Abstract
Lisina metilazione è una modificazione post-traduzione emergente ed è stato identificato sulle proteine diverse istone e non-istoni, dove svolge un ruolo cruciale nello sviluppo delle cellule e di molte malattie. Circa 5.000 siti di metilazione della lisina sono stati identificati su diverse proteine, che sono impostati da poche decine di metiltransferasi proteine lisina. Ciò suggerisce che ogni PKMT metila più proteine, ma fino ad ora solo uno o due substrati sono stati identificati per diversi di questi enzimi. Matrice peptide Per affrontare questo problema, abbiamo introdotto basato specificità di substrato analisi di PKMTs. Array Peptide sono strumenti potenti per caratterizzare la specificità della PKMTs causa metilazione di diversi substrati con diverse sequenze possono essere testati su un array. Abbiamo sintetizzato array di peptidi su membrane di cellulosa con un sintetizzatore Intavis SPOT e analizzato la specificità dei vari PKMTs. Sulla base dei risultati, per molti di questi enzimi, novel substrates potrebbero essere identificati. Ad esempio, per NSD1 impiegando matrici peptidi, abbiamo dimostrato che metila K44 di H4 invece del H4K20 riportato e in aggiunta H1.5K168 è il substrato altamente preferito sul H3K36 precedentemente noto. Quindi, gli array di peptidi sono strumenti potenti per caratterizzare biochimicamente le PKMTs.
Introduction
Negli ultimi due decenni, diverse segnalazioni hanno dimostrato l'importanza delle modificazioni post-traduzionali (PTM) a sviluppo cellulare e diverse malattie come il cancro, ma di recente la proteina lisina metilazione è emerso come un altro importante PTM. Mentre inizialmente metilazione dell'istone lisina è risultato essere un segno essenziale della cromatina, il lavoro in seguito ha anche mostrato lisina metilazione di diverse proteine non istoniche 1-4. Il trasferimento sequenziale dei gruppi metilici da S-adenosil-L-metionina al gruppo ε-amino di residui di lisina è catalizzata da una famiglia di enzimi chiamati proteina lisina metiltransferasi (PKMTs) che contiene oltre 60 proteine nel genoma umano. PKMTs sono stati inizialmente scoperti come istoni modificando enzimi che metilato specifico residuo di lisina, ma i rapporti successivi hanno dimostrato che potrebbero anche metilare proteine non istoniche 5. Fino ad ora, circa 5.000 siti di metilazione lisina sono stati identificati diversi proteine 6
Array Peptide sono ampiamente utilizzati gli strumenti per l'analisi biochimica di anticorpi, peptidi enzimi che modificano e mappatura dei siti di interazione proteina-proteina (antigene-anticorpo, recettore-ligando) 7-9. Sono necessarie diverse centinaia di peptidi per such applicazioni. Sono disponibili diversi metodi per la sintesi di peptidi, tra i quali peptide di sintesi sulla resina è molto comunemente usato, ma ha limiti in velocità ed è relativamente costoso. Questi problemi sono stati risolti con l'introduzione del metodo di sintesi SPOT di Frank e colleghi 10. Il metodo di sintesi SPOT consente sintesi di diverse centinaia di peptidi in parallelo e in media è poco costoso rispetto alla sintesi resina. I peptidi sintetizzati su membrana di cellulosa possono essere usate direttamente per varie applicazioni o peptidi possono essere spaccati dalla membrana e utilizzato come peptidi liberi per saggi in soluzione o preparare microarray peptide 10-13.
Sintesi SPOT è una variante della sintesi in fase solida del peptide, che utilizza una membrana di cellulosa come un supporto solido e impiega il Fmoc-chimica standard di 10-13. Pertanto, la sintesi di catene peptidiche inizia al termine C-terminale e procede versol'estremità N-terminale in contrasto con la sintesi biologica in ribosomi. Membrane di cellulosa sono funzionalizzati per il fissaggio del primo acidi ammino attivato (Fig. 1). Il metodo si basa sulla SPOT consegna sequenziale di aminoacidi attivati in una goccia di solvente a macchie definite sulla membrana utilizzando un sistema di pipettaggio automatizzato. La gocciolina di liquido viene erogato sulla membrana porosa dove forma un punto bagnato circolare, che poi agisce come un reattore aperto per le reazioni chimiche di sintesi peptidica. La dimensione del punto è determinata dal volume erogato e la capacità di assorbimento della membrana, multipli di tali punti sono disposti come array. La scala della sintesi correla con la dimensione del punto e la capacità di carico della membrana. La distanza tra i punti e la densità degli array sono gestiti variando le dimensioni del punto. Membrana Cellulosa ha diversi vantaggi come fase solida in sintesi peptidica, è poco costoso, tollerante chemicals utilizzati nella sintesi di peptidi, stabili in soluzioni acquose e facili da maneggiare. Inoltre, la sua natura idrofila rende adatto per diversi sistemi di dosaggio biologici. SPOT sintesi può essere effettuata manualmente o automatizzato (per 1000s di peptidi) a seconda del numero di peptidi. Un sintetizzatore SPOT completamente automatizzata da Intavis (Köln, Germania) è usato per le nostre applicazioni. Permette sintesi di peptidi in quantità diverse e di diversa lunghezza. Peptidi lineari sono regolarmente sintetizzati con lunghezza acido 15 a 20 amminoacidi, peptidi in aggiunta fino a 42 aminoacidi possono anche essere preparati mediante graduale sintesi 14,15. Tuttavia, aumentando il numero di aminoacidi porta a riduzioni dei rendimenti complessivi di accoppiamento, che colpisce la qualità dei peptidi. A causa della bassa quantità di peptidi per punto, i prodotti sono spesso difficili da purificare e la qualità dei singoli peptidi non possono essere facilmente valutati. Pertanto, i risultati ottenuti da SPOT PEPTarray ide devono essere confermati sia con peptidi sintetizzati con metodi standard in scala più grande, che può essere purificato e analizzati secondo le norme in sintesi peptidica o di sintetizzare le proteine contenenti le sequenze peptidiche desiderati. Tuttavia, abbiamo trovato la sintesi SPOT per essere altamente affidabili e risultati generalmente essere riproducibile. Sintesi SPOT non è limitato a proteinogenici aminoacidi, acidi disponibili in commercio diversi amminoacidi modificati anche possono essere utilizzati per la sintesi, permettendo peptidi da modificare prima e dopo il clivaggio finale del gruppo di protezione della catena laterale e, inoltre, permette anche di incorporazione fosforilata, denaturato o acetilate amminoacidi 11.
Librerie peptidiche immobilizzate sintetizzati con il metodo SPOT può essere utilizzato direttamente per molti saggi biologici e biochimici. Abbiamo impiegato array di peptidi comprendenti 300-400 peptidi di indagare la specificità di substrato di PKMTs. Per modifi enzimaticacazione, gli array peptidici vengono incubati con il rispettivo PKMT ed etichettato [metil- 3 H] -AdoMet in un tampone appropriato. La metilazione del rispettivo substrato viene analizzato seguendo il trasferimento enzimatica dei gruppi metilici marcati radioattivamente dal AdoMet al substrato peptidico tramite autoradiografia (Fig. 3). Con questo procedimento, gli array peptidici permettono lo studio della metilazione di differenti substrati peptidici contemporaneamente. Un importante vantaggio di questo metodo è che tutti i peptidi sono metilate in concorrenza, tale che, durante la fase lineare della cinetica metilazione, la relativa metilazione di ciascun peptide è proporzionale alla costante di velocità catalitica divisa per la costante di dissociazione (k cat / K D) dell'enzima per il rispettivo substrato peptidico. Pertanto, la quantità di radioattività incorporata in ciascun punto è direttamente correlata con l'attività enzimatica verso il particolare peptide. Utilizzando ilrisultati di un esperimento metilazione matrice peptide, il profilo specificità del PKMT possono essere definite e basate su possono essere legati all'ottenimento questo romanzo substrati. Array peptidici consentono la rapida ed economica validazione efficiente della metilazione di nuovi substrati a livello peptide. Per questo, gli array sono preparati che contengono i predetti nuovi substrati con peptidi modificati contenenti un Ala anziché Lys ai siti bersaglio nonché peptidi di controllo positivi e negativi. Infine, i nuovi supporti possono essere preparati come proteine insieme mutanti, in cui l'obiettivo Lys è alterata per Ala e la metilazione può essere confermato a livello proteico. A seconda dei risultati, questo è seguito da studi biologici indirizzamento potenziali ruoli della metilazione dei substrati proteici appena descritte.
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Protocol
1. Preparazione del Peptide Array
- Programmazione del Peptide Sequenze
- Progettare sequenze peptidiche per la sintesi utilizzando il software MultiPep Spotter. Inserire le sequenze peptidiche in codici alfabetici singoli.
Peptide 1: TARKSTGGKA - Generare librerie alanina o arginina camminare con un comando specifico (.Sostituire, A) per lo screening importanti aminoacidi necessari per il riconoscimento di un substrato definito. Ad esempio, nel seguente esempio la prima riga è la sequenza di tipo selvatico e dalla seconda linea di ciascun amminoacido in un peptide viene modificato a sequenzialmente alanina.
sostituire, A
TARKSTG
A -ARKSTG
T- A -RKSTG
TA A -KSTG
TARGET A -STG
TARK- A -TG
TARKS- A -G
TARKST- A - Utilizzare comandi simili (.Sostituire R,.sostituire N etc.) come descritto in 1.1.2 con tutti i residui amminoacidici naturalmente disponibili (eventualmente omettendo cisteina, metionina e triptofano, perché questi residui sono soggetti ad ossidazione e la resa di sintesi volte inferiore) per sintetizzare una matrice peptide per determinare il consenso substrato motivo di sequenza per un enzima.
NOTA: Come mostrato in Figura 4A, l'asse orizzontale rappresenta la data sequenza peptidica e l'asse verticale rappresenta gli aminoacidi che sono selezionati per il comando. Simile alla sequenza mostrata nella 1.1.2, A sull'asse verticale significa che un sequenzialmente Ala sostituisce ogni posizione della sequenza indicata nella prima riga in Fig. 4A. Allo stesso modo sequenziale arginina sostituisce ciascun amminoacido nella seconda riga e così via con altri amminoacidi. Librerie complete matrice peptide sono sintetizzati sostituendo sistematicamente ciascun residuo nella sequenza substrato peptidico fornito con ciascuno di the altri residui amminoacidici naturalmente disponibili, ciò aiuta a comprendere l'influenza di ciascun residuo in ciascuna posizione della sequenza proposta. - In alternativa, la metilazione di substrati peptidici noti o previsti può essere facilmente verificato sintetizzare librerie peptidiche con i peptidi target del PKMT insieme con controlli metilazione positivi e negativi (ossia peptidi notoriamente metilato o noti non essere metilato). Sintetizzare peptidi scambiando il presunto obiettivo di lisina di alanina per confermare metilazione della lisina destinazione come illustrato di seguito per la programmazione manuale.
Tipo selvaggio peptide: STGG K PRQFL
Peptide Mutant: STGG A PRQFL
NOTA: Il software ha anche script inerenti a creare varie biblioteche, come la mappatura epitopo con uno spostamento fotogramma desiderato della sequenza per mappare importanti aminoacidi necessari per un'interazione.
- Progettare sequenze peptidiche per la sintesi utilizzando il software MultiPep Spotter. Inserire le sequenze peptidiche in codici alfabetici singoli.
- Preparazione della membrana, Aminoacidi und Reagenti
- Pre-gonfiano la membrana SPOT in DMF (N, N -Dimethylformamide) per 10 minuti e poi posizionare la membrana bagnata sul telaio SPOT sintetizzatore, senza bolle d'aria o grinze.
- Lavare la membrana tre volte con 100% di etanolo. Essiccare le membrane completamente per almeno 10 minuti prima di iniziare il programma di sintesi.
- In parallelo, appena preparare 0,5 M concentrazioni lavorativi amminoacidi Fmoc-protetti commercialmente disponibili sciogliendoli in NMP e preparare l'attivatore e la base come descritto nella Tabella 1.
- Assicurarsi che tutti i contenitori della soluzione dei rifiuti del sintetizzatore SPOT sono stati svuotati e riempire i serbatoi di solvente con DMF, etanolo e piperidina.
NOTA: questo punto la macchina è pronta per la sintesi.
- Spotting del primo amminoacido
- Per generare il legame ammidico con il gruppo ammino libero sulla membrana, attivare il gruppo carbossilico dell'amminoacido entrata dall'inserzionistading l'attivatore (N, N '-Diisopropylcarbodiimide) e soluzione di base (Ethyl cianoacetato idrossiimmino) al derivato aminoacidico.
- Spot i volumi desiderati di aminoacidi attivati sulla membrana funzionalizzato Amino-PEG utilizzando il robot programmabile.
NOTA: In tal modo, il C-terminale della aminoacido è accoppiato al gruppo amminico della membrana. - Ripetere questa operazione tre volte per consentire un miglior accoppiamento del primo amminoacido attivato. Incubare la membrana per 20 minuti e poi lavare con DMF per rimuovere aminoacidi disaccoppiati.
- Blocco di spazi liberi in zone non-punto
NOTA: Dopo l'accoppiamento del primo amminoacido C-terminale di tutti i peptidi al gruppo amminico della membrana, i gruppi amminici tra le macchie e anche alcuni dei gruppi amminici nelle zone piatte non formano legami con gli aminoacidi.- Bloccare questi gruppi amminici liberi incubando con la soluzione tappatura (20% anidride acetica in DMF)per 5 min.
NOTA: Questo evita l'accoppiamento di aminoacidi nelle ulteriori cicli con la membrana anziché crescente catena peptidica.
- Bloccare questi gruppi amminici liberi incubando con la soluzione tappatura (20% anidride acetica in DMF)per 5 min.
- Rimozione di Fmoc Group
- Dopo il blocco, lavare la membrana con DMF 4 volte e poi incubare con 20% piperidina in DMF per 20 minuti per rimuovere il gruppo di protezione Fmoc.
NOTA: Questo passaggio porta alla rimozione dei gruppi Fmoc-protezione amino e si chiama deprotezione. - Successivamente, lavare la membrana due volte con DMF e due volte con etanolo e lasciare asciugare.
NOTA: Ora la membrana è pronto per l'accoppiamento dei prossimi amminoacidi.
- Dopo il blocco, lavare la membrana con DMF 4 volte e poi incubare con 20% piperidina in DMF per 20 minuti per rimuovere il gruppo di protezione Fmoc.
- Allungamento catena
NOTA: Aggiunta di ciascun amminoacido è chiamato ciclo. A parte l'accoppiamento di primo amminoacido, il ciclo inizia con la deprotezione del gruppo Fmoc dell'amminoacido accoppiato ed è seguito dall'accoppiamento del gruppo carbossilico attivato di un aminoacido in entrata al gruppo amminico della crescente pepchain marea.- Ripetere le fasi 1.3 e 1.5 fino ad ottenere la lunghezza desiderata peptide.
- Colorazione
NOTA: Dopo il ciclo finale, gli array di peptidi sono macchiate di blu di bromofenolo per confermare la riuscita sintesi di peptidi. Blu di bromofenolo lega con i gruppi amminici liberi dei peptidi. Macchie Peptide mostrano colore azzurro dopo la colorazione ma l'intensità delle macchie varia a seconda della sequenza peptidica. Questo permette colorazione conferma la completa rimozione di piperidina, perché in presenza di piperidina blu di bromofenolo non macchia i peptidi. Inoltre, questo aiuta anche per segnare le matrici peptide per un ulteriore utilizzo.- Dopo la deprotezione del gruppo Fmoc nell'ultimo ciclo di sintesi, lavare la membrana con DMF e 100% etanolo. Quindi, trattare la membrana con blu di bromofenolo (0,02% blu di bromofenolo in DMF) per un minimo di 5 min finché non diventa completamente blu.
- Successivamente, lavare la membrana con DMF e ethAnol seguito da essiccazione per 10 min. Ora togliere la membrana dal sintetizzatore ed eseguire deprotezione catena laterale (sezione 1.8) manualmente. Se necessario, fotografare la membrana per documentare i risultati della sintesi peptidica (Fig. 2).
- Deprotezione Side Chain
- Trattare le membrane con 20 a 25 ml di miscela di deprotezione delle catene laterali composto da 95% di acido trifluoroacetico (TFA) per scindere i gruppi di protezione della catena laterale e reagenti scavenger (2,5% di acqua e 2,5% triisopropylsilane) per proteggere le catene laterali degli amminoacidi modifica durante questa fase. Prendete un volume sufficiente di miscela deprotezione per garantire che essa ricopre la membrana completamente nel contenitore resistente chimico ben chiuso e incubare per 1 a 2 ore agitando delicatamente.
- Lavare la membrana sei volte con 20-25 ml di DCM (diclorometano) per 2 min ciascuno e infine due volte con 100% di etanolo e asciugare in un essiccatore notte.
NOTA: Orala membrana può essere utilizzato per esperimenti. Uno schema di sintesi matrice peptide è fornito in Figura 1.
2. proteine espressione e purificazione
- Proteina espressione di PKMTs come GST Fusions
- Usando tecniche standard, clonare il gene che codifica per l'intera lunghezza o PKMT suo dominio catalitico in un vettore di espressione batterica (come pGEX-6p2) per esprimerlo come proteina GST-fusion.
- Trasferire il vettore con il PKMT desiderata inserire nel BL21 o BL21 codone più E. coli secondo il metodo shock termico o qualsiasi altro metodo.
- Preparare una pre-coltura con 30 ml di Luria-Bertani supporti (LB) del giorno di espressione e incubare a 37 ° C per 7 a 8 ore con agitazione continua.
- Poi, il trasferimento di 10 ml di pre-cultura in un 2 L grandi palloni sconcertati contenenti 1 l di mezzi LB e incubare a 37 ° C in incubatore con agitazione continua fino alla portata colturaes una densità ottica a 600 nm definito.
NOTA: Anche se questo può essere ottimizzato per ogni proteina, abbiamo regolarmente inducono ad una 600nm OD di circa 0,8. La temperatura di induzione deve essere ottimizzato per ogni proteina individualmente, alcune proteine mostrano buona espressione a 22 ° C e alcuni a temperature più elevate. - Spostare le cellule alla temperatura di induzione per 15 min, poi indurre con 1 mM di isopropil-beta-D-thiogalactopyranoside e permettere la cultura di crescere per 10-12 ore a temperatura induzione.
- Successivamente raccogliere le cellule per centrifugazione a 5.000 xg per 15 min e infine lavare il pellet con 30 ml di tampone STE (10 mM Tris pH 8,0, NaCl 100 mM e 0,1 mM EDTA) e conservare a -20 ° C per un ulteriore utilizzo.
- Protein Purification
- Scongelare il pellet e risospendere in 30 ml di tampone di sonicazione (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT e 5% glicerolo) e disturbare per sonicazione.
NOTA: Questo buffer needs per essere ottimizzate per ogni proteina alla fine. - Centrifugare il lisato cellulare a 22.000 xg per 1 ora e, poi raccogliere il surnatante e passare attraverso una colonna contenente 600 ml di glutatione resina Sepharose 4B.
- Lavare la colonna con 50 ml di tampone di sonicazione e successiva con 100 ml di tampone di sali (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 500 mM, 1 mM DTT e 5% glicerolo) per rimuovere le proteine legate aspecifico. Eluire la proteina legata con 5 ml di tampone di sale contenente glutatione mm 40.
- Dializzare la proteina eluita in 2 L di tampone di dialisi con bassa glicerolo (20 mM Tris pH 7,4, KCl 100 mM, 0,5 mM DTT e il 10% glicerolo) per 2 ore e poi in 20 mM Tris pH 7,4, KCl 100 mM, 0,5 mM DTT e il 70% glicerolo per 8 ore o durante la notte. Assicurarsi che tutti i buffer di purificazione sono a 4 ° C ed eseguire la purificazione della proteina nella cella per evitare denaturazione proteica.
- Scongelare il pellet e risospendere in 30 ml di tampone di sonicazione (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT e 5% glicerolo) e disturbare per sonicazione.
3. Peptide Array metilazione
- Pre-incubation di Peptide Array
- Eseguire peptide matrice metilazione o in una scatola di dimensioni appropriate o in un sacchetto di plastica per evitare lo spreco di enzima e costoso marcato radioattivamente AdoMet. Pre-incubare la membrana peptide array in sacchetto di plastica sigillato contenente il rispettivo buffer di metilazione senza enzima ed etichettato [metil-3H] -AdoMet per 10 min. Il volume di tampone dipende dalla dimensione della matrice, per esempio, utilizzare 8 ml di tampone di metilazione per una matrice profilo completo peptide specificità. Ottimizzare la quantità e la concentrazione del AdoMet per ciascun enzima.
- La metilazione del Peptide Array
- Eliminare il buffer di pre-incubazione e incubare la membrana in 8 ml di tampone metilazione contenente il rispettivo PKMT ed etichettato [metil-3H] -AdoMet per 1 a 2 ore.
NOTA: La quantità di enzima necessario per una reazione di metilazione dipende dall'attività di PKMT specifica, iniziamo nostri esperimenti di screening tipicamente con 50 nM fin enzimaticiconcentrazione al.
- Eliminare il buffer di pre-incubazione e incubare la membrana in 8 ml di tampone metilazione contenente il rispettivo PKMT ed etichettato [metil-3H] -AdoMet per 1 a 2 ore.
- Lavaggio delle Peptide Array
- Successivamente eliminare il buffer metilazione in un contenitore per rifiuti radioattivi e lavare gli array peptidici per 5 volte con 20 ml di tampone contenente 100 mM di bicarbonato di ammonio e 1% SDS per 5 minuti per rimuovere la proteina legata. Eliminare la soluzione di lavaggio in un contenitore per rifiuti radioattivi.
- Rilevamento del segnale radioattivo
- Dopo i lavaggi incubare la membrana per 5 minuti in 10 ml di soluzione di Amplify (NAMP100V).
- Poi, scartare la soluzione Amplify nel contenitore dei rifiuti radioattivi per solventi organici, sigillare la matrice peptide in un sacchetto di plastica e metterlo in una cassetta autoradiografia.
- Posizionare il film autoradiografia sull'array peptide in camera oscura. Chiudere con cura la cassetta ed esporlo a -80 ° C per il tempo necessario. Poi, sviluppare la pellicola per analizzare i risultati. Catturare la coppia immagine di volte con diversi exposition volte per evitare la saturazione di substrati peptidici fortemente metilati.
4. Elaborazione dati e analisi
- Analisi densitometrica di Spot intensità
- Scansione il film in uno scanner tradizionale e analizzare le intensità saltuari da densitometria. Fate questo utilizzando ImageJ (che è freeware) o un programma commerciale.
NOTA BENE: Usiamo software Phoretix per questo compito.
- Scansione il film in uno scanner tradizionale e analizzare le intensità saltuari da densitometria. Fate questo utilizzando ImageJ (che è freeware) o un programma commerciale.
- Normalizzazione e della media dei risultati dei vari Membrane
- Condurre esperimenti metilazione matrice peptide almeno in triplicato. Normalizzare le intensità scanditi per ogni esperimento da uno sfondo sottrazione e impostare l'attività in un substrato di riferimento 1.0. Calcolare la media dei dati per i singoli punti e segnalarli come valori medi e le deviazioni standard.
- Analisi dei dati e display
- Tracciare i dati in 2D utilizzando uno schema in scala di grigi oa colori per indicare la relativa attività. Fate questo with Excel o SigmaPlot come mostrato qui. Inoltre, preparare un grafico della distribuzione delle deviazioni standard degli esperimenti ripetuti per analizzare la qualità dei dati.
- Per confrontare e visualizzare l'accuratezza del riconoscimento di ciascun residuo nel peptide substrato quantitativamente, calcolare la relativa preferenza del PKMT per ciascun amminoacido i alla posizione x di un fattore discriminazione D 16,17:
D X; i = <V j ≠ i> / V i - 1
Dove v i è il tasso di metilazione della variante peptide portando aminoacido i alla posizione x e <v j ≠ i> è il tasso medio di metilazione di tutti i 19 peptidi che trasportano un altro amminoacido j ≠ i alla posizione x (compreso il selvaggio tipo sequenza).
NOTA: Il fattore di discriminazione definito da questa dipende dal livello di sfondo. Se un solo residuo è accettata in una certa posizione con uno sfondo del 3%, una discriminazionesi ottiene fattore 32.3. Nessuna preferenza in una posizione traduce in un fattore di discriminazione di 0.
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Representative Results
Array peptidici sono stati utilizzati con successo per caratterizzare biochimicamente la specificità di PKMTs, e sono stati identificati diversi romanzo istone e non istoni substrati di PKMT da questo approccio 5,16-19. Definire lo spettro substrato corretta di un PKMT (o qualsiasi enzima) è un passo essenziale verso la comprensione del meccanismo molecolare e funzioni cellulari.
Come esempio di applicazione del metodo di matrice metilazione peptide SPOT, descriviamo i risultati dell'analisi specificità del NSD1 PKMT 19. Precedente al nostro lavoro, questo enzima è stato descritto al metilato diversi substrati, tra cui l'istone H3 a K36 e istone H4 a K20, ma anche la NF-kB di trascrizione famiglia fattore p65 in K218 e K221. Fig. 4A mostra un esempio di una reazione di metilazione di una matrice peptide con NSD1. Per questo esperimento, una vasta gamma peptide basata sulla H3 (31-49) sequenza è stata sintetizzata che contiene tutti i possibilialterazioni singoli aminoacidi della sequenza originale per testare il significato di ciascun amminoacido per l'interazione NSD1 e metilazione. In totale 380 peptidi sono stati sintetizzati (20 possibili aminoacidi x 18 residui più una sequenza H3 originale in ogni riga). L'asse orizzontale rappresenta la sequenza del peptide e nella direzione verticale è indicato l'aminoacido che viene modificata nel corrispondente peptide. Ad esempio, il punto alla linea 17, colonna 4 contiene una treonina alla terza posizione invece di glicina che è presente nella sequenza wild type (Fig. 4A). In tal modo, mutazioni puntiformi sono generati per testare la preferenza di NSD1 per ciascun amminoacido nativa in ogni posizione nel substrato peptidico. La metilazione con NSD1 dimostrato che agisce specificamente sul H3K36 ed ha preferenze su entrambi i lati della lisina destinazione 34-38.
Figura 4B rappresenta il consolidamento della matrice metilazione tre peptideesperimenti con NSD1. Le informazioni quantitative stata acquisita dai singoli array peptidici ei risultati sono stati normalizzati e media come descritto sopra. Le deviazioni standard dei singoli medie mostrano che i dati sono altamente riproducibili. Complessivamente circa l'85% dei peptidi mostra DS inferiori al 20% e oltre il 97% dei substrati peptidici dimostrato DS più piccolo del 30% (Fig. 4C). Inoltre, abbiamo anche calcolato il fattore di discriminazione per determinare con precisione il contributo di ciascun amminoacido nelle posizioni testati. Come descritto fornisce la descrizione quantitativa del peptide lettura e la preferenza di aminoacidi nella posizione specifica (Fig. 5A). I nostri dati mostrano che NSD1 preferisce residui aromatici nella posizione -2 (considerando K36 come posizione 0) (F> Y> G); residui idrofobici a -1 (I> L> V); residui basici a +1 (R> QKNM), dove non può tollerare residui idrofobici o aromatici; e hydresidui rophobic a +2 (V> IA> P). In altri siti (come -3, +3, +6 o), NSD1 preferisce alcuni aminoacidi, ma è stato rilevato nessun forte residuo di lettura specifico.
Sulla base di questo profilo, i potenziali substrati peptidici nuovi possono essere trovate ricerche nelle banche dati come l'utilizzo di Scansite 20 (Fig. 5B). Questi peptidi sono stati preparati su un array SPOT compresi i controlli positivi e negativi e incubate con NSD1 e radioattivo etichettati AdoMet per identificare il sottoinsieme di essi che sono metilato a livello peptide (Fig. 5C). Come seguire up, array peptidici possono essere preparati che include varianti peptide, in cui la lisina bersaglio è sostituito da alanina, per confermare che la metilazione avviene al sito previsto. Quindi, le proteine o sottodomini di essi contenenti lisina bersaglio di destinazione possono essere prodotti ricombinanti e la metilazione anche testati a livello proteico. Infine, a seconda dei risultati, follow up esperimenti posso nvestigate se la metilazione avviene anche nelle cellule e che ruolo biologico ha.
Figura 1:. Schema di sintesi peptidica mediante il metodo SPOT su membrana di cellulosa Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Esempio di una matrice peptide colorato con blu di bromofenolo per confermare la sintesi di peptidi Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3: Schema dell'esperimento peptide matrice metilazione; array peptidi sono stati metilato dalle incubazione con PKMT ed etichettati [metil 3 H] -AdoMet in un buffer adeguato. In seguito la radioattività trasferito a ogni spot viene rilevato mediante autoradiografia. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esempio risultati ottenuti con il NSD1 PKMT A) Esempio di una matrice peptide substrato specificità per NSD1 utilizzando il H3 (31-49) la sequenza come modello.. L'asse orizzontale rappresenta la sequenza H3 e l'asse verticale rappresenta gli amminoacidi da cui la riga corrispondente è mutato. La prima riga contiene peptidi consequenza originale. B) Il consolidamento dei risultati di 3 esperimenti gamma peptide metilazione indipendenti con NSD1, i dati sono stati in media i risultati di tutti e tre gli esperimenti dopo la normalizzazione. C) Distribuzione di errori standard per i dati medi di metilazione come da tabella B. Tratto da Kudithipudi et al. (2014) con alcune modifiche 19. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Scoperta di substrati PKMT nuovi A) fattori di discriminazione di NSD1 per il riconoscimento di aminoacidi alle posizioni accanto alla lisina destinazione (K36 nell'esperimento mostrati qui). I dati mostrano che NSD1 preferisce residui aromatici a -2 posizione (considerando K36 come posizione 0). Residui idrofobici sono iscritti al -1 e +2 posizioni, anche se con differenze distintive in dettaglio. Al sito +1 sono preferiti residui basici e ammidi. In altri siti alcune preferenze deboli, ma non forte residuo di lettura specifico è stato rilevato. B) Schermata di una ricerca esempio a Scansite, utilizzando il profilo specificità determinato per NSD1. C) matrice Peptide SPOT contenente diversi romanzo previsto NSD1 substrati insieme positivo (H3K36 ) e controlli negativi (H3K36A). Alcune delle basa nuovi bersagli sono stati fortemente metilata (alcuni di loro annotato), in altri casi le previsioni non sono state verificate. Panel A e C viene riprodotto da Kudithipudi et al. (2014) con alcune modifiche 19. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Base | 1 M Oxyma Pure in NMP -> 2,13 g Oxyma Pure in 15 ml NMP |
| Activator | 2.4 ml N, N '-Diisopropylcarbodiimide in 15 ml NMP |
| Tappatura Miscela | 20% anidride acetica in DMF -> 6 ml di anidride acetica in 30 ml DMF |
| Fmoc Deprotezione | 20% Piperidina in DMF -> 200 ml a 1.000 ml DMF |
| Sidechain Deprotezione | 900 ml Triisopropylsilane + 600 ml DDH 2 O in 30 ml TFA |
| Colorazione | 0,02% blu di bromofenolo in DMF |
Tabella 1: miscele chimiche e la loro composizione utilizzata nel protocollo.
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Discussion
Sintesi SPOT come qui descritto è un potente metodo per mappare i siti di interazione proteina-proteina e indagare il riconoscimento del substrato di peptide modificare enzimi. Tuttavia, la sintesi SPOT ha ancora alcuni inconvenienti, in quanto anche se i peptidi sintetizzati dal metodo SPOT sono segnalati per avere più del 90% di purezza 21 è difficile confermare in ciascun caso. Pertanto, i risultati devono essere riprodotte con altri metodi, per esempio utilizzando domini di proteine o con peptidi purificati sintetizzati con metodi standard. Inoltre, l'altro grave inconveniente di array SPOT è che la maggior tempo non possono essere riutilizzati per effettuare diverse analisi con un array.
Per aumentare l'efficienza della sintesi di aminoacidi di scarsa stabilità, come l'arginina protetta, è importante renderli fresco per ogni 5 cicli. Nelle reazioni enzimatiche o studi di legame proteico è spesso osservato che la periferia della macchia peptide ha more intensità di segnale rispetto al centro ("effetto spot ring"). Questo effetto può essere dovuto alla elevata densità di peptidi nella parte centrale dello spot e quindi può essere risolto downscaling la sintesi peptidica 22. Per ulteriori risoluzione dei problemi del peptide sintesi del manuale della macchina e società di servizi dovrebbe essere consultato. Se non si osserva metilazione, peptidi di controllo positivo (cioè peptidi notoriamente metilato dall'enzima in esame) devono essere aggiunti alla membrana.
Alternate a array SPOT, ad alta densità di peptide microarray 23 sono disponibili, ma sono più costosi e richiedono attrezzature speciali per l'uso. Inoltre la quantità di peptide per spot è più piccolo, che richiede procedure di lettura più sensibili. Matrici proteiche sono disponibili per studiare queste funzioni 24,25, ma sono più difficili da preparare perché ogni singola proteina deve essere espressa e purificata eripiegamento delle proteine sulla matrice deve essere mantenuto. Un ulteriore vantaggio di array peptidici è possibile introduzione di post-traduzionali durante la sintesi e la facilità di test mutazionale dei ruoli dei singoli residui amminoacidici.
È un punto di partenza essenziale per questo protocollo, di avere almeno un peptide identificato, che è metilato dall'enzima in esame. Condizioni di metilazione e buffer devono essere ottimizzate, nonché la concentrazione della metiltransferasi. Corsi a tempo esemplari di metilazione devono essere determinate per evitare completa metilazione dei migliori substrato, che causerà la perdita di gamma dinamica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
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