ved 405 nm og emission opsamlet under anvendelse af et filter på fra 410 til 460 nm. Aktivitet af tyrosinkinase Src is steg i BE, især i høj kvalitet dysplasi 12. I konkordans med observationer i tyktarms-og prostatacancerceller 13-15 inhibering af Src resulterer i relocalization af β-catenin fra cytoplasmaet / kerne (pile, figur 1A, 1C og 1E) til cellemembranen (pilespidser, figur 1B, 1D og 1F). Ved hjælp af disse teknikker har vi og andre tidligere vist, at inhibering af Src også ændrer ekspression og lokalisering af tumor suppressor p27 kip1 7,16 og disse metoder er i øjeblikket anvendes i vores laboratorium.
μ
Fig. 1. IF i immortaliserede være celler, efter behandling med en inhibitor af Src-kinase. CP-C (AD) og CP-D-(E, F), Blev behandlet med vehikel (DMSO, venstre paneler) eller 1 uM af SRC-hæmmer, SKI-606, i 24 timer (højre paneler). BE cellerne blev fikseret og farvet i overensstemmelse med den beskrevne protokol. β-catenin (grøn) blev visualiseret under anvendelse af et specifikt antistof og et sekundært antistof koblet til Alexa Fluro 488, mens kernen blev farvet med DAPI (blå). Bemærk ændringen i lokalisering for β-catenin fra kernen (pile) til cellemembranen (pilespidser) efter behandling med SKI-606. C, D) forstørrede billeder af hvide bokse i A og B, understreger yderligere ændringer i β- catenin lokalisering. Disse billeder repræsenterer ideelle farvning med minimal baggrund og tydelig farvning for det valgte mål. Barer, 7 m (A, B, D, F), 0,5 m (C, D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har skitseret en metode til anvendelse af IF af BE celler mod at belyse de fysiologiske effekter af målrettede behandlinger på disse celler. Mens vi har beskrevet brugen af disse procedurer i retning BE celler, har vi fundet, at disse metoder gælder også for en række forskellige celletyper 13,17,18. Endvidere kan disse procedurer ændres på flere måder for at optimere farvning for specifikke mål.
Vi finder en parameter, der har en direkte virkning på ordentlig IF er valget af fiksering. Vi har beskrevet brugen af 4% PFA / PBS for fiksering i ovennævnte procedurer, men alternative fiksativer er også relevant. Fiksering med kold methanol (-20 ° C) i 20 minutter efter vaskning med PBS er egnet til visse proteiner / antistoffer 13. Anvendelse af kold methanol til fiksering ophæver behovet for at permeabilisere cellerne. Men valget fikseringsmiddel (4% PFA / PBS eller kold methanol) skal bestemmes empirisk. De ovenfor beskrevne procedurer beskriver visualisering af et enkelt protein; men denne metode er let at tilpasse til identifikation af en supplerende mål 13. For optimal IF af to proteiner, primære antistoffer rejst i to forskellige arter (f.eks ene rejst i kanin og en i mus), og sekundære antistoffer, der specifikt genkender hver art, er koblet til forskellige fluoroforer, er nødvendige. Sekundære antistoffer koblet til grønne og røde fluoroforer kombineret med DAPI giver en fremragende kontrast mellem mål foruden generelt undgå interferens fra de multiple fluoroforer. For HVIS to mål i BE celler, udføre sekventiel inkubation af to primære og deres respektive sekundære antistoffer efter fiksering. Skridt til vask og montering af dias forbliver de samme.
Sammenfattende giver vi en enkel og brugbar protokol til IF af BE celler. Anvendelsen af disse procedurer kan give information vedrørende effekten af medicinsk behandling, indførelse af ektopiske gener af interesse, eller RNAi nedregulering af gener af interesse i BE celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra St Josephs Foundation (AJF, Lji) og American Lung Association, RG-224.607-N (Lji).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN antibiotic mixture | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18 mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10 cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
- Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
- Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data. Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).
- Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age. J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).
- Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins. J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).
- Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
- Vona-Davis, L., et al. MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro. Surg. Res. 127, 53-58 (2005).
- Inge, L. J., et al. a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia. Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).
- Jovov, B., et al. Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T). Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).
- Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition. BMC Cancer. 11, 461 (2011).
- Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks. Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).
- Palanca-Wessels, M. C. A., et al. Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model. Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).
- Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).
- Inge, L. J., et al. alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling. Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).
- Coluccia, A. M. L., et al. SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling. Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).
- Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis. Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).
- Chu, I., et al. p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2. Cell. 128, 281-294 (2007).
- Inge, L. J., et al. Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor. Exp. Res. 317, 838-848 (2011).
- Gan, Y., et al. Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells. Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).
