Summary
Vi è la necessità di migliorare discernibile informazioni sui driver molecolari dell'esofago di Barrett. Immunofluorescenza è una tecnica utile per comprendere gli effetti di segnalazione cellulare sulla morfologia cellulare. Presentiamo un protocollo semplice ed efficace per l'uso di immunofluorescenza per valutare il trattamento terapeutico nelle cellule esofago di Barrett.
Abstract
Adenocarcinoma esofageo (EAC) ha un tasso di sopravvivenza inferiore al 17% e l'incidenza di EAC è aumentato drammaticamente negli ultimi due decenni. Uno dei fattori di rischio primari di EAC è esofago di Barrett (BE), un cambiamento metaplastica del normale dell'esofago squamoso in risposta al bruciore di stomaco cronica. Nonostante il collegamento consolidata tra EAC e BE, interrogatori degli eventi molecolari, in particolare le vie di segnalazione alterate che coinvolgono la progressione della BE a EAC, sono poco conosciute. Molto di questo è dovuto alla mancanza di idonei modelli in vitro disponibili per studiare queste malattie. Recentemente, BE linee cellulari immortalizzate sono diventati disponibili in commercio che consente per gli studi in vitro di BE. Qui, presentiamo un metodo per immunofluorescenza di linee cellulari immortalizzate BE, permettendo alla caratterizzazione in vitro di segnalamento e struttura cellulare dopo esposizione a composti terapeutici. L'applicazione di queste tecniche sarà help sviluppare comprensione dei meccanismi coinvolti in BE per EAC progressione e fornire potenziali vie per il trattamento e la prevenzione di EAC.
Introduction
Esofago di Barrett (BE) è un cambiamento metaplastica nel normale epitelio squamoso dell'esofago e a seguito di esposizione cronica al contenuto gastrico derivanti da malattia da reflusso gastroesofageo (GERD) 1. BE è pensato per essere un meccanismo protettivo in risposta a GERD, tuttavia, la presenza di BE conferisce un aumentato rischio di adenocarcinoma esofageo (EAC), una malattia che comporta una significativa scarsa sopravvivenza 1. Le stime attuali indicano che fino al 5,6% della popolazione americana hanno essere, tuttavia, come BE è spesso asintomatica, si ritiene che la maggioranza dei BE rimane non diagnosticata 2. Poiché i tassi di incidenza sia di GERD e EAC hanno visto una crescita continua 3, è diventato importante per comprendere i meccanismi molecolari coinvolti nella progressione di BE a EAC, tanto più che queste informazioni potrebbero potenzialmente fornire approcci terapeutici verso la prevenzione della progressione di BE EAC.
1. L'infiammazione cronica, lesioni e danno genotossico derivante dall'esposizione prolungata a contenuto gastrico esercitare una pressione selettiva sulla lesione BE promozione progressione neoplastica di EAC. Un certo numero di alterazioni genetiche sono state identificate durante BE alla progressione EAC. Tuttavia, nonostante questo c'è una netta mancanza di comprensione circa le esatte variazioni di segnalazione cellulare e gli effetti conseguenti su struttura e funzione delle cellule.
Immortalata in linee cellulari in vitro sono strumenti utili per studiare gli effetti di segnalazione cellulare, in particolare nei studio degli effetti di composti terapeutici mirati. La recente disponibilità commerciale di linee cellulari immortalizzate BE consente per tali studi. Anche se le analisi high-throughput, come i test di vitalità ampiamente utilizzati, possono essere utili nel valutare gli effetti delle terapie mirate su proliferazione cellulare e survival 4-6, questi test non sono utili per interrogare gli effetti di segnalazione cellulare su morfologia cellulare. Immunofluorescenza (IF) è una tecnica utile per studiare gli effetti delle terapie mirate sulle caratteristiche morfologiche, la crescita e la sopravvivenza delle cellule e le proteine che sono coinvolte. Il nostro laboratorio ha adattato questi metodi verso linee cellulari immortalizzate BE, utilizzando IF per valutare gli effetti di un farmaco clinicamente disponibile su linee cellulari BE, nella speranza di delineare un possibile trattamento chemopreventative e biomarker per il trattamento farmacologico 7. Allo stesso modo, l'applicazione di queste tecniche in EAC, BE e linee cellulari esofagee immortalizzate ha delineato i risultati critici in merito BE di EAC progressione 8-10. Troviamo se l'analisi di cellule trattate con terapie mirate ha valore, consentendo per la caratterizzazione dei cambiamenti nella struttura cellulare e la localizzazione delle proteine. Qui vi presentiamo i nostri metodi di IF di essere cellule immortalizzate per characterize trattamento farmacologico.
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Protocol
1. Manutenzione Cell Line
- Umana immortalizzate BE displastiche di alto grado (CP-B, CP-C, CP-D) e metaplastica (CP-A) linee cellulari mediante trasfezione stabile della telomerasi umana trascrittasi inversa (TERT) proteina 11.
- Mantenere BE linee cellulari in mezzi di cheratinociti, completata con estratto di ipofisi bovina (BPE), fattore di crescita epidermico (EGF), siero bovino fetale 5% (FBS), aminoacidi non essenziali (NEAA), penicillina-streptomicina-neomicina (PSN), e norma condizioni di coltura tissutale (37 ° C, 5% di CO 2, il 98% di umidità).
2. BE cellulare placcatura
- Preparazione di 12-pozzetti / lamelle. Mettere 18 millimetri vetrini in una piastra di Petri di vetro e autoclave. Trasferimento autoclavato 18 millimetri vetrini coprioggetto in un piatto di coltura tissutale a 12 pozzetti utilizzando una pipetta sterile di vetro collegata ad un tubo a vuoto. Lavare il vetrino con PBS sterile e dei media.
- Trypsinize e contare le cellule essere immortalati. Contare le celle dell'USIng un contatore automatico di cellule o un emocitometro. Diluire le cellule in coltura ad una concentrazione di 20.000-40.000 cellule / ml.
- Mettere 1 ml di cellule in ciascun pozzetto contenente un vetrino per un conteggio di cellule totale di 20.000-40.000 cellule / pozzetto.
- Utilizzare un puntale sterile per spingere delicatamente il vetrino sul fondo del pozzo per assicurare che le cellule attribuiscono al vetrino.
Trattamento farmacologico delle cellule BE 3.
- Diluire farmaco selezionato in (37 ° C), i media caldi di concentrazione desiderata e mescolare bene invertendo il tubo più volte o utilizzando un vortex. Concentrazioni di farmaco determinato in modo empirico. Iniziare il trattamento 24 ore a seguito del seeding iniziale delle cellule essere quello di permettere alle cellule attaccamento al vetrino
- Per confronto e controllo, trattare un vetrino aggiuntivo di cellule sia con 0,1% di veicolo (dimetilsolfossido [DMSO] o l'agente usati per solubilizzare composto) diluito in coltura. Targhetta di identificazione con una penna laboratorio per identificare il farmaco e vehicle campioni trattati. Posizionare cellule in un incubatore di coltura cellulare impostato a 37 ° C, 5% CO 2, 98% di umidità e incubare per punti di tempo desiderati.
4. Immunofluorescenza
- Fissazione
- Seguendo tempo di incubazione desiderata del trattamento farmacologico, aspirare il supporto e lavare i coprioggetti rapidamente con 1x tampone fosfato salino (PBS) a temperatura ambiente (RT, 25 ° C).
- Aspirare il PBS e aggiungere 1 ml di PBS contenente 4% PFA [4% PFA / PBS] in ciascun pozzetto ed incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Aspirare il 4% PFA / PBS e lavare il coprioggetto 3x, 5 minuti ciascuno con PBS a temperatura ambiente. Il negozio di lamelle per una settimana in PBS/0.1% PFA a 4 ° C se lo si desidera.
- Permeabilizzazione / Blocco
Permeabilize cellule PFA fisse per consentire l'anticorpo per accedere ai bersagli intracellulari. Per extracellulare superficie proteine, eseguire tutti i passaggi successivi, senza saponina aggiunto alla soluzione BSA 1x PBS/0.5%.- Ridurre sfondo incubando con 50 mM NH 4 Cl diluito in PBS per 10 minuti a RT e lavare con PBS RT volta per 5 min.
- Incubare essere cellule per 30 minuti a 100-300 ml di PBS contenente 0,1% e saponina allo 0,5% albumina di siero bovino (BSA). Diluire saponina da filtro sterilizzato 10% stock, preparato in acqua e conservati a 4 ° C.
- Preparazione della Camera umano
- Preparare un piatto saggio biologico piazza stratificando il fondo della camera con asciugamani di carta bagnati e mettere uno strato di Parafilm sulla parte superiore.
- Delicatamente trasferire i coprioggetti, celle rivolte verso l'alto, sul Parafilm con pinze e un ago da siringa.
- Segnare il Parafilm con una penna di laboratorio per identificare i vetrini.
- Incubazione Anticorpo Primario
- Diluire l'anticorpo primario in PBS contenente BSA sia 0,5% e 0,1% saponina.
- Tamponare delicatamente la soluzione di saturazione usando un tessuto di laboratorio e aggiungere 100 ml di soluzione di anticorpo primario. Incubare l'anticorpo primario sulle cellule BE notte a 4 ° C.
- Incubazione secondario
- Lavare i vetrini 3x con PBS/0.5% BSA/0.1% saponina per 5 minuti ciascuno a RT.
- Diluire anticorpo secondario coniugato con un tag fluorescente in PBS/0.5% BSA/0.1% saponina che l'anticorpo secondario riconosce le specie in cui l'anticorpo primario è stato sollevato.
- Aggiungere 100 ml di anticorpo diluito ad ogni vetrino. Incubare l'anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente.
- Lavaggio e Montaggio di Coprivetrini
- Lavare il coprioggetti 3x, 5 min ciascuno in PBS/0.5% BSA/0.1% saponina. Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100-300 ml di PBS alle lamelle.
NOTA: Per il doppio controcolorazione del corpo, ripetere i passaggi 4,4-4,5 con l'anticorpo primario e secondario ulteriori desiderato in base alle informazioni descritte nella discussione. - Utilizzando pinze, delicatamente sollevare il vetrino e macchia al largo della PBS utilizzando un tessuto di laboratorio o un tovagliolo di carta.
- Aggiungere 15 ml di un supporto di montaggio anti-sbiadimento adatto contenente 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per il vetrino e invertire il vetrino, celle in basso, su un vetrino da microscopio in vetro.
- Porre i vetrini in una cartella di diapositive e incubare al riparo dalla luce diretta durante la notte a temperatura ambiente per permettere al mezzo anti-sbiadimento difficile impostare curare, secondo le istruzioni del produttore. Una volta che il mezzo anti-dissolvenza è impostato, i vetrini possono essere conservati a 4 ° C o -20 ° C o fino visualizzazione microscopica.
- Lavare il coprioggetti 3x, 5 min ciascuno in PBS/0.5% BSA/0.1% saponina. Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100-300 ml di PBS alle lamelle.
5. Visualizzazione microscopica di Coprivetrini
Cellule colorate possono essere esposte sia tramite microscopia confocale o un IF in grado microscop verticalee. Sebbene microscopia confocale offre immagini ad alta risoluzione a profondità discrete, un microscopico verticale è in grado di produrre immagini utili più veloce. Per brevità, un metodo di imaging macchiato BE cellule con un microscopio normale è presentato. In generale, all'immagine isotiocianato di fluoresceina (FITC) o fluorofori simili (cioè proteina fluorescente verde), Texas Red e DAPI, richiede un microscopio con filtri in grado di discriminare questi fluorofori. Controllare il microscopio prima di iniziare il protocollo per determinare fluorofori compatibili.
- Imaging su un IF microscopio standard
- Rimuovere memorizzati diapositive / vetrini da -20 ° C o 4 ° C e permettere loro di riscaldare a temperatura ambiente. Accendere il microscopio e lampada a vapori di mercurio.
- Posizionare vetrino da microscopio con coprioggetto rivolto verso l'obiettivo sul palco microscopio. Per l'utilizzo di un obiettivo immersione in olio, aggiungere una goccia di olio di immersione sul vetrino.
- Selezionare il filtro DAPI e aprire l'otturatore. Mettere a fuoco l'obiettivo, mentre guardando attraverso gli oculari fino a quando appare l'immagine. Poiché tutte le cellule si colorano con DAPI, i nuclei devono essere facilmente osservabile.
- Raccogliere le immagini utilizzando rispettivo software di elaborazione delle immagini.
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Representative Results
Un esempio dei risultati ottenuti dall'applicazione delle procedure descritte è illustrato nelle figure 1A-D. Coprioggetto con CP-D e BE cellule CP-C sono stati trattati per 24 ore con 1 mM dell'inibitore Src famiglia, SKI-606, o di un veicolo (DMSO) e colorati con le modalità di cui sopra per il adherens Junction e Wnt segnalazione proteine, β -catenina. Visualizzazione di β-catenina è stata ottenuta mediante l'etichettatura con IgG anti-coniglio accoppiato ad un fluorocromo verde, mentre l'etichettatura del nucleo cellulare è stato realizzato mediante l'etichettatura con DAPI (blu). Coprioggetto sono stati montati vetrini da microscopio utilizzando duro set di montaggio e le cellule sono state ripreso con scansione laser microscopio confocale utilizzando un obiettivo 63X/1.4N piano-apocromatico. Il fluorocromo verde prescelto era eccitato a 488 nm e visualizzati utilizzando un filtro di emissione a 505-525 nm. Allo stesso modo, DAPI era eccitato a 405 nm ed emissione raccolti utilizzando un filtro a 410-460 nm. Attività della tirosina chinasi, Src is aumentati in BE, particolarmente in alto grado displasia 12. In accordo con le osservazioni in colorettali e prostata cellule tumorali 13-15, inibizione di Src provoca rilocalizzazione della β-catenina dal citoplasma / nucleo (frecce, Figure 1A, 1C e 1E) alla membrana cellulare (frecce, figure 1B, 1D e 1F). Utilizzando queste tecniche, noi e altri hanno precedentemente dimostrato che l'inibizione di Src altera anche l'espressione e la localizzazione del soppressore del tumore, p27 kip1 7,16 e questi metodi sono attualmente utilizzati nel nostro laboratorio.
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Figura 1. IF di essere cellule immortalizzate dopo il trattamento con un inibitore di Src chinasi. CP-C (AD) e CP-D (E, F) Sono stati trattati con il veicolo (DMSO, pannelli di sinistra) o 1 micron dell'inibitore Src, SKI-606, per 24 ore (pannelli di destra). BE cellule sono state fissate e colorate secondo il protocollo descritto. β-catenina (verde) viene visualizzata utilizzando un anticorpo specifico ed un anticorpo secondario accoppiato a Alexa Fluro 488, mentre il nucleo è stato colorato con DAPI (blu). Notare il cambio di localizzazione per β-catenina dal nucleo (frecce) alla membrana cellulare (frecce) dopo il trattamento con SCI-606. C, D) le immagini ingrandite delle caselle bianche in A e B, evidenziare ulteriormente le variazioni di β- localizzazione catenina. Queste immagini rappresentano la colorazione ideale con sfondo minimale e la colorazione distinta per la destinazione prescelta. Bar, 7 micron (A, B, D, F), 0,5 micron (C, D).
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Discussion
Abbiamo delineato un metodo per l'applicazione di IF di cellule essere verso chiarire gli effetti fisiologici di terapie mirate su queste cellule. Mentre abbiamo descritto l'uso di queste procedure verso cellule BE, abbiamo trovato che questi metodi sono applicabili ad una varietà di tipi cellulari 13,17,18 anche. Inoltre, queste procedure possono essere modificati in vari modi per ottimizzare la colorazione per target specifici.
Troviamo un parametro che ha un effetto diretto sulla corretta SE è la scelta della fissazione. Abbiamo descritto l'uso del 4% PFA / PBS per la fissazione delle procedure di cui sopra, ma fissativi alternativi sono applicabili anche. Fissazione con metanolo freddo (-20 ° C) per 20 min dopo lavaggio con PBS è adatto per alcune proteine / anticorpi 13. L'uso di metanolo freddo per fissaggio nega la necessità di permeabilize cellule. Tuttavia, la scelta di fissativo (4% PFA / PBS o metanolo freddo) deve essere determinata empiricamente. Le modalità sopra riportate descrivono visualizzazione di una singola proteina; tuttavia questo metodo è facilmente adattabile a identificazione di un ulteriore obiettivo 13. Per ottimale IF di due proteine, anticorpi primari raccolti in due specie differenti (ad esempio, uno cresciuto in coniglio e uno in mouse), e anticorpi secondari che riconoscono specificamente ciascuna specie, insieme a diversi fluorofori, sono necessari. Anticorpi secondari accoppiati a fluorofori verde e rosso, combinate con DAPI forniscono un eccellente contrasto tra obiettivi, oltre ad evitare interferenze generalmente dai molteplici fluorofori. Per IF di due obiettivi in cellule BE, eseguire l'incubazione sequenziale di due anticorpi primarie e secondarie loro rispettivi seguente fissazione. Procedura per il lavaggio e il montaggio di diapositive rimangono gli stessi.
In sintesi, forniamo un protocollo semplice ed utile per IF di cellule BE. L'applicazione di queste procedure può produrre information per quanto riguarda gli effetti del trattamento farmacologico, l'introduzione di geni ectopiche di interesse, o RNAi sottoregolazione di geni di interesse in cellule BE.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal St, Fondazione Joseph (AJF, Lji) e American Lung Association, RG-224607-N (Lji).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN antibiotic mixture | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18 mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10 cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
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