Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Fluorescens-baserede Overvågning af PAD4 aktivitet via en Pro-fluorescens substratanalog

Published: November 5, 2014 doi: 10.3791/52114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Lehigh University

Introduction

Et stort antal af mammale proteiner er stærkt modificeret af virkningen af ​​enzymer efter biosyntesen af ​​proteiner ved ribosomet. Disse post-translationelle modifikationer (PTMS) vil forøge funktionel diversitet af proteom ved at ændre størrelse, ladning, struktur og oligomerisering tilstand (blandt andre funktioner) af proteiner 1-3. Som et resultat, kan ændringen i proteinstruktur føre til fysiologiske konsekvenser, såsom proteinnedbrydning, cellulær differentiering, signalering, modulation i genekspression og protein-protein interaktioner. Mens disse ændringer er udbredt i en stor procentdel af alle menneskelige proteiner, terminalen slutter den histonproteiner gennemgå et usædvanligt højt antal af kovalente 4 modifikationer. Histonproteiner er en familie af strukturelle proteiner, der letter kondenseringen af ​​genomisk DNA. Kovalente modifikationer af de ustrukturerede histon haler udføres og reguleres af en series af enzymer, der kan katalysere den kovalente modifikation af rester (forfattere), vende den samme modifikationer (viskelædere), og skelne mellem de ændringer, der prentet onto histon haler (læserne), 5-7. Faktisk kan de fleste af de kendte PTMS observeres inden for dette korte segment af histon herunder methylering, phosphorylering, acetylering, sumoylation, ubiquitinering og citrullination 8.

Citrullination involverer omdannelse af peptidyl-arginin til ikke- t RNA kodet peptidyl-citrullin (figur 1A). De proteiner, der er ansvarlige for denne sidekæde neutralisering, er medlemmer af PAD (p eptide en rginine d eiminase) protein familie, som alle er calcium-afhængige enzymer. 9,10. Til dato har fem medlemmer af PAD familien blevet beskrevet (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 og PAD6). Hvert medlem af denne familie synes at målrette forskellige cellulære proteiner og viser også unique vævsdistribution profiler. PAD4 er det eneste medlem af denne familie protein kendt for at være lokaliseret i kernen via en kernelokaliseringssekvens 11. Følgelig er det blevet vist at deiminate en række nukleare mål, herunder arginin sidekæder på de N-terminale haler af histoner H2A argininrest 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 og H3R26) og H4 (H4R3) 12, 13. Mens hver af PAD isozymer har specifikke og kritiske fysiologiske funktioner, har PAD4 fået betydelig mere opmærksomhed på grund af sin rolle i en række humane processer i både syge og raske celler. For nylig blev PAD4 vist sig at være et medlem af pluripotens transkriptionelle netværk 14. Begge PAD4 ekspressionsniveauer og aktivitet viste sig at være forhøjet i løbet af omprogrammering og jord-statslige pluripotente stater i mus. Ved at styre reguleringen af ​​stamcelle-gener, kan PAD4 bevare en central rolle i cellulær omprogrammering effektivitet. PAD4 har også været impliceret idannelse af neutrofile ekstracellulære fælder, som ved binding af patogener sætte deres system clearance. Den hypercitrullination af histonproteinerne af PAD4 inducerer dekondensering af chromatin, der tjener som basismateriale til indkapsling af patogene bakterier fra det ekstracellulære fælde, således afværge bakterielle infektioner 15,16.

Derudover har PAD4 vist sig at spille en aktiv rolle i en række humane sygdomme. Det er tidligere blevet vist, at afvigende ekspression af PAD4 er forbundet med indtræden og sværhedsgraden af rheumatoid arthritis, Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom og dissemineret sklerose 17. I virkeligheden tilstedeværelsen af anti-citrullinerede proteinantistoffer er en af de mest pålidelige og endelige diagnostiske og prognostiske biomarkører for rheumatoid arthritis 18. Ligeledes har dysreguleret PAD4 aktivitet for nylig blevet observeret i en række humane cancere, herunder ovarie-, bryst-, lunge-, end esophageal kræftformer 19-22. Har vist sammenhængen mellem PAD4 og cancer at være medieret gennem Elk1 onkogen eller via p53 tumor suppressor protein 22,23 og tidligere arbejde har antydet, at PAD4 kunne være et hidtil ukendt anti-cancer terapeutisk mål 17,24,25. Som et proof of principle studie blev udtømningen af PAD4 via shRNA i kolorektal cancer cellelinie HCT116 afsløret at være tilstrækkelig til at inducere apoptose og cellecyklusstandsning 26. En nyligt udviklet irreversibel PAD4 inhibitor førte til en halvfjerds procent reduktion i tumormasse i mus 27. Ganske bemærkelsesværdigt, PAD4 hæmning viste sig at fungere som en målrettet terapi, der resulterede i selektivt drab af kræftceller samtidig skåne transformerede celler.

Brugen af små molekyler for at slukke funktionen af PAD4 kan vise sig at være en kraftfuld ny strategi til at målrette kræftceller eller at forøge eksisterende cancer kemoterapeutika 28. Desværre, en potelt reversible PAD4 inhibitor er endnu at blive opdaget. En række af kovalente hæmmere er blevet udviklet ved hjælp af chlor / fluor imidine håndtag, der efterligner arginin underlaget 27,29,30 og har vist sig at være praktiske værktøjer til at forstå den rolle, PAD4 hos både raske og syge statslige celler. Men disse molekyler inhibere alle de aktive puder med lignende styrke. Derfor behovet for en let assay, der rapporterer om aktiviteten af ​​PAD4 er afgørende. Til dato har PAD4 assays blevet beskrevet at forbinde frigivelsen af ammoniak fra reaktionen til et kolorimetrisk udlæsning 31, anvende en fluorescensmærket chloroamidine substratanalog for fluorescenspolarisering assay 32, stole på syre-assisteret reaktion mellem glyoxal og citrullin 33, og koble PAD4 aktivitet til et fluorescens-dequenching trin 34. Af disse er kun den kovalente modifier haloacetamidine strategi har vist sig at være forenelige med high-throughput screening platforme 32,35,36. Vi beskriver en letkøbt fluorescens assay, som pålideligt måler aktiviteten af ​​PAD4. Assayet, som viser et stærkt signal-til-støjforhold, hastighed af analyse og robusthed måling, har potentialet til at opdage en virkelig potent og selektiv PAD4 inhibitor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PAD4 Transformation, udtryk og oprensning

  1. For PAD4 Transformation, omdanne pGEX plasmidet indeholdende PAD4 GST fusion i kemisk kompetente E. Coli (BL21 (DE3)) celler til proteinekspression ved hjælp af følgende procedure. Forbered kemisk kompetent (calciumchlorid) E. Coli (BL21 (DE3)) celler ifølge standardprotokoller.
    1. Thaw 50 pi af tidligere fremstillet kemisk kompetente BL21 (DE3) celler på is og blandes med 1 ml af pGEX plasmid indeholdende PAD4 gen i en 5 ml kultur rør. Inkubere blandingen på is i 10 minutter under forsigtig omrystning hver 2 min.
    2. Varmechok cellerne ved at anbringe blandingen i et 42 ° C vandbad i 40 sek. Umiddelbart placere celle-plasmid blandingen tilbage på is i 2 minutter for at tillade cellerne at komme sig. Tilsæt 1 ml sterilt LB-medium til blandingen og anbring på is i 1 min.
    3. Inkubér varmechok celler ved 37 ° C under omrystning ved 250 rpm i 1time. Pipette 75 pi af de transformerede celler på en ampicillinresistent agarplade og inkuberes ved 37 ° C i 15 timer. Store plade ved 4 ° C.
  2. PAD4 Expression.
    1. Pick 1 koloni af BL21 (DE3) -celler fra ampicillin agarplade og sted i 5 ml LB indeholdende 1x ampicillin. Sted i inkubatoren og ryst O / N ved 37 ° C.
    2. Overfør 5 ml LB (starter) i 1 l sterilt LB indeholdende 1x ampicillin trihydrat (MW 403,45 g / mol). Sted vækst i en 37 ° C rysteinkubator. Overvåg OD 600 af væksten. Når væksten når op på en OD 600 på 0,3, flytte vækst i 16 ° C rysteinkubator.
    3. Efter at have nået en OD600 på 0,6, inducere cellerne med 0,3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / mol). Tillade celler at ryste i 15 timer ved 16 ° C.
    4. Høst cellerne ved centrifugering ved 4.000 x g i 20 min ved 0 ° C. Hæld supernatanten og opbevare pellet ved -80 ° C.
  3. PAD4 Oprensning
    1. Resuspender pellet indeholdende det udtrykte PAD4 i BL21 (DE3) celler i en puffer af 50 mM NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM NaH 2PO 4 (MW 119,98 g / mol), 10 mM Imidazol (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) og 1 mM dithiothreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0.
    2. Lysere cellerne via sonikering i 15 min ved 4 ° C. Efter lydbehandling, centrifugeres cellelysatet ved 20.000 xg i 20 minutter ved 0 ° C. Hæld og gem supernatanten. Batch supernatanten med glutathion (GSH) agaroseperler i 30 minutter ved stuetemperatur.
    3. Drain supernatant fra GST perler / kolonne via tyngdekraften. Vaske perlerne med 4 x 25 ml 1x PBS (phosphatbufret saltvand, pH = 8,0) ved stuetemperatur.
    4. Elute PAD4 med 2 x 10 ml Elution buffer, 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM glutathion (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0.
    5. Koncentrere PAD4 anvendelse 100k MW cut-off centrifugerør og centrifugeres ved 4.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Aliquot protein i volumener 200 pi i 1,0 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C.

2. Forberedelse Stock Løsninger til Buffers

  1. Afvej natriumchlorid (NaCl, MW 58,44 g / mol) og forberede en 2 M opløsning. Bland opløsningen indtil den er klar.
  2. Afvej Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris Base, MW 121,14 g / mol) og forberede en 2 M opløsning, pH = 8,0. Bland opløsningen indtil den er klar.
  3. Afvej calciumchloriddihydrat (CaCl2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) og forberede en 500 mM opløsning. Bland opløsningen indtil den er klar.
  4. Afvej Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP, MW 250,19 g / mol) og forberede en 200 mM opløsning. Bland løsning, indtil klar og opbevares ved -20 ° C.
  5. Afvej dithiothreitol (DTT, MW 154,25 g / mol) og forberede en 1 M opløsning. Bland løsning, indtil klar og opbevares ved -20 ° C.
  6. Forbereden 0,5% opløsning af Triton X-100.
  7. Afvej ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA, MW 292,24 g / mol) og forberede en 100 mM opløsning. Bland opløsningen indtil den er klar.
  8. Afvej Z- Arg- Arg- 7- amido- 4- methylcoumarin hydrochlorid (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) og forberede en 10 mM opløsning i dimethylsulfoxid (DMSO).

3. PAD4 Assay ved 37 ° C

  1. Fra 10 mM ZRcoum lager, forberede en 125 uM opløsning af ZRcoum i vand. Denne 125 uM ZRcoum løsning vil være Solution A.
  2. Forberede en buffer på 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT og 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dette vil være Solution B.
  3. Forberede en buffer på 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Dette vil være Solution C.
  4. Afveje trypsin, krystallinsk (fra kvæg bugspytkirtlen) og forberede en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Bland løsning, indtil klar og opbevares ved -20° C. Dette vil være Solution D.
  5. Opnåelse af en 96-brønds plade og udpege et antal brønde for kontrol (ingen PAD4) og testbrønde (+ PAD4).
  6. Pipette 160 ul opløsning B til testbrønde og pipette 160 ml af opløsningen, C i kontrolbrønde. Der inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C.
  7. Pipette 40 pi af opløsning A i alle brønde og inkuberet ved 37 ° C i 45 minutter.
  8. Afpipetteres 10 pi dH2O til halvdelen af kontrolbrøndene og halvdelen af testbrøndene. Til den anden halvdel af kontrol- brønde og test kontrol, pipette 10 ml af opløsningen, D. inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
  9. Opnå en fluorescens læsning på en multimodal læser med en excitationsbølgelængde på 345 nm og en emissionsbølgelængde på 465 nm.

4. PAD4 Assay ved stuetemperatur

  1. Fra 10 mM ZRcoum lager, forberede en 50 uM opløsning af ZRcoum i vand. Denne 50uM ZRcoum løsning vil være Solution A.
  2. Forbered en buffer på 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 og 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dette vil være Solution B.
  3. Forberede en buffer af 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, og 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Dette vil være Solution C.
  4. Afveje trypsin, krystallinsk (fra kvæg bugspytkirtlen) og forberede en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Bland løsning, indtil klar og opbevares ved -20 ° C. Dette vil være Solution D.
  5. Anskaf en 384 brønde og udpege brønde for kontroller (ingen PAD4) og testbrønde (+ PAD4).
  6. Pipette 25 pi opløsning B til testbrønde og pipette 25 pi af opløsning C til kontrolbrønde. Tillad buffer med / uden PAD4 at inkubere i brøndene i 20 min ved stuetemperatur.
  7. Pipetter 25 pi opløsning C til alle brønde og inkuberes i 45 minutter ved stuetemperatur.
  8. Afpipetteres 10 pi dH2O til halvdelen af kontrolbrøndene og halvdelen af testbrøndene. Til den anden halvdel af kontrol- brønde og test kontroller, pipette 10 pi af opløsning D. Der inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
  9. Opnå en fluorescens læsning på en multimodal læser med en excitationsbølgelængde på 345 nm og en emissionsbølgelængde på 465 nm.

5. PAD4 Tidsforløb assays ved 37 ° C og stuetemperatur

  1. Fra 10 mM ZRcoum lager, forberede en 125 uM opløsning af ZRcoum i vand. Denne 125 uM ZRcoum løsning vil være Solution A.
  2. Forberede en buffer på 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT og 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dette vil være Solution B.
  3. Afveje trypsin, krystallinsk (fra kvæg bugspytkirtlen) og forberede en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Bland løsning, indtil klar og opbevares ved -20 ° C. Dette vil være Solution C.
  4. Opnå 2 plader med 96 brønde og pipette 160 ml af opløsningen, B i # mængden af ​​brønde (# af brønde vil afhænge af, hvor mange tidspunkter).
  5. Inkuberes en 96-brønds plade ved 37 ° C. Inkuberes anden 96-brønds plade ved stuetemperatur.
  6. Pipette 40 pi af opløsning A i alle brønde i begge plader med 96 brønde og straks pipetteres 10 pi opløsning C i t = 0 min brønde. Fortsæt med at tilføje 10 pi af opløsning C på bestemte tidspunkter, indtil alle brønde er blevet slukket.
  7. Opnå en fluorescens læsning på en multimodal læser med en excitationsbølgelængde på 345 nm og en emissionsbølgelængde på 465 nm.

6. PAD4 inhiberingsassay ved stuetemperatur

  1. Fra 10 mM ZRcoum lager, forberede en 83 uM opløsning af ZRcoum i vand. Denne 83 uM ZRcoum løsning vil være Solution A.
  2. Afvej Cl-amidin (MW 424,8 g / mol) og forberede en 100 uM stamopløsning. Dette vil være Solution B.
  3. Forberede en buffer af 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 og 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dette vil være Solution C.
  4. Forberede en buffer af 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, og 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Ther vil være Solution D.
  5. Afveje trypsin, krystallinsk (fra kvæg bugspytkirtlen) og forberede en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Bland løsning, indtil klar og opbevares ved -20 ° C. Dette vil være Solution E.
  6. Anskaf en 384 brønde og udpege brønde til kontroller (ingen PAD4), testbrønde (+ PAD4) og hæmning brønde (PAD4 + Cl-amidin-).
  7. Pipette 25 pi af opløsning C til testbrønde og pipette 25 ml af opløsningen D i kontrolbrønde. Tillad buffer med / uden PAD4 at inkubere i brøndene i 20 min ved stuetemperatur.
  8. Pipetter 10 pi af opløsning B til hæmning brønde og inkuberes i 20 minutter ved RTE.
  9. Pipetter 15 pi af opløsning A i alle brønde og inkuberes i 45 minutter ved stuetemperatur.
  10. Afpipetteres 10 pi Solution E til alle brønde. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
  11. Opnå en fluorescens læsning på en multimodal læser med en excitationsbølgelængde på 345 nm og en emissionsbølgelængde på 465 nm.

7. Rå Cell Lysate Assayved stuetemperatur

  1. Efter høst af celler fra PAD4 1 L vækst, resuspender cellerne i 10 ml 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) og 1 mM dithiothreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0.
  2. Lysere cellerne via sonikering i 15 min ved 4 ° C. Centrifuger cellelysatet ved 20.000 xg i 20 minutter ved 0 ° C. Koncentrer den klare supernatant til det halve volumen ved centrifugering ved 4.000 rpm ved 4 ° C under anvendelse af 100k MW cut-off centrifugerør.
  3. Fra 10 mM ZRcoum lager, forberede en 250 uM opløsning af ZRcoum i vand. Denne 250 um ZRcoum løsning vil være Solution A.
  4. Forberede en buffer af 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, og 2 mM TCEP (pH = 8,0). Dette vil være Solution B.
  5. Afveje trypsin, krystallinsk (fra kvæg bugspytkirtlen) og forberede en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Bland løsning, indtil klar og opbevares ved -20 ° C. Dette vil være Solution C.
  6. Opnå en sort plade med 384 brønde og designspiste brønde for kontroller (ingen cellelysaturenheder) og testbrønde (+ cellelysaturenheder).
  7. Der afpipetteres 100 ul opløsning B i alle brønde og pipette 60 pi Cellelysatet i testbrønde. Der inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur.
  8. Pipetter 40 pi af opløsning A i alle brønde og inkuberes i 45 minutter ved stuetemperatur.
  9. Afpipetteres 10 ul opløsning C til alle brønde. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
  10. Anskaf en fluorescens læsning på multimodal læser med en excitationsbølgelængde på 345 nm og en emission bølgelængde på 465 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I første omgang blev det påvist, at ZRcoum kan rapportere om aktiviteten af PAD4 i en 96-brønds plade-format. Brønde blev inkuberet med substratet ZRcoum og i nærvær / fravær af PAD4. Efter en inkubationsperiode på 45 minutter ved 37 ° C blev fluorescensen målt med et 340/40 - 475/15 nm filter (figur 2A). Som forventet niveauer af fluorescens forblev lav som fluoroforen inden ZRcoum (eller citrullinerede ZRcoum) forblev i låst tilstand. Ved tilsætning af overskud af trypsin / EDTA til opløsningen, fluoroforerne var befriet fra ZRcoum men forblev hovedsagelig uændret i nærvær af PAD4. Tilsætning af EDTA til formål at hjælpe i ophør af PAD4 reaktion på grund af sin evne til at chelatere de væsentlige calciumioner. Ud fra disse data blev en 5,2-fold reduktion i fluorescens output observeret i nærvær af PAD4. Dernæst compatibility af den nyudviklede assay med high-throughput screening platforme blev påvist. Det var af primær interesse at analysere fire reaktionsprodukter variabler, der vil være mest gunstigt for screening (1) yderligere miniaturisering af assayet volumen (2) mulighed for at udføre assayet ved stuetemperatur (3) stabiliteten af ​​proteinet og bufferblanding forud for afslutning af analysen og (4) den potentielle interferens af organiske opløsningsmidler / rengøringsmidler.

Til midten eller high-throughput screening indsatsen, high-density brøndsplader almindeligt anvendt i små molekyler skærme. Det blev verificeret, at assayet kan udføres næsten identisk i en 384-brønds plade i forhold til en 96-brønds plade (figur 2B). Under den videre fastlæggelse af arbejdsvilkår for analysen i en high-throughput format, var det vigtigt at undersøge, om PAD4 aktivitet kan overvåges inden for en rimelig tidsramme ved stuetemperatur. Da ikke alle flydende håndtering instrumenteren temperaturregulator, kan det blive besværligt og bekosteligt at have et inkubationstrin ved forhøjet temperatur. Desuden kan tegner sig for udsving i temperaturen være en årsag til uoverensstemmelse mellem plader og kører. For at bestemme virkningen af ​​lavere temperaturer for assayet er beskrevet her, blev en lignende analyse udført ved RT. Det konstateredes, at de signaler, var stort set uændret mellem 37 ° C og stuetemperatur (figur 3). For yderligere at optimere ydeevnen af ​​assayet ved at minimere den krævede inkubationstid mellem PAD4 og substratet blev kinetikken for reaktionen analyseret. PAD4 blev overvåget over tid både ved stuetemperatur og 37 ° C. Som forventet, fremgår det, at PAD4 er mere aktiv ved 37 ° C (i overensstemmelse med human fysiologisk temperatur) med reaktionen hovedsagelig fuldstændig ved 20 min. Satisfyingly reaktionen ikke stærkt påvirket af reduktion i temperaturen ned til stuetemperatur. Reaktionen forløber ved omtrent den halve hastighed som vedforhøjet temperatur og er i det væsentlige fuldstændig 40-45 minutter efter indvielse. Fra tidsforløbet analyser blev kinetiske konstanter beregnet og parametrene (K M = 397 pM, kcat = 2,98 sek-1, k cat / k M = 7,400 sek-1 M-1) blev konstateret at være magen til andre PAD4 substrater. 31 Med kinetikken for reaktionen karakteriseret, blev alle efterfølgende assays reduceret til 1 time fra begyndelsen til målepunktet.

Dernæst blev stabiliteten af ​​PAD4 evalueret, når de opløses i reaktionspuffer over en længere periode. Realistisk set vil high-throughput screening kræve reagenser generelt at være stabil i mange timer, mens instrumentet er ved at afslutte skærmen. Hvis bestemte reagenser har en relativ holdbarhed minutter, kan det være meget dyrt og tidskrævende at afslutte skærmen for at forberede friske reagenser. Afhængigt af assaybetingelser, er det ikkeusædvanligt for nogle analyser for at være uforenelig med høj gennemløb screening for netop denne grund. Med denne idé i tankerne, blev stabiliteten af ​​PAD4 i puffer overvåges over flere timer. Næsten ingen tab i enzymatisk aktivitet blev observeret i hele den periode, hvilket viser, at proteinet er stabilt selv efter sidder ved stuetemperatur i over 15 timer (figur 4A). Dernæst blev det vurderet, om assayet køre under miniaturiserede betingelser og ved stuetemperatur stadig ville passende reagere på tilstedeværelsen af ​​en PAD4. Ved inkubation af den kendte PAD4 inhibitor, chloroamidine (Cl-amidin), førte til en fuldstændig genoprettelse af fluorescenssignalet overensstemmelse med fuld inhibering af PAD4 (figur 4B). Endelig blev det også bekræftet, at tilstedeværelsen af ​​det organiske opløsningsmiddel DMSO, der almindeligvis anvendes i stamopløsninger af små molekyler, op til 3% som slutvolumen ikke interferere med analysen (data ikke vist). Ligeledes tilsætning af 0,01% Triton X-100 resulterede i simnende fluorescens tendenser (data ikke vist).

Har vist, at assayet er tolerant over for en række betingelser, der typisk forekommer i små molekyler drug discovery indsats blev en indledende screening af 80 forbindelser udføres og en robust Z 'værdi på 0,71 blev identificeret. I at fremme potentialet i assayet blev selektiviteten af PAD4 / ZRcoum reaktion fremhævet ved at udføre reaktionen i rå helcellelysater. E. coli-celler indeholdende GST-PAD4 ekspressionsvektor blev induceret med IPTG, svarende til den, der anvendes til isolation af GST-PAD4 procedure. Efter afbrydelse af cellemembranen via sonikering blev cellerester adskilt ved centrifugering til opnåelse af en klaret cellelysat. Når PAD4-holdige cellelysat blev forelagt det samme assay betingelser som det oprensede GST-PAD4 assay, fluorescenssignalet varierede i aftale med tilstedeværelsen af ​​aktiv PAD4 i opløsning ( > Figur 5). Cellelysater indeholder en række biomakromolekyler ved høje koncentrationer, der potentielt kan interferere med aktiviteten af PAD4, de fluorescerende egenskaber ZRcoum og trypsin trin. Konstateringen af, at assayet var funktionelle i rå cellelysater indikerer, at der er en høj selektivitet i reaktionen mellem PAD4 og ZRcoum. For yderligere at demonstrere, at signalet fald i nærvær af rå cellelysater var specifik for tilstedeværelsen af ​​aktiv PAD4, effekten af ​​Cl-amidin, en etableret kovalent PAD4 inhibitor, blev evalueret. Tilsætning af Cl-amidin førte til en restaurering i fluorescenssignalet overensstemmelse med inaktivering af PAD4 (figur 5). Sammen blev det påvist analysen kan forenkles yderligere ved at udnytte rå cellelysater til overvågning af PAD4 aktivitet.

2114 / 52114fig1highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 1. PAD4 og udformningen af fluorescens-baseret assay. (A) cartoon repræsentation af histon enheder, der udgør den grundlæggende enhed i et nukleosom. PAD4 katalyserer citrullination af et antal argininrester på histon proteiner. (B) ZRcoum overlejret med den native substrat (skjult for klarhed) af PAD4 (tiltrædelse kode 2DW5). (C) Repræsentation af trin i en typisk PAD4 assay. Citrullination ved PAD4 af substratet ZRcoum reducerer dets modtagelighed for trypsin-medieret amidhydrolyse, hvilket forårsager en ændring i niveauer af fluorescens. Klik her for at se en større udgave af figuren.

Figur 2 Figur 2. PAD4 assay i 96-brønds og 384-brønds plade formater. Fluorescens blev målt (excitation 345 nm / emission 465 nm) i både en 96-brønds format (A) og 384-brønds format (B) med de udpegede betingelser (37 ° C). Tilføjelsen af ​​protease trypsin fører til en stor stigning i niveauer af fluorescens i brønde uden PAD4 og er stort set uændret for brønde med PAD4. Data er repræsenteret som middelværdi + SD (n = 3). Klik her for at se en større udgave af figuren.

Figur 3
Figur 3. Tidsforløb analyse af PAD4 assay. Fluorescens blev målt (excitation 345 nm / emission 465 nm) periodisk i en 96-brønds plade format i løbet af 70 min med proteinet inkuberes enten 37° C (A) eller ved stuetemperatur (B). Data er repræsenteret som middelværdi +/- SD (n = 3). Klik her for at se en større udgave af figuren.

Figur 4
Figur 4. Protein stabilitet og hæmning. (A) Aktiviteten af PAD4 blev målt efter de angivne tidsintervaller. Til sammenligning er de niveauer af fluorescens vist i fravær af PAD4. Niveauer af fluorescens er vist før (rød) og efter (grøn) tilsætning af trypsin. (B) Indførelse af den kendte PAD4 inhibitoren Cl-amidin (100 uM) førte til en genoprettelse af fluorescenssignalet i en 384-brøndplade format ved stuetemperatur. Niveauer af fluorescens er vist før (rød) og efter (grøn) tilsætning af trypsin. Alle data er represented som middelværdi +/- SD (n = 3). Klik her for at se en større udgave af figuren.

Figur 5
Figur 5. Rå cellelysat assay. Assayet blev udført i fravær og nærvær af rå cellelysater i en 384-brøndplade format ved stuetemperatur. Niveauer af fluorescens er vist før (rød) og efter (grøn) tilsætning af trypsin. Cl-amidin (100 uM) forårsagede også en stigning i fluorescens signal under disse betingelser. Alle data er repræsenteret som middelværdi +/- SD (n = 3). Klik her for at se en større udgave af figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter http://www.perkinelmer.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
  2. Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
  3. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
  4. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
  5. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
  6. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  7. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
  8. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
  9. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
  10. Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
  11. Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
  12. Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
  13. Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
  14. Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
  15. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  16. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
  17. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
  18. Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
  19. Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
  20. Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).
  21. Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
  22. Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
  23. Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676 (2012).
  25. Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
  26. Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
  27. Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
  28. Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
  29. Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
  30. Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
  31. Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
  32. Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
  33. Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
  34. Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
  35. Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
  36. Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
  37. Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
  38. Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
  39. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).

Tags

Kemi PAD4 PADI4 citrullination arginin post-translationel modifikation HTS assay fluorescens citrullin
Fluorescens-baserede Overvågning af PAD4 aktivitet via en Pro-fluorescens substratanalog
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, … More

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter