Summary
Insektspecifikke nematoder i jorden bebo rundorme, snylter en lang række insekter. Vi viser prøvetagningsmetoder, der anvendes til isolering af disse nematoder fra jorden ved hjælp af to teknikker: insekt baiting og det ændrede Hvide fælde, for inddrivelse af nematoder fra jordprøver og inficerede insekt kadavere, hhv.
Abstract
Insektspecifikke nematoder (aka EPN) repræsenterer en gruppe af jord-bebo nematoder, der snylter en lang række insekter. Disse nematoder tilhører to familier: Steinernematidae og Heterorhabditidae. Indtil nu har mere end 70 arter blevet beskrevet i Steinernematidae og der er omkring 20 arter i Heterorhabditidae. De nematoder har en mutualistisk partnerskab med Enterobacteriaceae bakterier og sammen fungere som en potent insekticid kompleks, der dræber en lang række insektarter.
Heri har vi fokus på de mest almindelige teknikker, der vurderes til indsamling EPN fra jorden. Den anden del af denne præsentation fokuserer på insekt-baiting teknik, en udbredt metode til isolering af EPN fra jordprøver, og det ændrede Hvide fælde teknik, der anvendes til genopretning af disse nematoder fra inficerede insekter. Disse metoder og teknikker er vigtige skridt for en vellykket etablering af EPN kultninger i laboratoriet og danner også grundlag for andre bioassays som anser disse nematoder som modelorganismer til forskning i andre biologiske discipliner. De i denne præsentation teknikker svarer til dem, der udføres og / eller designet af medlemmer af SP Stock laboratorium såvel som dem, der er beskrevet af forskellige forfattere.
Introduction
Mange nematoder er forbundet med insekter, og deres vært interaktioner spænder fra gavnlig for skadelig. Heri har vi fokus på en gruppe af nematoder, der er patogener af insekter, også kendt som insektspecifikke nematoder (eller EPN). To nematode familier hører til denne gruppe af nematoder: Steinernematidae og Heterorhabditidae 11,13. Deres patogene virkning er i virkeligheden tillagt ved deres interaktion med fakultative anaerobe tarmbakterier (Xenorhabdus bakterier forbinder med steinernematids og Photorhabdus bakterier forbinder med heterorhabditids) 2. Bakterierne vectored fra et insekt vært til en anden ved den eneste fritlevende nematode fase, den tredje fase infektiøse juvenile (også kendt som dauer juvenile, smitsom yngel eller IJ), som bor i jorden. Inde i insektet, nematoder frigive bakterier i insektets hæmolymfe, som dræber insekt vært ved massiv blodforgiftning. Bakterierne ogsåforringe insekt væv og blive nematoder 'fødekilde, så de kan modnes og formere sig. Normalt er en eller to generationer af voksne nematoder produceret inden for insekt kadaver. Afkommet af de sidste voksen generation reassociates med enkelte bakterieceller i en mere specialisere måde end deres tidligere ernæringsmæssige forhold, og give næring til disse celler i deres tarme, når de bevæger sig ud fra insekt slagtekroppen i jorden, hvor de vil afvente en anden insekt at parasitize 6,11,14 (figur 1).
Siden deres opdagelse i 1927, har EPN været betragtet værdifulde alternativer til kemiske pesticider, som de kan snylter en bred vifte af insekter, der er landbrugsskadedyr 3,4,5. Men i de seneste to årtier, disse nematoder og deres symbiotiske bakterier er blevet anerkendt som et plastisk model system til at studere biologiske, økologiske og evolutionære aspekter af host-mikrobe interactions 14.
Målet med denne præsentation er at vise de metoder og teknikker mest brugt til jordprøvetagning og isolering af EPN. En række værktøjer er tilgængelige og kan bruges til indsamling af jordprøver herunder: jord corers, trowels, post-hullers gravemaskiner, snegle, prøveudtagning rør, hånd skovle, blandt andre (Figur 2).
Afhængigt af formålet med undersøgelsen, kan to prøveudtagningsstrategierne overvejes: a) stratificeret, b) stikprøvekontrol (figur 3). Den stratificeret udvælgelse er normalt bruges som en del af en intensiv undersøgelse i en specifik eller demarked området over en given periode. I almindelighed er en transekt demarked og jordprøver taget på fastlagte intervaller i transekten over en periode (figur 3A) 15. Den tilfældige stikprøver er generelt ansat, når der fokuseres på et stort område. Denne strategi er blevet anvendt stikprøver for at studere mangfoldigheden af EPN fra et stort geografisk område eller region (figur 3B) 12.. En række faktorer kan betragtes som afhængig af fokus for undersøgelsen, herunder en bred vifte af stigninger, jord teksturer og levesteder (f.eks., Dyrkede marker, skove, enge, parker, strande, vandløbsnære arealer, mv.)
Vi viser insekt-lokkemad teknik, som oprindeligt blev beskrevet af Sengetøj og Akhurst 1 og repræsenterer en enkel og selektiv alternativ til at inddrive EPN fra jordprøver. Det er en selektiv fremgangsmåde, der er baseret på den forudsætning, at de nematoder (IJ fase) vil blive tiltrukket til et insekt vært og parasitize det. Denne teknik kan også overvejes til isolering af andre insektpatogener, såsom svampe og bakterier 8,10.
Vi viser også den modificerede White fælde teknik, der anvendes til hentning afkom nematode fra inficerede insekt værter 7,14. Det er en ubesværet opfyldthod der har den fordel at hente en "ren" nematode afkom fri for snavs fra de nedbrydende insekt kadavere.
Endelig beskrevne teknikker og vist i denne artikel svarer til dem, udtænkt og / eller udført i vores laboratorium, såvel som dem, der er beskrevet af forskellige kolleger og samarbejdspartnere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Jordprøve Collection
- Overvej at dække et areal på mindst 2 - 4 m 2 for hver sampling site.
- Saml jordprøver i en dybde på mindst 15 cm (figur 4).
- Tag mindst 5 stikprøver inden for dette område.
- Tag 3 delprøver pr prøve. Afhængigt af formålet med undersøgelsen, enten kombinere delprøverne eller holde dem adskilt.
- Placer hver prøve i en plasticpose. Overvej dobbelt-sække for at undgå lækage af prøver (figur 4).
- Label prøver med en vandfast tusch. Medtag følgende oplysninger fra hver prøveudtagning site: Webstedet (herunder lokalitet / område / site navn og GPS koordinere information), dato, habitat, tilhørende vegetation, temperatur, højde mv
BEMÆRK: Hvis det er relevant, indsamle og / eller optage forekomsten af insekter eller andre hvirvelløse dyr, der er indsamlet med prøven til senere identifikation. De kan repræsentere potentielle natural EPN værter. - Clean indsamlings-værktøjer mellem prøver ved grundig vask med vand og / eller desinficere dem med 70% ethanol eller 0,5% blegemiddel løsning.
- Opbevar prøver i en køler (8 - 15 ° C) under transporten til laboratoriet.
- Tag en del af prøven jord til analyse for at få oplysninger om jordens sammensætning, konsistens, fugt, elektrisk ledningsevne eller andre ønskede jordparametre.
. 2. Nematode Isolering fra jordprøver: Insect-baiting Teknik
- Fjern eventuelle rester (dvs.., Sten, stykker af træ eller bark, blade osv.) Indsamles med dine prøver at undgå kontaminering med saprobic mikroorganismer.
- Tilsæt vand til at fugte jord og lette omsætningen af nematoder.
BEMÆRK: Brug en sprayflaske til langsomt øge fugtniveauet af jorden. - Anbring ca 200 til 250 ml fugtig jord i en ren plastikbeholder med låg.
- Tilføj insektlokkemidler. Overvej 5 til 10 insekter til jordoverfladen af hver prøve (figur 5).
- Dæk beholderen med et låg og vende beholderne på hovedet.
- Oprethold beholdere i mørke og ved stuetemperatur (normalt 22-25 ° C).
- Tjek containere hver 2 - 3 dage, og fjerne døde insekter.
BEMÆRK: tilføje ekstra sunde insekter til hver beholder for yderligere baiting af jordprøven. - Fjern døde insekter fra beholderne. BEMÆRK: Kadavere med en brun eller okker farve er normalt parasitized af steinernematids, mens mursten rød til mørk lilla kadavere er parasitized af heterorhabditids.
- Skyl kadaverne i sterilt vand.
- Placer kadavere i en modificeret Hvid fælde for inddrivelse af afkom nematoder (se procedure nedenfor).
. 3. Nematode Recovery fra inficerede Kadavere: Modificeret Hvid Trap
- Placer toppen af en 50 (eller 60) mm i diameter. Petriskål i en større skål (100 mm).
- Sæt en syndgle cirkulær (Whatman nr. 1) i mindre parabol.
- Placer kadavere på filteret papir af mindre parabol og sørg kadavere ikke røre hinanden for at undgå kontaminering.
- Fyld den ydre (større) petriskål med ca. 20 ml sterilt, destilleret vand. Tilsæt ikke vand i skålen, der holder kadaverne.
- Dæk stor petriskål og dens indhold med låget (figur 6).
- Mærk retter i overensstemmelse hermed. Tilføj følgende oplysninger: Nematode navn (art / isolat), infektion (dato infektion blev indstillet) og fælde dato (dette er den dato, hvor fælden er sat op).
- Hold fælde ved RT, indtil fremkomsten af infektive juvenile stadier (IJS) opstår. Denne proces kan tage mellem 10 - 25 dage afhængig af nematodearter og / eller stamme overvejes.
- Harvest vand med IJs ved at fjerne større skål af fælden og hælde vand med nematoder i et bægerglas.
- Tillad nematoder at dekantere på bunden af bEaker. Denne proces kan tage et par minutter.
- Hæld vand omhyggeligt, og sørg nematoder forbliver i bunden af bægeret.
- Skyl nematoder ved at tilsætte mere vand og lade nematoder at dekantere. Dette trin kan gentages 2 - 3 gange, indtil vandet er rent.
- Placer nematode suspension i en vævskulturkolbe (250 ml). Hold koncentrationen af suspensionen til 1.000 - 3.000 nematoder / ml.
- Store kolbe med nematode suspension i et kølerum eller inkubator mellem 10 - 20 ° C.
BEMÆRK: tjek gemte kolber med jævne mellemrum som holdbarhed EPN er variabel. Normalt steinernematids kan opbevares i 6 - 12 måneder uden behov for subkultur, mens heterorhabditids kan kræve mere periodiske check-ups.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jord Prøvetagning
Tredje stadie infektive unge EPN er de eneste frie levende stadier i disse nematoder livscyklus som bor i jorden (Figur 1). Derfor indsamle jordprøver er en meget effektiv metode til at komme af disse nematoder 4 viser en jord-profil angiver den dybde, som bør tages prøver. Figur. Bevarelse af fugtigheden i en prøve er en afgørende faktor for overlevelse nematoder. Derfor er det vigtigt at holde jordprøver i plastposer og vedligeholde dem ved kølige temperaturer under transporten til laboratoriet (figur 4).
Nematode Recovery
I naturen chancer for at finde insekter naturligt parasitbehandlede af EPN er mindre end 3%, medmindre der er en epidemi og en større stikprøve af insekter med EPN angrebets er fundet. Derfor baiting af jordprøver med insekter er en praktisk caoach at forbedre inddrivelsen af EPN fra deres naturlige habitat figur. 5 viser jorden lokkemad teknik. I dette tilfælde blev et 250 ml plastbeholder med skruelåg anvendes. Ca. 250 g jord blev anbragt i beholderen, og 5 - 10 G. mellonella larver blev tilsat på overfladen af jorden (figur 5 til højre). Efter 5 dage blev beholderen åbnet for at hente døde insekter med tegn på EPN infektion. Bemærk nematode-inficerede larver med rødfarvning (figur 5 venstre).
Figur 6A viser en skematisk fremstilling af det modificerede White fælde. 6B viser opsætningen af fælden. Bemærk, at EPN inficerede kadavere ikke rører hinanden, og at filter papir i den lille petriskål forbliver tørt. 6C viser IJs vej ud kadavere. Bemærk de "spor" af nematoder (IJS), der er dannet på petriskålen, som de flytter tilWards vandet. Tiden for IJ fremkomsten fra lig er variabel afhængig af nematodearter og også afhængig af temperatur og fugtighed, hvor White fælde holdes. 6D viser IJs allerede i vandet i større skål af denne fælde. Bemærk at nematoder i vandet ser rent og fri for insekt væv.
Figur 1.. Livscyklus af insektspecifikke nematoder.
Figur 2.. Skovle og andre enheder, der anvendes til indsamling af jordprøver. (A) klassisk point-skovl. (B) hånd skovl. (C) Fra venstre mod højre: Viehmeyer rør, murske, Oakfield rør, jord corers.
Figur 3.. Jordbundsanalyse strategier. (A) Stratificerede. (B) Random.
Figur 4.. Skematisk repræsentation af jordbundsanalyse strategi. Billede til venstre viser en jord-profil angiver den ønskede dybde, hvor der bør tages prøver. Billede af højre viser en jordprøve i en plastikpose med en passende mærkning.
3/52083fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5.. Pyring af jordprøver med insektlarver. Billede til højre viser sunde larver, mens billedet til venstre viser døde larver efter en 5 dages lokkemad periode.
Fig. 6. Skematisk repræsentation (A) og fotografier (BD) af en modificeret White fælde. (B) Trap sat op (C) tæt op af inficerede kadaver viser IJ fremkomsten, (D) close-up viser massiv fremkomst af IJs fra kadavere i vandet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne demonstration er den første af to præsentationer, der beskriver en række teknikker, der almindeligvis anvendes til at studere EPN og deres symbiotiske bakterier. Disse teknikker udgør vigtige skridt for en vellykket etablering af EPN kulturer i laboratoriet og danner også grundlag for andre bioassays, der beskæftiger EPN som modelorganismer for forskning.
Forskellige jordbundsundersøgelser af EPN har vist, at deres overflod og distribution kan variere på tværs af sæsoner, levesteder og geografiske regioner 4, 5,9,15. Faktorer såsom jordens tekstur, fugtindhold og temperatur samt vært tilgængelighed kan spille en central rolle i deres distribution. Derfor er det afgørende, at en foreløbig data om undersøgelsen. Når der udtages prøver, er det vigtigt, at de behandles så hurtigt som muligt. Men hvis dette ikke er en mulighed, at de skal opbevares i et koldt rum eller anden passende temperatur styrede enhed. Forskellige temperaturer kan væreovervejes til opbevaring insekt baiting beholdere afhængig af oprindelsen af prøverne. Normalt er køligere temperaturer (f.eks., 15 ° C) i betragtning til tempererede prøver og prøver fra tropiske områder, varmere temperaturer (f.eks., 30 ° C) er for påtænkt.
Den insekt baiting teknik er den mest anvendte metode til genvinding af EPN fra jordprøver. Det er en bekvem strategi, der gør det muligt at hente EPN i laboratoriet. Sidste stadiums larver af den større voks møl, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) betragtes normalt; men andre insekt værter (dvs. fårekyllinger, melorme, bille larver, osv.) kan og / eller egnede etaper skal overvejes, og anbefalede at bruge. Nogle få undersøgelser har vist, at en enkelt ekstraktion cyklus Galleria agn metode er ofte utilstrækkelige til at bestemme tilstedeværelsen af EPN i en bestemt prøve eller til at udtrække alle EPN fra jordprøves 15. Normalt varierer genvindingskvoterne mellem 20 - 40% 12,15.
Et alternativ til lokkemad af jordprøver i laboratoriet er hensynet til lokkemad in situ. Det er placeringen af insektlokkemidler i prøvetagningsstedet. I dette tilfælde er de insekter placeret i bure (normalt lavet af et metal eller plast mesh) og er tilbage i demarked steder i undersøgelsesområdet for en given periode. Burene med insekter derefter hentet og undersøges for EPN infektion. Denne fremgangsmåde er imidlertid arbejdskrævende og tidskrævende 15.
Den nematode fældefangst teknik blev oprindeligt designet af White 10 og senere modificeret af Kaya og lager 6. Teknikken udnytter tiltrækning af nematoder til vand (dvs. positiv hygrotropism) og med succes genvinder infektiøse stadier af EPN fri for insekt væv og / eller snavs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke tidligere medlemmer af Stock lab: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta og Victoria Miranda-Thompson for deres bidrag til en forbedring af mange af disse protokoller. Vi anerkender National Science Foundation støtte (tilskud IOS-0.840.932 og IOS-0.724.978) til SP lager.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
- Bedding, R. A., Akhurst, R. J. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica. 21, 109-110 (1975).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, N.Y. 473-488 (2007).
- Gaugler, R. Entomopathogenic Nematology. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2002).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. (1990).
- Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
- Lacey, L. A. Manual of techniques in invertebrate pathology. , Academic Press. London. (2012).
- McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae). Biological Control. 19, 182-190 (2000).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).
- Poinar, G. O. Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , CRC Press. Boca Raton. 23-61 (1990).
- Stock, S. P., Gress, J. C. Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona. Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).
- Stock, S. P., Hunt, D. J. Nematode morphology and systematics. Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. , CAB International Publishing. Wallingford, UK. 3-43 (2005).
- Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
- Stuart, R. J., Gaugler, R.
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
