Summary
Мы представляем способ получения слюды поддерживается бислоев для микроскопия высокого разрешения. Слюда является прозрачным и помещения в атомном масштабе, но редко используется в визуализации из-за трудностей обработки; наша подготовка приводит к отложению даже слюды лист, а также снижает материал, используемый в процессе подготовки двухслойной.
Abstract
Поддерживаемые липидного бислоя (SLBS) широко используются в качестве модели для исследования мембранных свойств (разделение фаз, кластеризации, динамика) и его взаимодействия с другими веществами, такими как наркотики или пептидов. Однако SLB характеристики отличаются в зависимости от поддержки используется.
Обычно используемые методы SLB изображений и измерений одной молекулы флуоресцентной микроскопии, ФТС и атомно-силовой микроскопии (АСМ). Поскольку большинство оптических изображений исследования проводятся на стеклянной подложке, в то время как АСМ требует чрезвычайно плоскую поверхность (как правило, слюды), результаты этих методов не может сравниться непосредственно, так как заряд и гладкости свойства этих материалов сильно влияют диффузии. К сожалению, высокий уровень ловкости рук, необходимых для резки и склеивания тонкие ломтики слюды на стекло представляет собой препятствие для рутинного применения слюды для подготовки SLB. Хотя это было бы методом выбора, например подготовлены слюдыповерхности часто тратятся неравномерно (волнистые) и трудно изображения, особенно с малым рабочим расстоянием, высокие линз числовой апертурой. Здесь мы представляем простой и воспроизводимый способ получения тонких плоских слюды поверхности для липидов осаждения везикул и подготовки SLB. Кроме того, наша заказ камера требует только очень небольшие объемы пузырьков для формирования SLB. Общие процедура приводит к эффективной, простой и недорогой производства высококачественных липидный бислой поверхностей, которые сопоставимы с используемыми в АСМ исследований.
Introduction
Общая цель настоящего Протокола заключается, чтобы показать способ получения слюды поверхности для изображения с высоким разрешением слюдяных поддерживается липидного бислоя (SLBS) с использованием оптического общей флуоресценции внутреннего отражения микроскопии (TIRFM) или конфокальной микроскопии, который также может быть в сочетании с атомно-силовой микроскопии (AFM).
SLBS являются широко используется модель для многочисленных исследований липидного кластеризации, разделение фаз, динамики компонентов двухслойных или их взаимодействия с пептиды, белки или других соединений 1-5. Различные подложки могут быть использованы для формирования SLB (т.е. стекло, слюда, диоксид кремния, полимеры) в зависимости от характера исследования 4,6-8. Типичные исследования мембранных полагаться на методы визуализации микроскопии на основе, например, TIRFM и АСМ. Таким образом, для работы с изображениями TIRFM, поверхность стекла является типичным выбором, потому что стекло прозрачно. Подготовка стекла относительно легко, и качество результатов в первую очередьопределяется тщательной очистки поверхности перед осаждением липидных везикул. АСМ из-за своей резолюции высокой осевой требуется слюды поверхности. Мика является силикатный минерал, с близко к совершенной базальной декольте. Таким образом, свежесколотой слюда атомарно плоской, позволяя наблюдать перепада высот мембранных даже в суб-нанометровом масштабе 9.
Диффузионные исследования с использованием таких методов, как флуоресценции корреляционной спектроскопии (FCS), одной молекулы отслеживания (SMT), и восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) показал однако, что динамика липидной мембраны в значительной степени зависят от типа поверхности, на которую они оседают, в результате чего стекло и слюда может дать самые различные результаты 10,11. Эти различия относятся не только коэффициентов диффузии мембранных зондов, но и обнаружение отдельных популяций частиц, диффундирующих с разной скоростью, и, возможно переключение между различными государствами.
Таким образом,Прямое сравнение результатов, полученных с помощью TIRFM и АСМ методы зачастую проблематично, если же поверхность (в данном случае слюды) не используется. Хотя есть некоторые исследования, где TIRFM и АСМ двухслойная изображений проводилось на той же поверхности слюды 12,13, слюда редко используется для оптической микроскопии, в основном из-за проблем обработки. Подготовка Мика требуется резка вручную на тонкие листовок, которые затем приклеены к покровного стекла с использованием оптического клея 12. Этот метод, однако, требуется некоторая практика, чтобы достичь удовлетворительных результатов. Кроме того, поверхности, полученные часто волнистые и густые, что делает их трудно использовать с низким рабочим расстоянием, высокие линз числовой апертурой.
Слюды поверхности, полученные, как описано в данном протоколе очень тонкие (~ 220 мкм, включая толщину покровного 170 мкм) и очень плоским, избегая "волнистость", которая имеет решающее значение для успешного изображений с высоким разрешением. Они могут быть использованыдля TIRFM или конфокальной установок. Кроме того, те же образцы могут быть переданы в АСМ, и даже отображаемого одновременно с TIRFM / конфокальной и АСМ. Сочетание этих двух методов позволяет прямую зависимость диффузии поведения с двухслойной мембраной структуры 14. Потому слюды поверхности свежесколотой, они чистые и не требуют затрат времени, плохо воспроизводимы, и потенциально опасные процедуры очистки (очистки стекла протоколы обычно включают химикаты, такие как решения Piranha, серная кислота, натрия / гидроксид калия). Монтаж небольшую камеру, также описанного в протоколе, уменьшает объем пузырьков, необходимых для эффективного образования двухслойной до менее чем 50 мкл. Наконец, весь процесс поверхностного монтажа не отнимает много времени (подготовка занимает менее 30 мин), и не требует высокой степени мастерства ручной, так же как обычные расщепление слюды и склеивание.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Слюды и Слайды Подготовка
- Место № 1 ½ (0.17 мм) покровные в окрашивания стойке.
- Разрушать ультразвуком в течение 30 мин в 2% моющего средства при температуре 60 ° С.
- Промыть 20 раз деионизированной водой.
- Удалить слайды с помощью щипцов и сушить с помощью сжатого воздуха или азота.
- Вырезать слюды лист в 10 х 10 мм квадратных части, используя ножницы или лезвие.
- Разрежьте каждый слюды часть в 2-3 тонких листовок, используя лезвие бритвы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг требует использования острым лезвием.
2. Слюды Ассамблея и камерной Монтаж
- Чистый микроскопические предметное стекло с этанолом.
- Клей листовка слюды сократить в шаге от 1,6 до предметное стекло с помощью оптического клея. Клей с низкой вязкостью рекомендуется лучше распространять падение и приклейте слюды.
- Лечение под УФ-лампой, 10 мин.
Примечание: Клей отверждают УФ-светом с максимальной абсорбции в диапазоне от 350 до 380 нм и рекомендованной энергии RequIRED для полного излечения составляет 4,5 Дж / см 2. Однако различные источники света могут быть использованы для этого шага (см. материалы от поставщика клея). - Expose чистую поверхность слюды, удалив несколько первых слоев с скотча.
- Поместите небольшую каплю (~ 20 мкм) оптического клея на поверхности слюды.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, высокая клей вязкость с низким уровнем автофлуоресцентной рекомендуется. Наш опыт показал, что с помощью комбинации низких (шаг 2.2) и высоких клеев вязкости увеличивает значительно эффективность слюды расщепления (шаг 2.7). - Аккуратно поместите свежеочищенной покровное на каплю клея, избегая пузырьков воздуха, пусть осесть в течение 1 мин.
- Лечение под УФ-лампой, 10 мин.
Примечание: После этой стадии сэндвич из предметное стекло, слюды и покровным можно хранить в течение относительно длительного периода времени (до нескольких недель). Переходите к следующему шагу только до фактического подготовки SLB, чтобы убедиться, что поверхность слюды свежее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клей отверждают УФ-светом с максимальной абсорбции в диапазоне от 350 до 380 нм и рекомендованной энергии, необходимой для полного отверждения является 4.5J/cm 2. Однако различные источники света могут быть использованы для этого шага (см. материалы от поставщика клея). - Использование Exacto нож, аккуратно демонтировать покровное из стороны стекло, как показано на видео. В большинстве случаев, тонкий и плоский слой слюды будет оставаться присоединенным к покровное. Мика прикреплены к стеклу можно использовать повторно (повторите процедуру с шага 2.4).
- Проверьте качество поверхности невооруженным глазом или под микроскопом рассекает, чтобы убедиться, что слюда слой еще приклеены к покровным и не был полностью удален во время расщепления в шаге 2.8. Создание мелкие царапины с пинцетом или рассечения иглу поможет различать клея, который имеет детектируемо другой последовательности из слюды.
- Удалить резиновый уплотнитель от 1,5 мл флакона и приклейте крышку вверх дном на поверхность с помощью оптическогоклей или лак для ногтей, и вылечить с УФ-лампой, или пусть воздух сухой 10 мин, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если проба подготовлена для одновременного оптического (TIRFM или конфокальной) с АСМ, 1,5 мл флаконе крышка может быть слишком мал, чтобы смонтировать голову АСМ на столик микроскопа. В этом случае крышка может быть замещена любой пластиковой уплотнительным кольцом с большим диаметром, подходящим для АСМ головка монтажа. В случае, когда эксперимент требует удаления колпачка без повреждения поверхности слюды, силиконовые смазки могут быть использованы вместо клея или лака для ногтей.
3. Поддерживаемые липидов Bilayer (SLB) Формирование
- Наведите свежеприготовленный раствор липосом в камеру с поверхности. Минимальный объем необходим для формирования SLB составляет ~ 30 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более подробной информации о липосомы и формирования SLB см. опубликованных протоколов, таких как, например, сумка и др., 2014 15.. - Перейдите с образованием SLB используя нужный протокол. Во время инкубации иизображений, камера может быть размещена в тепловой блок или столике микроскопа с подогревом для поддержания температуры, необходимой для поддержания липиды быть использованы выше их температуры плавления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поведение диффузии флуоресцентных зондов в липидных SLBS отличается в зависимости от субстрата. TIRFM сочетании с техникой SMT является ценным методом для визуализации движения частиц и извлечения их коэффициентов диффузии. Одной молекулы сигналы в Сфингомиелин-ATTO647N зонда диффундирующего в DOPC (1,2-диолеоил-SN-глицеро-3-фосфохолин) двухслойной поддерживается на стекле и слюды показаны на прилагаемой анимационного рисунка. Поверхность слюда был подготовлен в соответствии с протоколом, представленной здесь. Для оценки оптических аберраций, полная ширина на половине максимума (FWHM) измеряли и усредненная по функции рассеяния 20 точки (PSF) с помощью Мозаика 2D PSF Размер ImageJ плагин 16,17. Измеренная ПШПВ для стекла и слюды были 441nm и 464nm соответственно (рис. 1). Разница 22 нм в резолюции между изображениями на стекле и слюды не имеет существенного значения. В обоих случаях PSF центроид каждого отдельного флуоресцентного молекулы могут быть LOCAвалась в последовательных кадров, а связаны в траекторий частиц с течением времени с Мозаика частиц Tracker ImageJ плагин 16,17. Рисунок 2 показывает образец траектории частиц, диффундирующих поперек мембраны, поддерживаемого на обеих поверхностях. В среднеквадратичные смещения (MSDS) из флуоресцентного зонда диффундирующего в DOPC мембраны, нанесенного на стекло и слюды наносили на график на рисунке 3. Из-за сосуществования нескольких популяций две модель население, используемых для извлечения быстрых и медленных коэффициентов диффузии, согласно методу, описанному по Schutz (рис. 4, Рисунок 5) 18. Коэффициенты диффузии и их фракции экстрагировали с помощью программного обеспечения TrackArt 19 и суммированы в таблице 1.
Результаты этого примера доказать существование двух отдельных государств диффундирующего зонда: быстрые и медленные. Коэффициент диффузии быстрой населения примерно 10,5 раза выше на слюду, чем на стекле. Медленная компонента однако, почти неподвижно на стекле (<0,01 мкм 2 / с), по сравнению с D лишь ~ 1/10 быстрого населения по слюды.
Рисунок 1. Средний размер PSF. Среднее профиль интенсивности PSF течение 20 пятен измеренных на стекле (черный сплошная линия) и слюды (красная пунктирная линия). Полная ширина на половине максимума (FWHM) нормированной интенсивности для стекла и слюды, по оценкам, 441 нм и 464 нм соответственно. Разница 22 нм указывает, что нет значительное падение разрешения изображения между этими двумя поверхностями. Профиль интенсивности PSF измеряли с помощью Мозаика PSF 2D инструмент ImageJ плагин 16,17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Пример траектории. Примеры траектории SM-ATTO647N диффундирующие в ДОФХ липидного бислоя, нанесенного на стекло (A) и слюды (B). На стеклянной поддерживается бислой, зонд часто иммобилизованный на поверхности, иногда переключение на быстро диффундирующего состоянии. Зонды диффундирующих на слюды поддерживается бислой, напротив, редко иммобилизованный на поверхности. Вместо этого они, как правило, для переключения между быстрым и медленным государства рассеивающей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Среднеквадратичные перемещений. Среднеквадратическое Displace ментов SM-ATTO647N частиц, диффундирующих на стакан-(■) и слюда-(●) поддерживается DOPC бислой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Накопительное распределение вероятностей подходит. Накопительное распределение вероятностей (CPD) квадратных перемещений и подходит для би-экспоненты (два-население) диффузионной модели SM-ATTO647N частиц, диффундирующих на стекле-(А) и слюда-(В) при поддержке DOPC бислои. Распределения и подходит представлены только в пятом запаздывания (Δ т = 50 мс). Расчеты и участки получены с использованием TrackArt 19 программного обеспечения.худощавый "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. MSD и фракция участки. MSD участки для быстрого (R 1 2) и медленной (R 2 2) диффундирующего населения и доля быстрого населения (F 1), рассчитанной по ДСП припадков. Результаты представлены отдельно для SM-ATTO647N частиц, диффундирующих на стекле-(А) и слюда-(B) поддерживается DOPC двойных слоев. Расчеты и участки были получены с использованием TrackArt 19 программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Население 1 (быстро) | Население 2 (медленно) | |||||||
| D 1 (мкм 2 / сек) | Фракция (%) | D 2 (мкм 2 / сек) | Фракция (%) | |||||
| Стекло | 1,840 ± 0,031 | 65.19 ± 0.56 | 0,006 ± 0,001 | 34.81 ± 0.56 | ||||
| Слюда | 53.88 ± 0,26 | 0,176 ± 0,002 | 46.12 ± 0,26 | |||||
Таблица 1. Коэффициенты диффузии. Резюме статистики диффузии. Коэффициенты диффузии для медленных и быстрых населения и их фракций. Расчеты проводились в программном обеспечении TrackArt использовании системы с двумя модель популяции. Траектории были признаны и связаны с использованием мозаики частиц Tracker ImageJ плагин.
Анимированные Рисунок :. Одиночные молекулы диффузии Timelapse TIRFM фильм сфингомиелин-ATTO647N диффундирующего в DOPC бислоя, нанесенного на стекло (слева) и слюды (справа). Шкала бар составляет 5 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает способ получения гладких и тонких поверхностей слюды для липидов осаждения двухслойной и высоким разрешением. Методика требует минимальных ручной труд, ограниченные в основном к тщательной разборки бутерброд стекло-слюда-стекло (шаг 2.8), которая имеет решающее значение для получения высокого качества поверхности слюды. Осмотр свежесколотую слюды всегда требуется в этот момент, поскольку это возможно для слюда, чтобы отсоединить от оптического клея без расщепления, в результате чего открытые участки оптического клея. Это может привести к нежелательной осаждения бислоя на клей, а не на слюды. Поверхность слюды получают, используя описанный метод с несколько исключений параллельно поверхности покровного, судя по равномерно высокого оптического качества изображения мы получили; поэтому мы не видим необходимости для дополнительной проверки.
Последним шагом в монтаже камеры могут быть настроены. Учебник Видео показывает1,5 мл стеклянный флакон пластиковый колпачок используется в качестве камеры, однако это может быть замещена любого объекта одинаковой формы и желаемых размеров, например, для одновременного AFM-TIRFM/confocal изображений, где образец с держателя имеет, чтобы вписаться в головке AFM . Монтаж пользовательского камеры может быть пропущен, если изображения должны быть выполнены с использованием стандартной 35 мм камеры металл клеток. Однако в этом случае, 25 мм вокруг покровного стекла должен быть использован, и гораздо больше объем раствора липосом будут необходимы для формирования SLB.
Представленные здесь результаты показывают, что изображения одной молекулы и отслеживания можно легко сделать на чрезвычайно плоскими поверхностями слюды достаточно тонким, чтобы поддаваться изображений TIRFM, в соответствии с протоколом для подготовки поверхности, описанной. То же препарат может быть применен к другим методам, в том числе с высоким разрешением оптической микроскопии, такие как полное внутреннее отражение флуоресценции корреляционной спектроскопии (TIR-FCS). Важно отметить, что SLBS препAred таким же образом (или даже точно такой же образцов) может быть использован в обоих экспериментальных установок, существенным критерием для прямого сопоставления результатов, полученных с использованием различных методов, например АСМ, SMT, FCS, и FRAP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы не имеют подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
- Giocondi, M. -C., et al.
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P.
- Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
- El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
- Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
- Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
- Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
- Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
- Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
- Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
- Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
- Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
- Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
- Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
- Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).
