Abstract
텔로 머라 제, 리보은 텔로미어의 길이를 유지하고, 따라서 게놈 무결성, 증식 및 수명을 증진 할 책임이있다. 이러한 뉴런 비 분열, 활성이 높은 세포 생존을 위해 그 중요성이 가능한 제안 또한, 텔로 머라 제는 산화 적 스트레스로부터 미토콘드리아를 보호하고 아폽토시스에 대한 저항성을 부여한다. 우리는 이전에 다양한 마우스 뇌 영역에서 텔로 머라 제 활성 및 발현을 증가하고 산화 적 스트레스로부터 운동 신경 세포를 보호하기 위해 신규 한 텔로 머라 활성제의 능력을 보여 주었다. 이러한 결과는 텔로 머라 다양한 병변에서 뉴런의 보호에 관여한다는 개념을 강화한다. 뇌의 텔로 머라 아제의 역할을 강조하기 위해, 우리는 여기에 남성과 여성의 마우스 뇌의 텔로 머라 아제의 활동과 연령에 대한 의존도를 비교합니다. TRAP 분석은 다양한 조직이나 세포주에서 텔로 머라 제 활성을 검출하기위한 표준 방법이다. 여기에서 우리는 analy을 보여CHAPS를 이용한 단백질 추출을 비 변성에 의한 마우스 뇌의 세 지역에서 텔로 머라 제 활성의 SIS는 표준 TRAP 분석의 변형에 의해 버퍼 용해 하였다.
이 2 단계 분석에서 내인성 텔로 머라 제는 TTAGGG 6 BP 반복보기 (텔로 머라 제 반응)을 첨가하여 텔로 머라 제의 특정 기판 (TS 프라이머)로 뻗어. 텔로 머라 제 반응 생성물 (6) 혈압 증가의 DNA 래더를 생성 PCR 반응에 의해 증폭된다. DNA 래더의 분석은 매우 민감한 핵산 염색 얼룩 이어 4.5 % 고해상도 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 이루어진다.
32 P가 DNA 검출 및 DNA 래더를 해결하기위한 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 위해 방사성 dCTP의 레이블 이용하는 전통적인 TRAP 분석법에 비해,이 프로토콜은 마우스의 뇌에서 텔로 머라 제 활성을 평가하는 능력을 입증위한 TRAP 분석법을 절약 무독성 시간을 구비 telomeras 차이를 검출다양한 여성과 남성 마우스의 뇌 영역에서의 전자 활동.
Introduction
텔로 머라 제는 텔로 머라 이루어지는 리보 역전사 효소 (TERT)의 텔로 머라 제 촉매 서브 유닛, 및 RNA 성분 (TERC)이다. 텔로 머라 제의 표준 역할은 따라서 게놈 무결성 및 세포 증식 일을 촉진, 텔로미어 끝까지 반복 서열 (TTAGGG)을 추가하여 텔로미어의 적절한 길이를 유지하는 것입니다. 그것은 다양한 손상 에이전트 (2)에 의해 유도 된 세포 사멸에 대한 저항성을 부여하는, 즉 추가의 역할은 셀에 TERT에 기인하고, 산화 적 스트레스 (3)로부터 인간 중간 엽 줄기 세포를 보호하고, 긍정적 인 RNA를 TIA1 위해 그 연관에 의해 완전히 분화 된 신경 세포 친 생존 역할 과립 4.
효소 발현과 활동 수준이 단단히 비 분할 세포 5,6 규제하는 동안 TERT는 표현 주로 체세포 분열 세포와 암의 대부분의 유형에서 활동한다. 연구는 연구에 그것을 보여 주었다TERT의 mRNA가 성인 7로 낮은 수준에서 유지하면서 odent 뇌는 텔로 머라 제 활성은 출생 후의 일 10에 의해 감지된다. 다른 연구는 성인 하위 심실 영역, 후각 망울, 해마 내에서 텔로 머라 제 활성을 입증하고, 성인 소뇌 피질 8. , 주입 된 생쥐 SOD1 유전자 변형의 근 위축성 측삭 경화증 질환의 발병 및 진행을 지연 - 우리는 최근 뇌 및 척수에서 텔로 머라 제 발현 및 활성을 증가 신규 화합물은 N-메틸-D-아스파 테이트 (NMDA)의 신경 보호 효과를 발휘한다는 증명 마우스와이 마우스 (9)의 척수 운동 신경 세포의 생존을 증가했다. 완전히 뉴런에서 뇌에서 텔로 머라 제의 친 생존 역할을 이해하기 위해서는 뇌의 여러 지역에서 텔로 머라 제 활성의 검출을위한 간단하고 비교적 빠르고 민감한 분석법을 개발하는 것이 필수적이다.
텔로미어 연구EPEAT 증폭 프로토콜 (TRAP)의 텔로 머라 제 활성의 표준 및 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 조합 한 공지 민감한 분석이다. 이 분석에서, 텔로 머라 제는 TTAGGG는 텔로 머라 제 기질에 TS 역방향 프라이머를 사용하여 6 염기쌍 (BP) DNA 래더 생성 PCR 증폭 하였다 (TS 프라이머), 올리고 뉴클레오티드, 반복 추가 -. ACX 32 P가 표지 된 dCTP의은을 검출하는데 사용된다 PCR 제품의 낮은 양. DNA 시퀀싱은 사다리 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해 해결된다. 두 DNA 밴드의 강도와 DNA 사다리의 길이는 활성 효소 분자의 양 및 그들의 processivity 각각 10을 반영한다.
이것은 전통적인 분석 몇가지 큰 어려움을 가지고 : (밤새 두 경우) 시퀀싱 PAGE 겔 주행의 시간 소비 및 방사성 생성물 막을 노광 처리 할 크고 단단한 방사성 물질에 노출 될 위험. 이 프로토콜은 개선 된 비 방사성 아가 미니 젤 기반의 분석을 제공합니다. DNA 래더 6 BP 4.5 % 고해상도 아가 로스 겔을 이용하여 해결하고 검출은 매우 민감한 핵산 염색을 이용하여 달성된다. 아가 고해상도 미니 겔 민감한 핵산 얼룩을 이용하는 조합은 분석의 취급이 용이 구비 방사능 노출의 위험을 제거하고 크게 몇 시간 삼일부터 전체 검정 시간을 단축.
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Protocol
동물 실험은 벤 구리온 대학 (IL-39-08-2010) 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.
1 마우스 뇌 단백질 추출
- 각 얼음에 5 ㎖의 링거액과 장소 튜브를 포함하는 15 ㎖를 3 튜브를 준비합니다.
- (주의 - 화학 후드를 사용) 아이소 플루 란 마취를 사용하여 마우스를 희생 자궁 전위 즉시 참수 한 다음 10 ~ 20 초.
- 두개골로부터 뇌를 제거하고 뇌 조직의 손상을 방지 빙냉 링거액으로 몇 초간 린스.
- 수술 블레이드를 사용하여, 전두엽 피질에서 소뇌 (CR) 및 뇌간 (BS)를 분리합니다. 다음으로, 뇌간에서 소뇌를 분리하고 정면 피질 전두엽 (FL)를 잘라; 전두엽에서 후각 망울을 제거합니다. 지정된 15 ml의 튜브에 3 뇌 영역을 배치합니다.
- 각 튜브에서 조직을 균질화. FR 추가환경 안전 보건 차가운 얼음 링어의 솔루션은 각각의 튜브는 X g 800에서 7 분 동안 같은 볼륨 원심 분리기가 포함되어 있습니다.
- 상층 액을 제거하고 각 튜브에 CHAPS 용해 버퍼의 100 μl를 추가합니다. 21 G 바늘을 1 ml의 시린지를 통해 용액을 여러 차례 (~ 10)를 통과시킴으로써, 잘 혼합하고, 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
- 13,000 × g으로 30 분 동안 새로운 마이크로 원심 분리 관 및 원심 분리 관에 각각의 내용을 전송. 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브에 상청을 전송하고 이전에 설정된 방법을 사용하여 단백질 농도를 결정한다. -80 ° C에서 10 μL의 분취 량의 단백질 추출물을 저장합니다.
인스트루먼트, 반응 솔루션 및 단백질 희석 계산의 2 TRAP 분석 준비
- 단백질 추출물의 희석 및 텔로 머라 반응 버퍼 표시된 마이크로 원심 분리기 튜브의 적절한 수를 준비합니다. 오염을 방지하기 위해 필터 정보를 사용하여 프로토콜의 모든 피펫 팅을 수행한다. TRAP 반응 믹스 10 배, TS 프라이머의 dNTP의, UPW 단백질 추출물 (시약 및 시약의 농도에 대한 자료의 표 참조) : 얼음에 다음과 같은 솔루션을 해동.
- 초순수 (UPW)를 이용하여 1 μg / μL의 최종 농도의 단백질 추출물 용액을 희석.
3 텔로 머라 제의 반응
- 마이크로 원심 분리기 튜브에 다음을 추가하여 텔로 머라 아제 반응 믹스를 준비 : 2 μL 트랩 믹스 (10 배), 1 ㎕의 TS 프라이머 (0.1 μg), 1 μL의 dNTPs를 (10 mM)을 15 μL의 UPW를. 다수의 샘플의 경우, 샘플 1을 더한 수에 의해, 상기 볼륨을 곱한다.
- 각 반응 관에 반응 믹스 19 μl를 추가하고 20 μL의 최종 볼륨에 대한 각 튜브에 희석 된 단백질 추출물 (1 μg 단백질)의 1 μl를 추가합니다.
- 45 분 동안 30 ° C 예열 수조에서 반응 튜브를 놓습니다.
(4) PCR 반응
- 다섯 마일ACX 프라이머, 티타늄의 Taq 버퍼, UPW : n은 텔로 머라 아제의 반응이 끝나기 전에, 다음과 같은 솔루션을 해동.
- 2.5 ㎕의 티타늄의 Taq 완충액 (10 배), 1 μL의 ACX 프라이머 (0.1 μg), 2 μL (IC가 사용되는 1 μL) UPW 0.5 μL 티타늄의 Taq 중합 효소 : 마이크로 원심 분리 튜브에 다음을 첨가하여 PCR 반응 혼합물을 준비 (50 배). 다수의 샘플의 경우, 샘플이 플러스의 수에 의해, 상기 볼륨을 곱한다.
- PCR의 6 μl를 각 PCR 튜브에 혼합하고 26 μL의 최종 볼륨에 대한 각 튜브에 텔로 머라 아제 반응 (20 μL)의 전체 볼륨을 추가합니다.
- PCR의 열 자전거 타는 사람에 PCR 튜브를 삽입하고 다음 프로그램을 실행합니다 :
- 90 ° C - 2 분.
- 94 ° C -. 30 초 *
- 60 ° C -. 30 초 *
- 72 ° C -. 45 초 *
- 72 ° C - 2 분.
-20 ° C에서 보관 PCR 제품.
* = 34주기
5 아가로 오스 미니 GE의리터 준비, 샘플을 실행하고, 젤 염색
- 25 ㎖의 냉각 된 전기 영동 완충액 (TBE) 및 완충액의 2-4 배 부피 천천히 고해상도 (HR) 아가로 오스 분말 1.125 g의 용액을 급속하게 교반하면서 뿌리고 비이커에 교반 막대를 추가 . 교반 막대를 제거, 환기를위한 작은 구멍에 플라스틱 포장과 피어스와 비커 커버. 다음 3 분 동안 "낮은"전원을 전자 레인지에서 비커를 가열을 "높음"으로 전원 스위치 및 유출의 원인이 될 수 있습니다주의 짧은 펄스에서 솔루션을 가열한다. 가열에 의해 생성 된 거품이 몇 초 후에 큰 기포가되어 사라지면, 아가로 오스가 준비되어 있습니다.
- 젤은 실온에서 응고 후 겔을 사용하기 전에 4 ° C에서 20 분 동안 진정 할 수 있도록 수평 미니 젤 장치에 젤을 캐스팅.
- 25 TRAP 샘플 ㎕의 (20 μL 트랩 PCR 제품과 5 ㎕의 6 배 겔 로딩 염료)와 각 레인을 넣고 11에서 실행4 ° C 차가운 방에서 3 시간 동안 0 V.
- 15 ㎕의 10,000 배 핵산 얼룩, 0.1 M 염화나트륨 (0.29 g)을 50 ㎖의 증류수 (DDW)에 원액을 추가하여 솔루션을 작업 핵산 얼룩 배를 준비합니다. 부드럽게 진탕하면서 20 분 동안 겔을 염색.
- TRAP 사다리 DNA 밴드를 볼 수 302 nm 파장과 자외선 트랜스 일루미네이터를 사용합니다.
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Representative Results
전체 세포 단백질 추출물은 1과 3 개월의 나이에 3 CD-한 여성과 3 CD-한 수컷 마우스에서 파생 된, 전두엽 (FL), 뇌간 (BS)과 소뇌 (CR)에서 제조 하였다 수정 TRAP 분석 및 방사성 TRAP 분석에 대한 이전 2개월 세의 나이에 3 CD-한 수컷 마우스. 텔로 머라 제 활성은 변형 된 TRAP 분석을 이용하여 1 μg의 단백질들을 추출 검출 및 2 μg 단백질은 방사성 TRAP 분석을 위해 추출 하였다. 방사성 TRAP 분석에 의해 수정 된 TRAP 분석에 의하여 텔로 머라 제 활성의 검출 1C 대 DNA 래더 (도 1a의 길이와 강도로 본 텔로 머라 DNA 제품의 더 나은 시각화 및 해상도가 변경됨 분석으로 관찰되는 것을 알 와 1D). 텔로 머라 DNA 제품의 점진적 감소는 아교 모세포종 U-251 세포주 유래의 단백질 추출물의 농도가 감소 할 때, 관찰 sugge 사용했다단백질의 낮은 농도에서 텔로 머라 제 활성의 검출을위한 변형 된 TRAP 분석 방법의 민감도를 추출 따끔 (도 1b).
DNA 밴드 강도와 DNA 제품 사다리의 길이에 의해 계시 상당히 높은 텔로 머라 제 활성은 3 개월 이전 여성 및 남성의 CR에 비해 FL 및 BS 영역에서 볼 수있다. 또한, FL에서 성인기 텔로 머라 제 활성 증가로 마우스 전환하는 동안 그 도시 및 BS 및 CR (도 1D)으로 감소한다. 남녀 사이의 비교는 FL의 텔로 머라 제 활성이 남성에서 더 높은 텔로 머라 제 활성을 나타내는 BS에 대비 CR의 여성에서 더 높은 것을 보여줍니다.
IC를 이용하는 T가 보낸 텔로 머라 제 활성의 낮은 수준을 발현하는 조직에서는, PCR을 이용하여 DNA 사다리 검출 내부 제어 (IC) 프라이머를 사용하지 않고보다 효율적임을 발견S는 앞으로 프라이머로하여 DNA 사다리 증폭을 방해. 데이터의 재현성 각 실험을 여러 번 반복함으로써 달성된다.
마우스 뇌 그림 1 텔로 머라 제 활성 : 수정 TRAP 분석 대 전통. 방사성 TRAP 분석법 (2 개월 CD-1 수컷 생쥐는 2 μg 단백질 추출). B) 단백질의 농도를 감소시킴으로써 도시되어 변성 TRAP 분석법의 민감도 분석 3 뇌 영역에서 A) 텔로 머라 제 활성은 아교 모세포종 U로부터 유도들을 추출 -251 세포 라인입니다. C, D) 1 (C) 및 3 (D) 개월 CD-1 여성과 남성 쥐의 3 뇌 영역에서 텔로 머라 제 활성은. DNA 사다리는 6 BP 단위로 50 bp의 밴드에서 시작한다. (NC - 음성 대조군 IC- 내부 통제, BS - 뇌간, CR - 소뇌, FL - 전두엽).
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Discussion
PCR 4에서 텔로 머라 제 반응 3) 텔로 머라 제 반응 생성물의 증폭 - 뇌 조직 2)의 특정 영역에서 1) 단백질 추출 텔로 머라 아제에 의해 프라이머 신장 TS : TRAP 분석법을 통해 마우스 뇌에서 텔로 머라 제 활성의 분석은 4 주요 단계로 구성 고해상도 아가 로즈 겔을 사용하는 PCR 제품) 분리.
DNA 사다리의 PCR 제품 및 PAGE 분리의 민감한 검출을위한 방사성 dCTP 년대의 사용이 수정 TRAP 분석은 기존의 분석에서 상승의 두 가지 주요 문제를 해결합니다. 고해상도 아가 로스 젤 시퀀싱 PAGE를 다루기 힘든 비교 텔로 머라 제 반응 생성물의 검출 (DNA 사다리)을 단순화한다. 또한, 핵산은 DNA 염색 소량의 검출에 필요한 감도가 높은 무독성 용액이다.
특별한주의는 다음과 같은 중요한 단계 고려되어야한다 : 1) 최소 조직 제거 및 균질화 사이의 시간을 유지하는) 단백질의 무결성이 보존하는 용균 완충액 재 냉동 3) 단백질 추출물 분량 씩 보관하고 사용하기 전에 일단 해동되어야 피해야 CHAPS. 샘플의 재 냉각하지 마십시오.
문제가 고농도의 아가로 오스 겔 보낸 겔 제조 공정 중에 발생하는 유출하는 경향이 조리시에 세심한주의를 필요로한다. 이 기술은 추운 방에 젤을 실행의 필요성과 함께 몇 가지 제한을 보유하고있다. 또한, PCR 생성물의 양이 낮은 UV 테이블에서 볼 수 없다.
텔로 머라 제 활성 레벨은 다른 조직간에 다양하며 뇌의 낮은 것으로 간주된다. 이 프로토콜은 더 민감한 검출 방법을 제공하는, 뇌에서 텔로 머라 제 활성의보다 나은 검출을 가능 전통적인 방사성 분석법으로 비교한다. 서로 다른 시간 효율적인 방법은 labele를 사용 가능합니다 (한 단계 TRAP 분석 키트는 있지만D TS 검출 용 프라이머)이 방법은 훨씬 더 비싸다. 더욱이, 아가로 오스의 사용은 폴리 아크릴 아미드 겔을 사용하는 독성의 위험을 제거한다.
대표적인 결과에서 공개 된 바와 같이, 전술 한 방법을 사용함으로써, 뇌의 다양한 영역들 사이의 남성 및 여성 사이 텔로 머라 제 활성 수준의 차이를 증명하는 것이 가능하다. 이 방법은 낮은 텔로 머라 제 활성을 갖는 다른 정상 조직에서 텔로 머라 제 활성의 검출을 위해 사용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
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