Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Fluorescens-baserad övervakning av PAD4 aktivitet via en Pro-fluorescens Substrat Analog

Published: November 5, 2014 doi: 10.3791/52114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Lehigh University

Introduction

Ett stort antal däggdjursproteiner är starkt modifierat genom verkan av enzymer efter biosyntesen av proteiner genom ribosomen. Dessa post-translationella modifieringar (PTMs) kan öka den funktionella mångfalden av proteomet genom att ändra storlek, laddning, struktur och oligomerisering staten (bland andra funktioner) av proteiner 1-3. Som ett resultat av detta kan förändringar i proteinstrukturen leda till fysiologiska konsekvenser, såsom proteinnedbrytning, cellulär differentiering, signalering, modulering i genexpression, och protein-proteininteraktioner. Även om dessa ändringar är vanliga i en stor andel av alla mänskliga proteiner, avslutar terminalen på histonproteiner genomgår ett ovanligt högt antal kovalenta modifieringar 4. Histonproteiner är en familj av strukturproteiner som underlättar kondensationen av genomiskt DNA. Kovalenta modifieringar av ostrukturerade histon svansar genomförs och regleras av en series av enzymer som kan katalysera kovalent modifiering av rester (författare), vända samma modifieringar (suddgummin), och skilja mellan de förändringar som präglade på histon svansar (läsare) 5-7. I själva verket är de flesta av de kända PTMs kan observeras inom denna korta segment av histon inkluderande metylering, fosforylering, acetylering, sumoylation, ubikvitinering och citrullinering 8.

Citrullinering innebär omvandlingen av peptidyl-arginin till den icke-t-RNA kodad peptidyl-citrullin (Figur 1A). De proteiner, som är ansvariga för denna sidokedja neutralisering, är medlemmar av PAD (p eptide en rginine d eiminase) proteinfamiljen, av vilka alla är kalciumberoende enzymer. 9,10. Hittills har fem medlemmar av PAD familjen beskrivits (Pad1, pad2, PAD3, PAD4 och PAD6). Varje medlem av denna familj verkar rikta distinkta cellulära proteiner och även visar unique vävnadsdistributionsprofiler. PAD4 är den enda medlemmen av denna proteinfamilj känd för att vara lokaliserade i kärnan via en nukleär lokaliseringssekvens 11. Följaktligen har det visats att deiminate ett antal nukleära mål, inklusive arginin sidokedjor på de N-terminala svansar av histoner H2A argininrest 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 och H3R26) och H4 (H4R3) 12, 13. Medan var och en av PAD isozymerna har specifika och viktiga fysiologiska funktioner, har PAD4 fått betydligt mer uppmärksamhet på grund av sin roll i ett antal mänskliga processer i både sjuka och friska celler. Nyligen var PAD4 visat sig vara en medlem av pluripotens transkriptionsnätet 14. Båda PAD4 uttrycksnivåer och aktivitet visade sig vara förhöjda under omprogrammering och mark statliga pluripotenta stater i möss. Genom att styra regleringen av stamcellsgener kan PAD4 behålla en central roll i cellulär omprogrammering effektivitet. PAD4 har också implicerats ibildningen av neutrofila extracellulära fällor, som vid bindning av patogener möjliggöra deras systemintyg. Den hypercitrullination av histonproteiner från PAD4 inducerar decondensation av kromatin, som fungerar som basmaterial för inkapsling av patogena bakterier genom den extracellulära fällan, vilket avvärja bakteriella infektioner 15,16.

Dessutom har PAD4 befunnits spela en aktiv roll i ett antal mänskliga sjukdomar. Man har tidigare visat att onormalt uttryck av PAD4 associeras med uppkomsten och svårighetsgraden av reumatoid artrit, Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och multipel skleros 17. I själva verket är förekomsten av anti-citrullinerade proteinantikroppar en av de mest pålitliga och definitiva diagnostiska och prognostiska biomarkörer för reumatoid artrit 18. Likaså har dysreglerad PAD4 aktivitet nyligen observerats i ett antal humana cancerformer inklusive äggstocks-, bröst-, lung-, end esophageal cancer 19-22. Kopplingen mellan PAD4 och cancer har visat sig vara medierad via ELK1 onkogenen eller via p53-tumörsuppressorproteinet 22,23 och tidigare arbete har föreslagit att PAD4 skulle kunna vara en ny anticancer terapeutiskt mål 17,24,25. Som ett proof of principle studie utarmning av PAD4 via shRNA i kolorektal cancer cellinje HCT116 visade sig vara tillräckligt för att inducera apoptos och cellcykelstopp 26. En nyligen utvecklad irreversibel PAD4 inhibitor ledde till en minskning i tumörmassa hos möss 27 sjuttio procent. Ganska anmärkningsvärt, verkade PAD4 inhibition att fungera som en målsökande terapi som resulterade i selektiv dödande av cancerceller utan att skada otransformerade celler.

Användningen av små molekyler för att stänga av funktionen för PAD4 kan visa sig vara en kraftfull ny strategi för att rikta cancerceller eller för att förstärka befintliga cancer kemoterapeutika 28. Tyvärr, en potält reversibel PAD4 hämmare har ännu inte upptäckt. Ett antal kovalenta inhibitorer har utvecklats med hjälp av klor / fluor imidine handtag som efterliknar arginin substratet 27,29,30 och har visat sig vara praktiska verktyg för att förstå rollen som PAD4 både hos friska och sjuka statliga celler. Emellertid har dessa molekyler inhiberar alla aktiva kuddar med liknande potens. Därför är behovet av en enkel analys som rapporterar på aktiviteten av PAD4 avgörande. Hittills har PAD4 analyser beskrivits att länka frisättningen av ammoniak från reaktionen till en kolorimetrisk avläsning 31, utnyttjar en fluorescensmärkt chloroamidine substratanalog för fluorescenspolarisationsanalys 32 förlita sig på den syra assisterad reaktion mellan glyoxal och citrullin 33, och koppla PAD4 verksamhet till en fluorescens dequenching steg 34. Av dessa är det bara den kovalenta modifierings haloacetamidine strategi har visat sig vara kompatibel med hög genomströmning skärmening plattformar 32,35,36. Vi beskriver en enkel fluorescensbaserad analys som på ett tillförlitligt sätt mäter aktiviteten av PAD4. Analysen, som visar en stark signal-till-brus-förhållande, analyshastigheten, och robusthet för mätningen, har potential att upptäcka en verkligt effektiv och selektiv PAD4 inhibitor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PAD4 Transformation, Expression och rening

  1. För PAD4 Transformation, förvandla pGEX plasmid som innehåller PAD4 GST fusion i kemiskt kompetenta E. Coli (BL21 (DE3)) celler för proteinuttryck med hjälp av följande procedur. Förbered kemiskt kompetent (kalciumklorid) E. Coli (BL21 (DE3)) celler enligt standardprotokoll.
    1. Tö 50 pl av tidigare framställd kemiskt kompetenta BL21 (DE3) celler på is och blandas med 1 ul av pGEX-plasmiden innehållande PAD4 gen i en 5 ml odlingsrör. Inkubera blandningen på is under 10 minuter under försiktig skakning var 2 min.
    2. Värmechock cellerna genom placering av blandningen i en 42 ° C vattenbad under 40 sek. Placera omedelbart cell-plasmid blandning tillbaka på is under 2 min för att tillåta cellerna att återhämta sig. Tillsätt 1 ml steril LB-buljong till blandningen och placera på is under 1 min.
    3. Inkubera värme chockade celler vid 37 ° C, skakning vid 250 rpm i enh. Pipettera 75 | il av de transformerade celler på en ampicillinresistent agarplatta och inkubera vid 37 ° C under 15 h. Butiks plattan vid 4 ° C.
  2. PAD4 Expression.
    1. Plocka en koloni av BL21 (DE3) celler från ampicillin agarplatta och placera i 5 ml LB innehållande 1x ampicillin. Placera i inkubator och skaka O / N vid 37 ° C.
    2. Överför 5 ml LB (starter) i 1 L av steril LB innehållande 1x ampicillin-trihydrat (molvikt 403,45 g / mol). Plats tillväxt i ett 37 ° C skakande inkubator. Övervaka OD 600 av tillväxten. När tillväxten når en OD 600 på 0,3, flytta tillväxt till 16 ° C skakande inkubator.
    3. Vid uppnående av en OD 600 av 0,6, inducera cellerna med 0,3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / mol). Låt cellerna att skaka i 15 timmar vid 16 ° C.
    4. Skörda cellerna genom centrifugering vid 4000 xg under 20 min vid 0 ° C. Häll av supernatanten och lagra pelleten vid -80 ° C.
  3. PAD4 Rening
    1. Återsuspendera pelleten innehållande den uttryckta PAD4 i BL21 (DE3) -celler i en buffert av 50 mM NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM NaH 2 PO 4 (molekylvikt 119,98 g / mol), 10 mM imidazol (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) och 1 mM ditiotreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0.
    2. Lysera cellerna via sonikering under 15 min vid 4 ° C. Efter sonikering, centrifugera cellysatet vid 20.000 xg under 20 minuter vid 0 ° C. Häll av och spara supernatanten. Batch supernatanten med glutation (GSH) agaroskulor för 30 min vid RT.
    3. Tappa supernatant från GST pärlor / kolumn med hjälp av gravitationen. Tvätta pärlorna med 4 x 25 ml 1 x PBS (fosfatbuffrad saltlösning, pH = 8,0) vid rumstemperatur.
    4. Eluera PAD4 med 2 x 10 ml Eluering buffert, 50 mM tris (hydroximetyl) aminometan (Tris-bas, MW 121,14 g / mol), 10 mM glutation (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0.
    5. Koncentrera PAD4 använder 100k MW cut-off centrifugrör och centrifugera vid 4000 xg under 20 min vid 4 ° C. Alikvot protein i 200 il volymer i 1,0 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -80 ° C.

2. förbereda Arkiv Lösningar för Buffertar

  1. Väg upp natriumklorid (NaCl, MW 58,44 g / mol) och förbereda en 2 M lösning. Blanda lösningen tills klar.
  2. Väg upp Tris (hydroximetyl) aminometan (Tris-bas, MW 121,14 g / mol) och framställa en 2 M lösning, pH = 8,0. Blanda lösningen tills klar.
  3. Väg upp kalciumkloriddihydrat (CaCl 2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) och framställa en 500 mM lösning. Blanda lösningen tills klar.
  4. Väg upp Tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP, MW 250,19 g / mol) och förbereda en 200 mM lösning. Blanda lösningen tills klar och förvara vid -20 ° C.
  5. Väg upp ditiotreitol (DTT, MW 154,25 g / mol) och framställa en 1 M lösning. Blanda lösningen tills klar och förvara vid -20 ° C.
  6. Förbereden 0,5% lösning av Triton X-100.
  7. Väg upp etylendiamintetraättiksyra (EDTA, MW 292,24 g / mol) och framställa en 100 mM lösning. Blanda lösningen tills klar.
  8. Väg upp Z- Arg- Arg- 7- amido- 4- metylkumarin-hydroklorid (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) och framställa en 10 mM lösning i dimetylsulfoxid (DMSO).

3. PAD4 Assay vid 37 ° C

  1. Från 10 mM ZRcoum lager, bereda en 125 iM lösning av ZRcoum i vatten. Denna 125 iM ZRcoum lösning blir Lösning A.
  2. Bered en buffert av 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT, och 5 pM PAD4 (pH = 8,0). Detta kommer att vara lösning B.
  3. Bered en buffert av 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, och 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Detta kommer att vara Lösning C.
  4. Väg upp Trypsin, kristallin (från bovin pankreas) och framställa en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Blanda lösningen tills klar och förvara vid -20° C. Detta kommer att vara Solution D.
  5. Erhållande av en 96-brunnars platta och beteckna ett antal brunnar för kontroller (ingen PAD4) och testbrunnar (+ PAD4).
  6. Pipettera 160 pl av lösning B i testbrunnar och pipett 160 fil lösning C till kontrollbrunnar. Inkubera under 15 minuter vid 37 ° C.
  7. Pipettera 40 | il av lösning A i alla brunnarna och inkubera vid 37 ° C under 45 min.
  8. Pipettera 10 pl dH 2 O till hälften av kontrollbrunnarna och hälften av testbrunnarna. Till den andra hälften av kontrollbrunnar och testkontroller, pipett 10 ul av Lösning D. Inkubera under 10 min vid 37 ° C.
  9. Erhållande av en fluorescensavläsning på en multimodal läsare med en excitationsvåglängd av 345 nm och en emissionsvåglängd av 465 nm.

4. PAD4 Assay vid RT

  1. Från 10 mM ZRcoum lager, förbereda en 50 ^ M lösning av ZRcoum i vatten. Detta 50 pM ZRcoum lösningen kommer att vara Lösning A.
  2. Förbered en buffert av 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100, och 8 pM PAD4 (pH = 8,0). Detta kommer att vara lösning B.
  3. Bered en buffert av 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, och 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Detta kommer att vara Lösning C.
  4. Väg upp Trypsin, kristallin (från bovin pankreas) och framställa en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Blanda lösningen tills klar och förvara vid -20 ° C. Detta kommer att vara Solution D.
  5. Skaffa en 384-brunnar och utse brunnar för kontroller (ingen PAD4) och testbrunnar (+ PAD4).
  6. Pipettera 25 | il av lösning B i testbrunnarna och pipettera 25 pl av lösning C till kontrollbrunnar. Tillåt buffert med / utan PAD4 att inkubera i brunnarna under 20 min vid RT.
  7. Pipettera 25 pl av lösning C i alla brunnarna och inkubera under 45 min vid RT.
  8. Pipettera 10 pl dH 2 O till hälften av kontrollbrunnarna och hälften av testbrunnarna. Till den andra halvan av kontrollbrunnar och testkontroller, pipette 10 | il av lösning D. Inkubera vid RT under 10 min.
  9. Erhållande av en fluorescensavläsning på en multimodal läsare med en excitationsvåglängd av 345 nm och en emissionsvåglängd av 465 nm.

5. PAD4 tidsförloppet Analyser vid 37 ° C och RT

  1. Från 10 mM ZRcoum lager, bereda en 125 iM lösning av ZRcoum i vatten. Denna 125 iM ZRcoum lösning blir Lösning A.
  2. Bered en buffert av 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT, och 5 pM PAD4 (pH = 8,0). Detta kommer att vara lösning B.
  3. Väg upp Trypsin, kristallin (från bovin pankreas) och framställa en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Blanda lösningen tills klar och förvara vid -20 ° C. Detta kommer att vara Lösning C.
  4. Skaffa två plattor med 96 brunnar och pipett 160 pl av lösning B i # mängd brunnar (# av brunnar kommer att bero på hur många tidpunkter).
  5. Inkubera en 96-brunnars platta vid 37 ° C. Inkubera den andra 96-brunnsplatta vid RT.
  6. Pipette 40 pl av lösning A till samtliga brunnar i båda 96-brunnsplattor och omedelbart pipettera 10 pl av lösning C i t = 0 min brunnar. Fortsätt att tillsätta 10 pl lösning C vid specifika tidpunkter tills alla brunnar har släcktes.
  7. Erhållande av en fluorescensavläsning på en multimodal läsare med en excitationsvåglängd av 345 nm och en emissionsvåglängd av 465 nm.

6. PAD4 Inhibition Assay vid RT

  1. Från 10 mM ZRcoum lager, bereda en 83 ^ M lösning av ZRcoum i vatten. Detta 83 iM ZRcoum lösningen kommer att vara Lösning A.
  2. Väg in Cl-amidin (MW 424,8 g / mol) och framställa en 100 pM stamlösning. Detta kommer att vara lösning B.
  3. Bered en buffert av 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100, och 8 pM PAD4 (pH = 8,0). Detta kommer att vara Lösning C.
  4. Bered en buffert av 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, och 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Thär blir Solution D.
  5. Väg upp Trypsin, kristallin (från bovin pankreas) och framställa en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Blanda lösningen tills klar och förvara vid -20 ° C. Detta kommer att vara Solution E.
  6. Skaffa en 384-brunnar och utse brunnar för kontroller (ingen PAD4), testbrunnar (+ PAD4) och hämning brunnar (PAD4 + Cl-amidin-).
  7. Pipettera 25 pl av lösning C till testbrunnar och pipett 25 ul av lösning D i kontrollbrunnarna. Tillåt buffert med / utan PAD4 att inkubera i brunnarna under 20 min vid RT.
  8. Pipettera 10 | il av lösning B till hämnings brunnar och inkubera i 20 min vid Rte.
  9. Pipettera 15 | il av lösning A i alla brunnarna och inkubera under 45 min vid RT.
  10. Pipettera 10 pl lösning E till alla brunnar. Inkubera vid RT i 10 min.
  11. Erhållande av en fluorescensavläsning på en multimodal läsare med en excitationsvåglängd av 345 nm och en emissionsvåglängd av 465 nm.

7. Rå Cell Lysate Assayvid RT

  1. Efter skörd av cellerna från PAD4 en L tillväxt, återsuspendera cellerna i 10 ml av 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) och 1 mM ditiotreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0.
  2. Lysera cellerna via sonikering under 15 min vid 4 ° C. Centrifugera cellysatet vid 20.000 xg under 20 minuter vid 0 ° C. Koncentrera den klara supernatanten till halva volymen genom centrifugering vid 4000 rpm vid 4 ° C med användning 100k MW cut-off-centrifugrör.
  3. Från 10 mM ZRcoum lager, bereda en 250 iM lösning av ZRcoum i vatten. Detta 250 pM ZRcoum lösningen kommer att vara Lösning A.
  4. Bered en buffert av 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, och 2 mM TCEP (pH = 8,0). Detta kommer att vara lösning B.
  5. Väg upp Trypsin, kristallin (från bovin pankreas) och framställa en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Blanda lösningen tills klar och förvara vid -20 ° C. Detta kommer att vara Lösning C.
  6. Skaffa en svart 384-brunnar och designåt brunnar för kontroller (ingen cellysat) och testbrunnar (+ cellysat).
  7. Pipettera 100 | il av lösning B i alla brunnarna och pipettera 60 ul av cellysatet till testbrunnarna. Inkubera under 20 min vid RT.
  8. Pipettera 40 | il av lösning A i alla brunnarna och inkubera under 45 min vid RT.
  9. Pipettera 10 pl lösning C till alla brunnar. Inkubera vid RT i 10 min.
  10. Skaffa en fluorescens läsning på multimodal läsaren en excitationsvåglängd av 345 nm och emissionsvåglängden 465 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Inledningsvis visades att ZRcoum kan rapportera om aktiviteten av PAD4 i en 96-brunnar format. Brunnarna inkuberades med substratet ZRcoum och i närvaro / frånvaro av PAD4. Efter en inkubationsperiod av 45 minuter vid 37 ° C, fluorescensen mäts med en 340/40 - 475/15 nm filter (Figur 2A). Som väntat förblev fluorescensnivåerna lågt som fluoroforen inom ZRcoum (eller citrullinerad ZRcoum) kvar i det låsta läget. Vid tillsats av ett överskott av trypsin / EDTA till lösningen, fluoroforerna befriades från ZRcoum men förblev mestadels oförändrad i närvaro av PAD4. Tillsatsen av EDTA är avsett att bistå vid upphörandet av PAD4 reaktion på grund av dess förmåga att kelatbinda de väsentliga kalciumjoner. Från dessa data har en 5,2-faldig minskning i fluorescens utgång observerats i närvaro av PAD4. Därefter kompetatibility av den nyutvecklade analysen med high-throughput screening plattformar demonstrerades. Det var av primärt intresse att analysera fyra reaktionsvariabler som skulle vara mest fördelaktiga för screeningsändamål (1) den ytterligare miniatyrisering av analysvolym (2) möjligheten att utföra analysen vid RT (3) stabiliteten hos proteinet och buffertblandningen innan en analys och (4) den risk för störningar av organiska lösningsmedel / rengöringsmedel.

För medel- eller high-throughput screening insatser, är hög densitet hålsplattor som vanligen används i småmolekylära skärmar. Det bekräftades att den analys kan utföras nästan på samma sätt i en 384-brunnars platta i förhållande till en 96-brunnars platta (Figur 2B). I ytterligare bestämning av arbetsförhållandena för analysen i en hög genomströmning format, var det viktigt att undersöka om PAD4 aktivitet kan övervakas på en rimlig tidsram vid RT. Eftersom inte alla vätskehantering instrument haren temperaturregulator, kan det bli besvärligt och kostsamt att ha ett inkubationssteg vid förhöjd temperatur. Dessutom kan står för svängningar i temperaturen vara en orsak till avvikelse mellan plattor och körningar. För att bestämma effekten av lägre temperaturer för den analys som beskrivs här, var en liknande analys utfördes vid RT. Man fann att de signaler som var i stort sett oförändrad mellan 37 ° C och RT (fig 3). För att ytterligare optimera analysens prestanda genom att minimera den erforderliga inkubationstiden mellan PAD4 och substratet, var kinetiken för reaktionen analyseras. PAD4 aktivitet övervakades över tiden, både vid RT och 37 ° C. Som förväntat, verkar det som PAD4 är mer aktiv vid 37 ° C (i enlighet med mänsklig fysiologisk temperatur) med reaktions mestadels fullständig genom 20 min. Satisfyingly reaktionen inte påverkas starkt av den minskning av temperaturen ner till RT. Reaktionen fortskrider vid ungefär halva den hastighet som vidförhöjd temperatur och är i huvudsak klar 40-45 min efter initiering. Från tiden kursen analyseras var kinetiska konstanter beräknades och parametrarna (K M = 397 iM, k cat = 2,98 sek -1, k cat / k M = 7,400 sek -1 M -1) befanns likna andra PAD4 substrat. 31 Med kinetiken för reaktionen kännetecknad av, alla efterföljande analyser reducerades till en timme från början till mätpunkten.

Därefter tillsattes stabilitet PAD4 utvärderas när de löses i reaktionsbufferten under en förlängd tidsperiod. Realistiskt sett kommer high-throughput screening kräver reagens för att vara allmänt stabil under många timmar medan instrumentet att fylla skärmen. Om vissa reagens har en relativ hållbarhetstid minuter, kan det vara ganska dyrt och tidskrävande att avsluta skärmen för att förbereda nya reagenser. Beroende på analysbetingelserna, är det inteovanligt för vissa analyser är oförenlig med hög genomströmning screening av just denna anledning. Med denna idé i åtanke, var stabiliteten för PAD4 i buffert övervakades under flera timmar. Nästan ingen förlust i enzymatisk aktivitet observerades under hela tidsperioden, vilket sålunda indikerar att proteinet är stabil även efter att ha suttit vid RT över 15 timmar (Figur 4A). Därefter utvärderades det huruvida analysen körs under miniatyriserade förhållanden och vid RT skulle fortfarande lämpligt sätt reagera på närvaron av en PAD4. Vid inkubationen av den kända PAD4 inhibitor chloroamidine (CI-amidin), ledde till en fullständig restaurering av fluorescenssignalen i överensstämmelse med den fullständiga inhiberingen av PAD4 (Figur 4B). Slutligen var det också verifierats att närvaron av det organiska lösningsmedlet DMSO, som vanligen används i stamlösningar av små molekyler, upp till 3% som slutlig volym, inte interferera med analysen (data ej visade). På samma sätt, tillsats av 0,01% Triton X-100 resulterade i simnande fluorescens trender (data visas ej).

Efter att ha visat att analysen är tolerant mot en rad olika tillstånd som vanligtvis förekommer i små molekyler läkemedelsforskning, har en preliminär screening av 80 föreningar som bedrivs och en robust Z "värde på 0,71 identifierades. För att främja potentialen hos analysen, var selektiviteten för PAD4 / ZRcoum reaktion markeras genom att utföra reaktionen i råa hela cellysat. E. coli-celler innehållande GST-PAD4 expressionsvektor inducerades med IPTG, liknande det förfarande som används för isolering av GST-PAD4. Efter sönderdelning av cellmembranet via sonikering, var den cellulära debris separerades genom centrifugering till bildning av en klarnad cellysat. När PAD4 innehållande cellysat lämnades till samma analysförhållanden som det renade GST-PAD4 analys, fluorescenssignalen varie i samförstånd med närvaro av aktiva PAD4 i lösning ( > Figur 5). Cellysat innehåller ett antal biomakromolekyler vid höga koncentrationer som skulle kunna störa aktiviteten av PAD4, de fluorescerande egenskaper ZRcoum och trypsin steget. Upptäckten att analysen var funktionell i rå cellysat visar att det finns en hög selektivitet i reaktionen mellan PAD4 och ZRcoum. För att ytterligare visa att signalen minskning i närvaro av råa cell-lysat var specifik för närvaron av aktiv PAD4, effekten av Cl-amidin, en etablerad kovalent PAD4 inhibitor utvärderades. Tillsatsen av Cl-amidin ledde till ett återställande av den fluorescenssignal, i överensstämmelse med inaktiveringen av PAD4 (Figur 5). Tillsammans visades det analysen kan förenklas ytterligare genom att utnyttja råa cellysat för övervakning av PAD4 aktivitet.

2114 / 52114fig1highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 1. PAD4 och utformningen av dess fluorescens-baserad analys. (A) tecknad representation av de histon aggregaten som utgör den grundläggande enheten i en nukleosomen. PAD4 katalyserar citrullinering av en rad argininrester på histonproteiner. (B) ZRcoum överdrog med de infödda substrat (dold för tydlighets skull) av PAD4 (anslutningskoden 2DW5). (C) Representation av stegen i en typisk PAD4 analys. Citrullinering med PAD4 av substrat ZRcoum minskar dess känslighet för trypsin-medierad amidhydrolys och därmed orsaka en förändring i fluorescensnivåer. Klicka här för att se en större version av bilden.

Figur 2 Figur 2. PAD4 analys i 96-brunnars och 384-brunnars plattformat. Fluorescens mättes (excitation 345 nm / emission 465 nm) i både en 96-brunnsformat (A) och 384-brunnsformat (B) med de angivna villkoren (37 ° C). Tillsatsen av proteas trypsin leder till en stor ökning av fluorescensnivåer i brunnar utan PAD4 och praktiskt taget oförändrad för brunnar med PAD4. Data representeras som medelvärde + SD (n = 3). Klicka här för att se en större version av bilden.

Figur 3
Figur 3. Tidsförloppet analys av PAD4 assay. Fluorescens mättes (excitation 345 nm / emission 465 nm) periodiskt i en 96-brunnars plattformat över 70 minuter med proteinet inkuberas antingen vid 37° C (A) eller vid RT (B). Data representeras som medelvärde +/- SD (n = 3). Klicka här för att se en större version av bilden.

Figur 4
Figur 4. Protein stabilitet och hämning. (A) Aktiviteten av PAD4 mättes efter de angivna tidsintervallen. Som jämförelse, är fluorescensnivåerna visas i frånvaro av PAD4. Fluorescens nivåer visas före (röd) och efter (grön) tillsats av trypsin. (B) Införande av kända PAD4 hämmaren Cl-amidin (100 M) ledde till ett återställande av fluorescenssignalen i en 384-brunnar format vid RT. Fluorescens nivåer visas före (röd) och efter (grön) tillsats av trypsin. All data är represented som medelvärde +/- SD (n = 3). Klicka här för att se en större version av bilden.

Figur 5
Figur 5. Rå cellysat analysen. Analysen utfördes i frånvaro och närvaro av råa cell-lysat i en 384-brunnsplattformat vid RT. Fluorescens nivåer visas före (röd) och efter (grön) tillsats av trypsin. Cl-amidin (100 M) orsakade också en ökning av fluorescenssignal under dessa förhållanden. Alla data representeras som medelvärde +/- SD (n = 3). Klicka här för att se en större version av bilden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter http://www.perkinelmer.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
  2. Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
  3. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
  4. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
  5. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
  6. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  7. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
  8. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
  9. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
  10. Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
  11. Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
  12. Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
  13. Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
  14. Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
  15. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  16. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
  17. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
  18. Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
  19. Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
  20. Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).
  21. Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
  22. Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
  23. Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676 (2012).
  25. Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
  26. Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
  27. Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
  28. Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
  29. Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
  30. Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
  31. Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
  32. Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
  33. Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
  34. Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
  35. Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
  36. Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
  37. Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
  38. Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
  39. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).

Tags

Kemi PAD4 PADI4 citrullinering arginin posttranslationell modifiering HTS-analys fluorescens citrullin
Fluorescens-baserad övervakning av PAD4 aktivitet via en Pro-fluorescens Substrat Analog
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, … More

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter