Summary
Wir präsentieren ein Verfahren zur Herstellung von Glimmer unterstützt Lipid-Doppelschichten für die hochauflösende Mikroskopie. Mica ist durchsichtig und flach auf atomarer Skala, aber nur selten in der Bildgebung aufgrund der Handhabungsschwierigkeiten verwendet werden; unserer Zubereitung ergibt sogar Abscheidung der Glimmerschicht und reduziert die Doppelschicht in Herstellung verwendeten Material ab.
Abstract
Unterstützt Lipiddoppelschichten (SLBs) sind weit verbreitet als Modell für die Untersuchung Membraneigenschaften (Phasentrennung, Clustering, Dynamik) und seine Wechselwirkung mit anderen Verbindungen, wie Drogen oder Peptide eingesetzt. Allerdings SLB Merkmale unterscheiden sich je nach verwendetem Unterstützung.
Häufig verwendete Techniken für die SLB-Bildgebung und Messungen sind Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie, FCS-und Rasterkraftmikroskopie (AFM). Da die meisten optischen Bildgebungsstudien werden auf einem Glasträger durchgeführt, während AFM erfordert eine extrem flache Oberfläche (in der Regel Glimmer), können die Ergebnisse von diesen Techniken nicht direkt verglichen werden, da die Ladung und Glätte Eigenschaften dieser Materialien stark beeinflussen Diffusion. Leider ist die hohe Fingerfertigkeit für das Schneiden und Kleben dünne Scheiben aus Glimmer an den Glasobjektträger erforderlich stellt eine Hürde für den routinemäßigen Einsatz von Glimmer für SLB Vorbereitung. Dies würde zwar die Methode der Wahl, wie Glimmer vorbereitet seinFlächen am Ende oft uneben (wellig) und schwer zu Bild, insbesondere mit kleinen Arbeitsabstand, hohe numerische Apertur Linsen. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und reproduzierbare Verfahren zur Herstellung von dünnen, flachen Glimmeroberflächen für die Lipid-Vesikel-Abscheidung und SLB Vorbereitung. Außerdem haben wir unsere maßgeschneiderten Kammer benötigt nur sehr kleine Volumina von Vesikeln für SLB-Bildung. Das Gesamtverfahren führt die effiziente, einfache und kostengünstige Herstellung von qualitativ hochwertigen Lipiddoppelflächen, die direkt vergleichbar mit denen in AFM-Untersuchungen verwendet werden.
Introduction
Das Gesamtziel des vorliegenden Protokolls ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Glimmeroberflächen für hochauflösende Bildgebung von Glimmer unterstützt Lipid-Doppelschichten (SLBs) mit optischen Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) oder die konfokale Mikroskopie, die auch mit Atomkraft kombiniert werden konnten zeigen, Mikroskopie (AFM).
SLBs sind ein weit verbreitetes Modell für zahlreiche Studien von Lipid-Clustering, Phasentrennung, Dynamik der Doppelschicht-Komponenten oder ihre Wechselwirkungen mit Peptide, Proteine oder andere Verbindungen 1-5. Unterschiedlichen Substraten kann zur Bildung SLB (z. B. Glas, Glimmer, Siliciumdioxid, Polymere), je nach der Art der Untersuchung 4,6-8 verwendet werden. Typische Membranstudien basieren auf Mikroskopie-basierte Bildgebungstechniken, wie TIRFM und AFM. So TIRFM Bildgebung, ist eine Glasoberfläche eine typische Wahl, denn Glas ist transparent. Herstellung von Glas ist relativ einfach, und die Qualität der Ergebnisse ist in erster Liniedurch gründliche Reinigung der Oberfläche vor dem Aufbringen der Lipidbläschen bestimmt. AFM aufgrund seiner hohen axialen Auflösung erfordert Glimmeroberflächen. Glimmer ist ein Silikat-Mineral, mit fast perfekten basalen Spaltung. So ist der frisch gespaltenen Glimmer atomar flach, so dass Beobachtung der Membran Höhenunterschiede auch bei den Sub-Nanometerskala 9.
Diffusion Studien mit Methoden wie Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), Einzelmolekül-Tracking (SMT) und Fluoreszenz-Erholung nach Photobleaching (FRAP) zeigten jedoch, dass die Lipidmembrandynamik hängen stark von der Art der Oberfläche, auf der sie abgeschieden werden, wobei Glas und Glimmer können sehr unterschiedliche Ergebnisse liefern 10,11. Diese Unterschiede sind nicht nur die Diffusionskoeffizienten der Membran-Sonden, aber auch die Erfassung von getrennten Populationen von Teilchen diffundieren mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und möglicherweise das Umschalten zwischen verschiedenen Staaten.
FolglichDer direkte Vergleich der Resultate mit TIRFM und AFM-Techniken erhalten wird, ist oft problematisch, wenn nicht die gleiche Oberfläche (in diesem Fall Glimmer) verwendet. Zwar gibt es einige Studien, in denen TIRFM und AFM-Doppelschicht Abbildungs wurde am gleichen Glimmeroberfläche 12,13 geführt, Glimmer wird selten für die optische Mikroskopie vor allem wegen der Handhabungsprobleme, verwendet. Mica Vorbereitung erfordert Schneiden von Hand in dünne Blättchen, die dann auf dem Deckglas mit optischen Kleber 12 verklebt sind. Diese Methode erfordert jedoch einige Übung, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus sind die erhaltenen Oberflächen oft wellig und dick, so dass sie schwer mit geringen Arbeitsabstand, hohe numerische Apertur Linsen zu verwenden.
Mica Oberflächen hergestellt werden, wie in diesem Protokoll beschrieben sind sehr dünn (~ 220 um, einschließlich des Deckglases Dicke von 170 um) und extrem flachen, Vermeidung von "Welligkeit", die entscheidend für eine erfolgreiche hochauflösende Bildgebung ist. Sie können verwendet werden,für TIRFM oder konfokalen Setups. Darüber hinaus können die gleichen Proben zu AFM übertragen werden, und sogar gleichzeitig mit TIRFM / konfokalen und AFM abgebildet. Die Kombination dieser beiden Techniken ermöglicht die direkte Korrelation der Diffusionsverhalten mit Doppelschicht-Membran-Struktur 14. Da Glimmeroberflächen werden frisch gespalten, sie sind sauber und benötigen keine zeitraubende, schlecht reproduzierbar, und potenziell gefährliche Reinigungsverfahren (Glasreinigung Protokolle sind in der Regel Chemikalien wie Piranha-Lösung, Schwefelsäure, Natrium / Kalium-Hydroxid). Montage einer kleinen Kammer, die auch in dem Protokoll beschrieben, verringert das Volumen der Vesikel für eine effektive Doppelschichtbildung auf weniger als 50 &mgr; l erforderlich. Schließlich ist der gesamte Prozess der Oberflächenmontage nicht zeitaufwendig (Zubereitung weniger als 30 min), und nicht einen hohen Grad an manueller Geschicklichkeit erfordern, ebenso wie herkömmliche Glimmer Spaltung und Kleben.
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Protocol
1. Mica und Slides Vorbereitung
- Platz Nr. 1 ½ (0,17 mm) Deckgläser in Färbung Rack.
- Beschallen für 30 min in 2% Detergens bei 60 ° C
- Mit VE-Wasser waschen 20-mal.
- Folien mit einer Pinzette entfernen und trocken blasen mit Druckluft oder Stickstoff.
- Schneiden Glimmer Blatt in 10 x 10 mm quadratische Stücke mit einer Schere oder Rasierklinge.
- Schneiden Sie die einzelnen Glimmer Stück in 2-3 dünner Blättchen mit Rasierklinge.
HINWEIS: Dieser Schritt erfordert die Verwendung von scharfen Klinge.
2. Mica Montage-und Befestigungskammer
- Saubere mikroskopischen Glasobjektträger mit Ethanol.
- Kleber Beilage Glimmer in Schritt 1,6 bis Glasobjektträger mit optischen Kleber geschnitten. Niedrige Viskosität Klebstoff wird empfohlen, besser zu verbreiten und den Tropfen kleben die Glimmer.
- Cure unter UV-Lampe, 10 min.
HINWEIS: Kleber wird durch UV-Licht mit einer maximalen Absorption im Bereich von 350 bis 380 nm und die empfohlene Energie requ geheiltired für die vollständige Heilung ist 4,5 J / cm 2. Jedoch können verschiedene Lichtquellen für diesen Schritt verwendet werden (siehe Materialien Klebstoffhersteller geliefert). - Expose eine saubere Glimmeroberfläche durch Entfernen der ersten paar Schichten mit Klebeband.
- Platzieren kleiner Tropfen (~ 20 &mgr; m) der optischen Klebstoff auf der Glimmeroberfläche.
HINWEIS: Bei diesem Schritt hohe Viskosität Klebstoff mit geringer Autofluoreszenz-Ebene wird empfohlen. Unsere Erfahrung hat gezeigt, dass mit Kombination von niedrigem (Schritt 2.2) und hochviskose Klebstoffe deutlich erhöht Wirksamkeit der Glimmer Spaltung (Schritt 2.7). - Sanft statt frisch gereinigten Deckglas auf den Tropfen Klebstoff Luftblasen vermeiden, lassen Sie begleichen für 1 min.
- Cure unter UV-Lampe, 10 min.
HINWEIS: Nach diesem Schritt kann das Sandwich aus Glas-Objektträger, Glimmer und Deckglas für eine relativ lange Zeitdauer (bis zu einige Wochen) gespeichert werden. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt kurz vor dem eigentlichen SLB Vorbereitung, um sicherzustellen, dass die Glimmeroberfläche frisch ist.
HINWEIS: Kleber wird durch UV-Licht mit einer maximalen Absorption im Bereich von 350 bis 380 nm und für die vollständige Heilung erforderlich empfohlen Energie ausgehärtet ist 4.5J/cm 2. Jedoch können verschiedene Lichtquellen für diesen Schritt verwendet werden (siehe Materialien Klebstoffhersteller geliefert). - Mit einem exacto Messer vorsichtig demontieren das Deckglas von der Seite Glasobjektträger, wie im Video gezeigt. In den meisten Fällen wird eine dünne und flache Schicht aus Glimmer, um das Deckglas befestigt bleiben. Mica angebracht, um Glasobjektträger kann wieder verwendet werden (ab Schritt 2.4).
- Überprüfen Sie die Oberflächenqualität mit bloßem Auge oder unter einem Binokular, um sicherzustellen, dass Glimmerschicht noch mit dem Deckglas geklebt und wurde beim Spalten in Schritt 2.8 nicht vollständig entfernt. Einen kleinen Kratzer mit einer Pinzette oder sezieren Nadel wird dazu beitragen, zwischen dem Klebstoff, der eine andere Konsistenz nachweisbar aus Glimmer unterscheiden.
- Entfernen Gummidichtung von einem 1,5-ml-Fläschchen Kappe und kleben Sie die Kappe auf den Kopf an der Oberfläche mit Hilfe der optischenKlebstoff oder Nagellack und heilen mit UV-Lampe, oder lassen Sie Luft trocknen 10 min auf.
HINWEIS: Wenn die Probe für die gleichzeitige optische (TIRFM oder konfokalen) mit AFM vorbereitet, könnte ein 1,5-ml-Fläschchen Kappe zu klein sein, um die AFM-Kopf auf den Mikroskoptisch montieren. In diesem Fall könnte die Kappe von einem Kunststoff-O-Ring mit einem größeren Durchmesser, geeignet für die Montage AFM Kopf ersetzt werden. Im Falle, wenn das Experiment erfordert Entfernen der Kappe, ohne die Glimmer-Oberfläche kann Silikonfett anstelle von Klebstoff oder Nagellack verwendet werden.
3. Unterstützt Lipiddoppelschicht (SLB) Bildung
- Zeigen frisch zubereitet Liposomenlösung in die Kammer mit der Oberfläche. Das Mindestvolumen für SLB Bildung erforderlich ist ~ 30 ul.
HINWEIS: Für weitere Informationen zu der Liposomen und SLB Bildung, veröffentlicht Protokolle, wie zB Tasche et al siehe 2014 15.. - Fahren Sie mit SLB-Bildung unter Verwendung gewünschte Protokoll. Während der Inkubation undBildgebung kann die Kammer in einem Wärmeblock erhitzt Mikroskoptisch oder auf Temperatur erforderlich, um die Lipide, die oberhalb ihrer Schmelztemperatur eingesetzt zu halten pflegen platziert werden.
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Representative Results
Das Diffusionsverhalten von Fluoreszenzsonden in Lipid SLBs ist je nach dem Substrat. TIRFM kombiniert mit der SMT-Technik ist eine wertvolle Methode zur Visualisierung von Partikelbewegungen und Extrahieren ihre Diffusionskoeffizienten. Einzelmolekülsignale einer Sphingomyelin-ATTO647N Sonde Diffundieren in DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin)-Doppelschicht auf Glas und Glimmer gelagert sind in der beigefügten Figur gezeigt animiert. Der Glimmer-Oberfläche wurde nach dem hier vorgestellten Protokoll hergestellt. Um optische Aberrationen abzuschätzen, wurde die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) gemessen und gemittelt über die 20-Punkte-Spread Funktion (PSF) mit Mosaik 2D PSF Größe ImageJ Plugin 16,17. Die gemessene Halbwertsbreite für Glas und Glimmer 441nm und 464nm waren jeweils (Abbildung 1). Die 22-nm-Unterschied in der Auflösung zwischen Bildgebung auf Glas und Glimmer ist nicht signifikant. In beiden Fällen kann die PSF Schwerpunkt jedes einzelnen fluoreszierenden Moleküls loca werdenin aufeinanderfolgenden Rahmen siert, und im Laufe der Zeit mit Mosaik-Teilchen-Tracker ImageJ Plugin 16,17 in Partikeltrajektorien verknüpft. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für Flugbahnen der Teilchen diffundieren über die auf beiden Oberflächen unterstützt Doppelschicht. Die mittlere quadratische Verschiebungen (MSE) der Fluoreszenzsonde in DOPC-Membran diffundieren auf Glas und Glimmer unterstützt wurde, auf der Abbildung 3 dargestellt. Aufgrund Koexistenz von mehreren Populationen zwei Populationsmodell wurde verwendet, um schnelle und langsame Diffusionskoeffizienten zu extrahieren, nach Methode beschrieben von Schütz (Abbildung 4, Abbildung 5) 18. Die Diffusionskoeffizienten und ihre Fraktionen wurden unter Verwendung von Software TrackArt 19 extrahiert und sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Die Ergebnisse aus diesem Beispiel beweisen die Existenz von zwei Staaten der Streusonde: schnell und langsam. Der Diffusionskoeffizient des schnellen Bevölkerung ist ungefähr 1Glimmer, 5-mal höher als die von Glas. Die langsame Komponente ist jedoch fast unbeweglich auf Glas (<0,01 &mgr; m 2 / s), im Vergleich zu einem D von nur ca. 1/10 des schnellen Bevölkerung auf Glimmer.
Abbildung 1. PSF Durchschnittliche Größe. Durchschnittliche PSF Intensitätsprofil für 20 Punkte gemessen auf Glas (schwarze durchgezogene Linie) und Glimmer (rote gestrichelte Linie). Die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) der normalisierten Intensität für Glas und Glimmer wurde auf 441 nm und 464 nm auf. Die 22-nm-Differenz zeigt an, dass es keinen signifikanten Rückgang der Bildauflösung zwischen diesen beiden Flächen. PSF Intensitätsprofil wurde mit Mosaic PSF 2D-Tool ImageJ Plugin 16,17 gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. Probenbahnen. Beispiels Trajektorien SM-ATTO647N Diffundieren in DOPC-Lipid-Doppelschicht auf Glas (A) und Glimmer (B) unterstützt. Auf den Trägerglasdoppelschicht wird die Sonde oft auf der Oberfläche immobilisiert, gelegentlich Umschalten der schnellen Diffundieren Zustand. Sonden Diffundieren auf dem Glimmer supported bilayer dagegen nur selten auf der Oberfläche immobilisiert. Stattdessen neigen sie dazu, zwischen schnellen und langsamen Streu Zustand. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Mittleren quadratischen Verschiebungen. Mittleren quadratischen Verschiebung gen der SM-Teilchen diffundieren ATTO647N auf ein Glas-(■) und Glimmer-(●) unterstützt DOPC-Doppelschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Kumulativen Wahrscheinlichkeitsverteilung passt. Kumulativen Wahrscheinlichkeitsverteilung (CPD) von quadratischen Verschiebungen und passt für die bi-exponentielle (zwei-Bevölkerung) Diffusionsmodell von SM-ATTO647N Teilchen diffundieren auf Glas-(A) und Glimmer (B) unterstützt DOPC-Doppelschichten. Ausschüttungen und Passungen sind nur für den fünften Zeitverzögerung (Δ t = 50 ms) präsentiert. Berechnungen und Diagramme werden mit 19 TrackArt Software erhalten.strähnig "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. MSD und Bruchstücke. MSD Grundstücke für die schnelle (r 1 2) und langsam (r 2 2) Diffundieren Bevölkerung und Anteil der Bevölkerung schnell (F 1) aus den CPD passt berechnet. Die Ergebnisse werden getrennt für SM-ATTO647N Teilchen diffundieren auf Glas-(A) vorgestellt und Glimmer-(B) unterstützt DOPC-Doppelschichten. Berechnungen und Grundstücke wurden mit 19 TrackArt Software erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Einwohner 1 (schnell) | Einwohner 2 (langsam) | |||||||
| D 1 (&mgr; m 2 / sec) | Anteil (%) | D 2 (&mgr; m 2 / sec) | Anteil (%) | |||||
| Glas | 1,840 ± 0,031 | 65,19 ± 0,56 | 0,006 ± 0,001 | 34,81 ± 0,56 | ||||
| Glimmer | 53,88 ± 0,26 | 0,176 ± 0,002 | 46,12 ± 0,26 | |||||
Tabelle 1. Diffusionskoeffizienten. Zusammenfassung der Diffusions Statistik. Diffusionskoeffizienten für langsame und schnelle Bevölkerungsgruppen und deren Fraktionen. Die Berechnungen wurden in TrackArt Software mit einem zwei Populationsmodell durchgeführt. Trajektorien erkannt und verbunden mit Mosaik-Teilchen-Tracker ImageJ Plugin.
Animierte Figur :. Einzelne Moleküle Diffusions Timelapse TIRFM Film von Sphingomyelin-ATTO647N Streu in einer DOPC-Doppelschicht auf Glas (links) und Glimmer (rechts) unterstützt. Maßstabsbalken ist 5 um.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung glatte und dünne Glimmeroberflächen für Lipid-Doppelschicht Abscheidung und hochauflösende Bildgebung. Die Technik erfordert nur minimale manuelle Fertigkeiten, vor allem auf die sorgfältige Demontage der Glasglimmer-Glas-Sandwich (Schritt 2.8), die entscheidend für die Erzielung einer hohen Qualität Glimmeroberfläche ist begrenzt. Inspektion der frisch gespaltenen Glimmer wird immer an diesem Punkt notwendig, da es möglich ist, die Glimmer, von der optischen Klebstoff ohne Spaltung zu trennen, wobei belichtete Bereiche der optischen Klebstoff. Das könnte zu einer unerwünschten Ablagerung von Klebstoff auf die Doppelschicht anstatt auf dem Glimmer führen. Mit der beschriebenen Methode ist, mit wenigen Ausnahmen parallel zur Deckfläche, die Beurteilung durch die gleichbleibend hohe optische Abbildungsqualität erhalten wir die Glimmeroberfläche hergestellt werden; wir haben daher keine Notwendigkeit für zusätzliche Überprüfung.
Der letzte Schritt bei der Montage der Kammer angepasst werden kann. Das Video-Tutorial zeigt einen1,5 ml-Glasfläschchen Kunststoffkappe als eine Kammer verwendet wird, dies kann jedoch nicht mit einem Gegenstand mit ähnlicher Form und gewünschten Abmessungen ersetzt werden, z. B. zur gleichzeitigen AFM-TIRFM/confocal Bildgebung, bei der die Probe mit der Halterung muss in der AFM-Kopf passt . Montage eines benutzerdefinierten Kammer kann übersprungen werden, wenn die Bildgebung ist es, mit einem Standard-, 35-mm-Metallzellkammer durchgeführt werden. In diesem Fall muss jedoch ein 25 mm Runddeckglas verwendet werden soll, und ein viel größeres Volumen der Liposomen-Lösung wäre für SLB Bildung benötigt werden.
Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die Einzelmolekül-Imaging-und Tracking kann leicht auf extrem flache Glimmeroberflächen dünn genug zugänglich TIRFM Bildgebung zu sein getan werden kann, nach dem Protokoll für die Oberflächenvorbereitung beschrieben. Das gleiche Präparat kann mit anderen Techniken, einschließlich hochauflösenden optischen Mikroskopie, wie Totalreflexions-Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (TIR-FCS) aufgebracht werden. Wichtig ist, SLBs prepared in der gleichen Weise (oder sogar genau die gleichen Proben) kann in beiden Versuchsaufbauten verwendet werden, ein wesentliches Kriterium für den direkten Vergleich der Ergebnisse mit unterschiedlichen Methoden, wie zB AFM, SMT, FCS, FRAP und erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
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