Abstract
Lysin metylering är en framväxande modifiering efter translation och det har identifierats på flera histon och icke-histonproteiner, där den spelar avgörande roller i cellutveckling och många sjukdomar. Cirka 5.000 lysin metylering platser identifierades på olika proteiner, som fastställs av några tiotals protein lysin metyltransferaser. Detta tyder på att varje PKMT metylerar flera proteiner, men hittills bara en eller två substrat har identifierats för flera av dessa enzymer. För att närma sig detta problem, har vi infört peptid array baserad substratspecificitet analyser av PKMTs. Peptid arrayer är kraftfulla verktyg för att karakterisera specificitet PKMTs eftersom metylering av flera substrat med olika sekvenser kan testas på en matris. Vi syntetiserade peptid arrayer på cellulosa membran med hjälp av en Intavis SPOT synt och analyserat specificitet olika PKMTs. Baserat på resultaten, för flera av dessa enzymer, roman substrates kunde identifieras. Till exempel för NSD1 genom användning peptid arrayer, visade vi att det metylerar K44 för H4-stället för den rapporterade H4K20 och dessutom H1.5K168 är det starkt föredraget substrat över den tidigare kända H3K36. Därför peptid arrayer är kraftfulla verktyg för att biokemiskt karakterisera PKMTs.
Introduction
Under de senaste två decennierna, flera rapporter visat på betydelsen av post-translationella modifieringar (PTM) i cellulär utveckling och flera sjukdomar som cancer, men nyligen protein lysin metylering har vuxit fram som en annan viktig PTM. Medan ursprungligen histon lysin metylering befanns vara en viktig kromatin märke, senare arbete visade också lysin metylering av flera icke-histonproteiner 1-4. Den sekventiella överföring av metylgrupper från S-adenosyl-L-metionin till ε-aminogruppen i lysinresterna katalyseras av en familj av enzymer som kallas protein Lysin metyltransferaser (PKMTs) som innehåller över 60 proteiner i det mänskliga genomet. PKMTs ursprungligen upptäcktes histon modifierande enzymer som metilat specifika lysinrest men senare rapporter visat att de också kunde metylera icke-histonproteiner 5. Hittills har cirka 5.000 lysin metylering platser identifierats på olika proteiner 6
Peptid arrayer används allmänt verktyg för biokemisk analys av antikroppar, peptid modifierande enzymer och kartläggning av protein-proteininteraktionsställen (antikropp-antigen, receptor-ligand) 7-9. Flera hundra peptider behövs för such applikationer. Olika metoder finns tillgängliga för peptidsyntes, bland dem peptidsyntes på harts är mycket ofta används, men har sina begränsningar i genomströmning och det är relativt dyrt. Dessa frågor löstes med införandet av SPOT syntesmetod av Frank och kollegor 10. SPOT syntesmetoden tillåter syntes av flera hundra peptider parallellt och i genomsnitt är det billigt jämfört med hartssyntes. Peptiderna syntetiserade på cellulosamembran kan användas antingen direkt för olika tillämpningar eller peptider kan klyvas från membranet och användas som fria peptider i lösningsanalyser eller för att framställa peptid microarrays 10-13.
SPOT-syntes är en variant av den i fast fas peptidsyntes, som använder ett cellulosamembran som en fast bärare och sysselsätter standard Fmoc-kemi 10-13. Följaktligen, vid syntes av peptidkedjorna börjar vid den C-terminala änden och fortsätter i riktning motden N-terminala änden i motsats till den biologiska syntesen i ribosomer. Cellulosa membran funktion för att fästa den första aktiverade aminosyror (fig. 1). SPOT-metoden är baserad på den sekventiella leveransen av aktiverade aminosyror i en droppe av lösningsmedel till definierade fläckar på membranet med användning av ett automatiserat pipetteringssystem. Droppen av vätska avges på det porösa membranet där det bildar en cirkulär våt fläck, som senare fungerar som en öppen reaktor för de kemiska reaktionerna i peptidsyntes. Punktstorleken bestäms av den volym som dispenseras samt absorptionsförmåga av membranet, är multiplar av sådana fläckar anordnade som matriser. Omfattningen av syntesen korrelerar med fläckstorlek och lastkapacitet av membranet. Avståndet mellan fläckarna och tätheten av arrayer hanteras genom att variera punktstorlekar. Cellulosamembran har flera fördelar som fast fas inom peptidsyntes, är det billigt, tolerant mot Chemicaals som används i peptidsyntes, stabila i vattenhaltiga lösningar och lätt att hantera. Dessutom gör den lämplig för flera biologiska testsystem dess hydrofila karaktär. SPOT-syntes kan utföras manuellt eller automatiserat (för 1000s av peptider), beroende på det erforderliga antalet peptider. En helautomatisk SPOT synt från Intavis (Köln, Tyskland) används för våra applikationer. Det tillåter syntes av peptider i olika mängder och av olika längd. Linjära peptider regelbundet syntetiseras med 15-20 aminosyralängd, i additions peptider av upp till 42 aminosyror kan också framställas genom stegvis syntes 14,15. Men att öka antalet aminosyror leder till minskningar i de totala kopplingsutbyten, vilket påverkar kvaliteten på peptiderna. På grund av den låga mängden peptider per fläck, produkterna är ofta svåra att rena och kvaliteten på individuella peptider kan inte vara lätt bedömas. Därför är resultaten som erhålls från SPOT Peptide arrayer måste bekräftas antingen med peptider syntetiserade genom standardmetoder i större skala, som kan renas och analyseras enligt standard i peptidsyntes eller genom att syntetisera de proteiner som innehåller de önskade peptidsekvenserna. Ändå fann vi SPOT syntes vara mycket tillförlitliga och resulterar i allmänhet att vara reproducerbar. SPOT-syntes är inte begränsad till proteinogena aminosyror, flera kommersiellt tillgängliga modifierade aminosyror även kan användas för syntes, vilket gör att peptider som skall modifieras före och efter den slutliga klyvningen av sidokedjeskydd grupp och dessutom, gör det också inkorporering av fosforylerade, metylerade eller acetylerade aminosyror 11.
Immobiliserade peptidbibliotek syntetiseras av SPOT metoden kan direkt användas för många biologiska och biokemiska analyser. Vi använde peptid arrayer som innefattar 300-400 peptider för att undersöka substratspecificiteten hos PKMTs. För enzymatisk modifikatjon, är peptid arrayer inkuberades med respektive PKMT och märkt [metyl-3H] -AdoMet i en lämplig buffert. Metyleringen av respektive substrat analyseras genom att följa den enzymatiska överföringen av de radioaktivt märkta metylgrupper från AdoMet till peptidsubstratet via autoradiografi (Fig. 3). Genom detta förfarande, peptid arrayer tillåter studiet av metylering av olika peptidsubstrat på samma gång. En viktig fördel med denna metod är att alla peptiderna metyleras i konkurrens, så att under den linjära fasen av metyleringen kinetik, är proportionell mot den katalytiska hastighetskonstanten dividerat med dissociationskonstanten (kcat / den relativa metylering av varje peptid D) av enzymet för respektive peptidsubstratet. Därför är mängden radioaktivitet införlivad i varje fläck direkt korrelerad med den enzymatiska aktiviteten mot särskild peptid. AnvändaResultaten av en peptid array metylering experiment kan definieras och baseras specificiteten profilen för PKMT om denna nya substrat förutsätts vara. Peptid arrayer möjliggöra ett snabbt och kostnadseffektivt validering av metylering av nya substrat på peptidnivå. För detta är arrayer bereds som innehåller de förutspådda nya substrat tillsammans med modifierade peptider innehållande en Ala istället för Lys på målgrupp webbplatser samt positiva och negativa kontrollpeptider. Slutligen kan de nya substraten framställas som proteiner tillsammans med mutanter, i vilken målet Lys är ändrat till Ala och metyleringen kan bekräftas på proteinnivå. Beroende på resultaten, detta sedan följs av biologiska studier som tar upp eventuella roller för metylering av de nyligen beskrivna proteinsubstrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av peptiden Arrays
- Programmering av peptidsekvensema
- Planpeptidsekvenser för syntes med hjälp av MultiPep Spotter programvaran. Ange peptidsekvenser i enstaka bokstavskoder.
Peptid 1: TARKSTGGKA - Generera alanin eller arginin promenad bibliotek med ett visst kommando (.Sätt, A) att sålla de viktiga aminosyror som krävs för erkännande av en definierad substrat. Till exempel i följande exempel den första raden är vildtypsekvensen och från den andra raden varje aminosyra i en peptid är ändrad till alanin sekventiellt.
byt, A
TARKSTG
En -ARKSTG
T- En -RKSTG
TA A -KSTG
TARGET A -STG
TARK- A -TG
TARKS- A -G
TARKST- A - Använd liknande kommandon (.Sätt R,.ersätta N etc) som beskrivs i 1.1.2 med alla de naturligt tillgängliga aminosyrarester (småningom utelämna cystein, metionin och tryptofan, eftersom dessa rester är benägna till oxidation och ibland lägre syntes utbyte) för att syntetisera en peptiduppställningen för bestämning av konsensus substratsekvensmotiv för ett enzym.
NOTERA: Som visas i figur 4A, representerar den horisontella axeln den givna peptidsekvensen och den vertikala axeln representerar de aminosyror som är valda för kommando. I likhet med den sekvens som visas i 1.1.2, A på den vertikala axeln gör att en Ala sekventiellt ersätter varje läge för den givna sekvensen i den första raden i fig. 4A. Likaså arginin sekventiellt ersätter varje aminosyra i den andra raden och så vidare med de andra aminosyrorna. Kompletta bibliotek peptid array syntetiseras genom att systematiskt byta ut varje rest i förutsatt peptidsubstratet sekvens med var och en av the andra naturligt tillgängliga aminosyror, bidrar detta till att förstå påverkan av varje rest vid varje position av den givna sekvensen. - Alternativt metylering av kända eller förväntade peptidsubstraten lätt kan kontrolleras syntetisera peptidbibliotek med målgrupp peptider av PKMT tillsammans med positiva och negativa metylering kontroller (dvs peptider kända för denaturerad eller kända inte vara denaturerad). Syntetisera peptider genom utbyte av förmodade målet lysin till alanin för att bekräfta metylering av målet lysin enligt nedan genom manuell programmering.
Vildtyp peptid: STGG K PRQFL
Mutant peptid: STGG A PRQFL
OBS: Programvaran har också inneboende skript för att skapa olika bibliotek, liksom epitopkartläggning med en önskad bildruta förskjutning av sekvensen för att kart viktiga aminosyror som krävs för en interaktion.
- Planpeptidsekvenser för syntes med hjälp av MultiPep Spotter programvaran. Ange peptidsekvenser i enstaka bokstavskoder.
- Beredning av Membrane, aminosyror end Reagens
- Pre-svälla SPOT membranet i DMF (N, N-dimetylformamid) i 10 minuter och sedan placera den våta membranet på plats synthesizer ramen utan luftbubblor eller rynkor.
- Tvätta membranet tre gånger med 100% etanol. Torka membranen helt i minst 10 minuter innan du startar syntesprogrammet.
- Parallellt nyligen förbereda 0.5 M arbetar koncentrationer av kommersiellt tillgängliga Fmoc-skyddade aminosyror genom att lösa dem i NMP och även förbereda aktivator och basen som beskrivs i tabell 1.
- Se till att alla behållare för avfalls lösning av SPOT synthesizer tömdes och fyll lösningsmedels reservoarer med DMF, etanol och piperidin.
OBS: Maskinen är nu redo för syntesen.
- Spotting av den första aminosyran
- För att generera amidbindningen med den fria aminogruppen på membranet, aktivera karboxigruppen i den inkommande aminosyran genom adding aktivatorn (N, N '-Diisopropylcarbodiimide) och baslösningen (Ethyl hydroxiimino cyanoacetat) till aminosyraderivatet.
- Spot de önskade volymerna av aktiverade aminosyrorna på amino-PEG funktionaliserad membran använder den programmerbara roboten.
OBS: Därigenom C-terminalen av aminosyra kopplad till aminogruppen av membranet. - Upprepa detta steg tre gånger för att säkerställa en bättre koppling av den första aktiverade aminosyran. Inkubera membranet under 20 min och sedan tvätta med DMF för att avlägsna okopplade aminosyror.
- Blockering av fria utrymmen för icke-plats Områden
OBS: Efter kopplingen av den första C-terminala aminosyran i alla peptiderna till aminogruppen av membranet, behöver aminogrupperna mellan fläckarna och även vissa av aminogrupperna inom fläckområden inte bilda bindningar med aminosyrorna.- Blockera dessa fria aminogrupper genom att inkubera med kapslingslösning (20% ättiksyraanhydrid i DMF)under 5 min.
NOTERA: Detta undviker koppling av aminosyror i de ytterligare cykler med membranet i stället för den växande peptidkedjan.
- Blockera dessa fria aminogrupper genom att inkubera med kapslingslösning (20% ättiksyraanhydrid i DMF)under 5 min.
- Avlägsnande av Fmoc-gruppen
- Efter blockering, tvätta membranet med DMF 4 gånger och sedan inkubera med 20% piperidin i DMF under 20 min för att avlägsna Fmoc-skyddsgruppen.
OBS: Detta steg leder till borttagande av aminoskyddsgrupper Fmoc grupper och det kallas avskyddning. - Efteråt, tvätta membranet två gånger med DMF och två gånger med etanol och låt det torka.
OBS: Nu membranet är redo för koppling av nästa aminosyror.
- Efter blockering, tvätta membranet med DMF 4 gånger och sedan inkubera med 20% piperidin i DMF under 20 min för att avlägsna Fmoc-skyddsgruppen.
- Kedjeförlängning
OBS: Tillsats av varje aminosyra kallas en cykel. Förutom kopplingen av första aminosyran, börjar cykeln med avskyddande av Fmoc-gruppen av den kopplade aminosyran och det följs av koppling av den aktiverade karboxylgruppen av en inkommande aminosyran till aminogruppen i den växande peptidvattnet kedja.- Upprepa steg 1,3 och 1,5 tills den önskade peptidlängd uppnås.
- Färgning
OBS: Efter den sista cykeln, är peptid arrayer färgas med bromofenolblått att bekräfta den framgångsrika syntesen av peptider. Bromfenolblått binder med de fria aminogrupperna av peptiderna. Peptid fläckar visar ljusblå färg efter färgning men intensiteten av fläckarna varierar beroende på peptidsekvensen. Denna färgning tillåter bekräftelse på fullständigt avlägsnande av piperidin, eftersom i närvaro av piperidin bromofenolblått inte fläckar peptiderna. Dessutom hjälper det också till att markera peptid arrayer för vidare användning.- Efter Fmoc-gruppen avblockering i den sista syntescykeln, tvätta membranet med DMF och 100% etanol. Därefter, behandla membranet med bromfenolblått (0,02% bromfenolblått i DMF) under minst 5 minuter tills det fullständigt blir blå.
- Efteråt, tvätta membranet med DMF och ethanol följt av torkning under 10 min. Nu tar ut membranet från synt och utföra sidokedja deprotektion (avsnitt 1.8) manuellt. Om det behövs, fotografera membranet att dokumentera resultaten av peptidsyntes (fig. 2).
- Side Chain Deprotektion
- Behandla membranen med 20-25 ml av sidokedja avskyddande blandning bestående av 95% trifluorättiksyra (TFA) för att klyva grupperna sidokedjeskydd och renhållare reagensen (2,5% vatten och 2,5% triisopropylsilan) för att skydda sidokedjorna av aminosyror från modifiering under detta steg. Ta en tillräcklig volym av avskyddande blandning för att säkerställa att den täcker membranet helt i en väl tillsluten kemikaliebeständig låda och inkubera den för 1 till 2 tim under omskakning försiktigt.
- Tvätta membranet sex gånger med 20 till 25 ml av DCM (diklormetan) för 2 min vardera och slutligen två gånger med 100% etanol och torka den i en exsickator över natten.
OBS: Numembranet kan användas för experiment. Ett system av peptiduppställningen syntesen tillhandahålls i figur 1.
2. Protein Expression and Purification
- Protein Expression av PKMTs som GST-fusioner
- Med användning av standardtekniker, klona genen som kodar för fullängds PKMT eller dess katalytiska domän till en bakteriell expressionsvektor (som pGEX-6p2) att uttrycka det som GST-fusionsprotein.
- Överför vektorn med den önskade PKMT infoga i BL21 eller BL21 kodon plus E. coli-celler från värmechockmetoden eller någon annan metod.
- Förbered en pre-kultur med 30 ml Luria-Bertani (LB) media på dagen för uttryck och inkubera vid 37 ° C under 7 till 8 timmar med kontinuerlig skakning.
- Nästa, överför 10 ml av pre-kulturen till en 2 L stora gäckade kolvar innehållande 1 liter LB media och inkubera vid 37 ° C i inkubatorn med kontinuerlig skakning tills odlingen hålles en definierad optisk densitet vid 600 nm.
OBS: Även om detta kan optimeras för varje protein, vi rutinmässigt inducera vid en OD 600nm på omkring 0,8. Induktionstemperaturen måste optimeras för varje protein individuellt, vissa proteiner visar god expression vid 22 ° C och en del vid högre temperaturer. - Skift cellerna till induktionstemperatur under 15 minuter, därefter inducera med 1 mM isopropyl-beta-D-tiogalaktopyranosid och låta kulturen växa under 10-12 h vid induktionstemperatur.
- Efteråt skörda cellerna genom centrifugering vid 5000 x g i 15 min och slutligen tvätta pelleten med 30 ml STE-buffert (10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl och 0,1 mM EDTA) och förvara vid -20 ° C för vidare användning.
- Proteinrening
- Tina cellpelleten och återsuspendera i 30 ml sonikeringsbuffert (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT och 5% glycerol) och störa genom sonikering.
OBS: Denna buffert nEEDS optimeras för varje protein småningom. - Centrifugera cellysatet vid 22.000 xg under 1 timme och senare samla supernatanten och passera genom en kolonn innehållande 600 | il glutation-Sepharose 4B-harts.
- Tvätta kolonnen med 50 ml sonikeringsbuffert och nästa med 100 ml buffert med hög salthalt (50 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT och 5% glycerol) för att avlägsna ospecifikt bundna proteiner. Eluera det bundna proteinet med 5 ml av buffert med hög salthalt innehållande 40 mM glutation.
- Dialysera eluerade proteinet i 2 L av dialysbuffert med låg glycerol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT och 10% glycerol) under 2 h och senare i 20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT och 70% glycerol för 8 timmar eller över natten. Se till att alla reningsbuffertar är vid 4 ° C och utför proteinrening i kylrummet för att undvika proteindenaturering.
- Tina cellpelleten och återsuspendera i 30 ml sonikeringsbuffert (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT och 5% glycerol) och störa genom sonikering.
3. Peptid Array Metylering
- Pre-incubation av peptid Arrays
- Utför peptiduppställningen metylering antingen i en låda med lämplig storlek eller i en plastpåse för att undvika slöseri med enzym och dyra radioaktivt märkt AdoMet. Pre-inkubera peptiden array membranet i försluten plastpåse med respektive metylering buffert utan enzym och märkt [metyl-3H] -AdoMet i 10 min. Volymen av bufferten beror på storleken på matrisen, exempelvis använda 8 ml metylering buffert för en fullständig specificitet profil peptiduppställningen. Optimera mängden och koncentrationen av den AdoMet för varje enzym.
- Metylering av peptid Arrays
- Kassera förinkubation buffert och inkubera membranet i 8 ml metylering buffert innehållande respektive PKMT och märkt [metyl-3H] -AdoMet för 1-2 tim.
OBS: Den mängd enzym som krävs för en metylering reaktionen beror på aktiviteten hos specifika PKMT, vi inleder våra screeningexperiment normalt med 50 Nm enzymfenaal koncentration.
- Kassera förinkubation buffert och inkubera membranet i 8 ml metylering buffert innehållande respektive PKMT och märkt [metyl-3H] -AdoMet för 1-2 tim.
- Tvättning av peptid Arrays
- Efteråt kassera metylering buffert i ett radioaktivt avfallsbehållare och tvätta peptid arrayer för fem gånger med 20 ml buffert innehållande 100 mM ammoniumbikarbonat och 1% SDS under 5 min för att avlägsna det bundna proteinet. Kassera tvättbufferten i ett radioaktivt avfallsbehållare.
- Upptäckt av radioaktivt Signal
- Efter tvättning inkubera membranet under 5 min i 10 ml av Amplify lösning (NAMP100V).
- Sedan, kassera Amplify lösningen i avfallsbehållaren radioaktivt för organiska lösningsmedel, försegla peptid array i en plastpåse och lägg den i en autoradiografi kassett.
- Placera autoradiografifilm på peptiduppställningen i det mörka rummet. Stäng kassett försiktigt och exponera den på -80 ° C under den tid som krävs. Därefter utveckla filmen för att analysera resultaten. Ta bilden några gånger med olika exposition gånger för att undvika mättnad av starkt metylerade peptidsubstraten.
4. databehandling och analys
- Densitometrisk Analys av Spot intensiteter
- Skanna filmen i en konventionell scanner och analysera spotintensitet genom densitometri. Gör detta med ImageJ (vilket är freeware) eller ett kommersiellt program.
OBS: Vi använder Phoretix programvara för denna uppgift.
- Skanna filmen i en konventionell scanner och analysera spotintensitet genom densitometri. Gör detta med ImageJ (vilket är freeware) eller ett kommersiellt program.
- Normalisering och medelvärde av resultat från olika membran
- Genomför de peptid array metylering experiment vid minst tre exemplar. Normalisera de skannade intensiteter för varje experiment genom bakgrundssubtraktion och ställa in aktiviteten vid en referenssubstrat som 1,0. Medelvärdet uppgifterna för de enskilda platser och rapportera dem som medelvärden och standardavvikelser.
- Dataanalys och visning
- Plotta data i 2D med hjälp av en gråskala eller färgschema för att ange den relativa aktiviteten. Gör detta with Excel eller Sigmaplot som visas. Också förbereda en kurva över fördelningen av standardavvikelserna för de upprepade försöken att analysera kvaliteten på uppgifterna.
- Att jämföra och visa riktigheten i erkännandet av varje rest i substratet peptiden kvantitativt beräkna den relativa preferens för PKMT för varje aminosyra i vid position x av en diskrimineringsfaktor D 16,17:
D X; i = <V j ≠ i> / V i - 1
Där v i är graden av metylering av peptiden varianten bär aminosyra i vid position x och <v j ≠ i> är den genomsnittliga metylering av alla 19 peptider som bär en annan aminosyra j ≠ jag vid position x (inklusive vildtypsekvensen).
OBS: diskriminationsfaktor definieras av detta beror på bakgrundsnivån. Om endast en rest accepteras vid en viss position med en bakgrund av 3%, en diskrimineringfaktor av 32,3 erhålles. Ingen preferens vid en position resulterar i en diskrimineringsfaktor på 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Peptid arrayer framgångsrikt använts för att biokemiskt karakterisera specificitet PKMTs, och flera nya histon och icke-histon substrat för PKMT identifierades genom detta tillvägagångssätt 5,16-19. Definiera rätt substrat spektrum av en PKMT (eller någon enzym) är ett viktigt steg mot förståelsen av dess molekylära mekanism och cellulära funktioner.
Som ett exempel på tillämpningen av peptiden SPOT array metylering metod beskriver vi resultaten av specificiteten analysen av NSD1 PKMT 19. Föregående vårt arbete, var detta enzym beskrivs till Metylera flera substrat inklusive histon H3 på K36 och histon H4 på K20 utan även NF-kB familjen transkriptionsfaktor p65 på K218 och K221. Fig. 4A visar ett exempel på en metyleringsreaktion av en peptiduppställningen med NSD1. För detta experiment, ett stort peptid array baserad på H3 (31-49) sekvensen syntetiserades som innehåller alla möjligaenstaka aminosyraförändringar i den ursprungliga sekvensen för att testa betydelsen av varje aminosyra för NSD1 interaktion och metylering. Totalt 380 peptider syntetiserades (20 möjliga aminosyror x 18 rester plus ett original H3 sekvens i varje rad). Den horisontella axeln representerar sekvensen av peptiden och i den vertikala riktningen aminosyran vilken ändras i motsvarande peptid indikeras. Exempelvis fläcken på rad 17 kolumn 4 innehåller en treonin vid den tredje positionen i stället för glycin som är närvarande i sekvensen av vild typ (fig. 4A). På ett sådant sätt, är punktmutationer genereras för att testa preferensen av NSD1 för varje nativ aminosyra vid varje position i peptidsubstratet. Metylering med NSD1 visade att den agerar specifikt på H3K36 och det har preferenser på vardera sida av målet lysin 34-38.
Figur 4B representerar konsolidering av tre peptid array metyleringexperiment med NSD1. Den kvantitativa information förvärvades från de enskilda peptid matriser och resultaten normaliserades och uppgick i genomsnitt enligt ovan. Standardavvikelsen för enskilda medelvärden visar att uppgifterna är mycket reproducerbar. Totalt omkring 85% av peptiderna visar SD mindre än 20% och mer än 97% av de peptidsubstraten visade SD mindre än 30% (Fig. 4C). Dessutom har vi beräknat också diskriminationsfaktor att exakt bestämma bidraget från varje aminosyra vid de testade positionerna. Såsom beskrivits det ger en kvantitativ beskrivning av peptiden utläses och preferens av aminosyror vid den specifika positionen (fig. 5A). Våra data visar att NSD1 föredrar aromatiska rester vid -2 läget (väger K36 som position 0) (F> Y> G); hydrofoba rester vid -1 (I> L> V); basiska rester vid ett (R> QKNM), där det inte kan tolerera hydrofoba eller aromatiska rester; och hydrophobic rester vid +2 (V> IA> P). På andra webbplatser (som -3, +3, eller +6), NSD1 föredrar vissa aminosyror, men ingen stark rester specifik avläsning upptäcktes.
Utifrån denna profil kan potentiella nya peptidsubstrat hittas genom databassökningar som att använda Scansite 20 (fig. 5B). Dessa peptider framställdes på en SPOT array inklusive positiva och negativa kontroller och inkuberas med NSD1 och radioaktivt märkt AdoMet att identifiera delmängd av dem som är metylerade vid peptidnivå (Fig. 5C). Som följer ups, kan peptid matriser beredas som omfattar peptidvarianter, där målet lysin ersätts av alanin, för att bekräfta att metylering sker vid den förutsedda platsen. Sedan kan målproteinerna eller underdomäner av dem innehållande målet lysin ställas rekombinant och metyleringen testade även på proteinnivå. Slutligen, beroende på resultaten, uppföljning experiment kan jag nvestigate om metylering förekommer också i celler och vilka biologiska roll den har.
Figur 1:. Scheme of peptidsyntes SPOT metod på cellulosamembran Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Exempel på en peptid array färgas med Bromofenolblåttlösning att bekräfta syntesen av peptider Klicka här för att se en större version av denna siffra.
p_upload / 52203 / 52203fig3highres.jpg "/>
Figur 3: Ordning av peptiden array metylering experiment; peptid arrayer metylerades genom inkubation med PKMT och märkt [metyl-3H] -AdoMet i en lämplig buffert. Efteråt radioaktiviteten överförs till varje plats upptäcks av autoradiografi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Exempel resultat som erhållits med NSD1 PKMT A) Exempel på en substratspecificitet peptiduppställningen för NSD1 använder H3 (31-49) sekvensen som mall.. Den horisontella axeln representerar H3-sekvensen och den vertikala axeln representerar aminosyrorna genom vilken motsvarande rad är muterad. Den första raden innehåller peptider medursprungliga sekvensen. B) Konsolidering av resultaten från tre oberoende peptid array metylering experiment med NSD1 har uppgifterna medelvärden från samtliga tre försök efter C) Fördelning av standardfel för de genomsnittliga metylering data som visas i panelen B. Reproducerat från Kudithipudi et normalisering. al. (2014) med vissa modifieringar 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Upptäckt av nya PKMT substrat A) Diskriminering faktorer NSD1 för erkännande av aminosyrarester i positionerna bredvid målet lysin (K36 i experimentet visas här). Data visar att NSD1 föredrar aromatiska rester vid -2 position (väger K36 som position 0). Hydrofoba rester redovisas vid -1 och 2 lägen, om än med distinkta skillnader i detaljerna. Vid en plats basiska rester och amider föredras. Vid andra sajter några svaga preferenser, men ingen stark rester specifik avläsning upptäcktes. B) Skärmdump på ett exempel söka på Scansite, med hjälp av specificitet profilen bestämts för NSD1. C) Peptide SPOT array som innehåller flera förutspådde roman NSD1 substrat tillsammans med positiva (H3K36 ) och negativa kontroller (H3K36A). Några av de bygger nya mål var starkt metylerade (vissa av dem kommenterade), i andra fall kunde inte verifieras förutsägelserna. Panel A och C reproduceras från Kudithipudi et al. (2014) med vissa modifieringar 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Bas | 1 M Oxyma Ren i NMP -> 2,13 g Oxyma Ren i 15 ml NMP |
| Aktivator | 2,4 ml N, N '-Diisopropylcarbodiimide i 15 ml NMP |
| Capping Blandning | 20% ättiksyraanhydrid i DMF -> 6 ml ättiksyraanhydrid i 30 ml DMF |
| Fmoc Avskyddning | 20% piperidin i DMF -> 200 ml i 1000 ml DMF |
| Sidokedje Avskyddning | 900 pl triisopropylsilan + 600 l DDH 2 O i 30 ml TFA |
| Färgning | 0,02% bromfenolblått i DMF |
Tabell 1: Kemiska blandningar och deras sammansättning användes i protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SPOT-syntes som beskrivs här är en kraftfull metod för att kart protein-proteininteraktioner platser och undersöka substrat erkännande av peptid modifierande enzymer. Emellertid har SPOT syntes fortfarande vissa nackdelar, eftersom även om peptiderna syntetiseras av SPOT metod rapporteras ha mer än 90% renhet 21 detta är svårt att bekräfta i varje instans. Därför resultat måste reproduceras av andra metoder för exempelvis med hjälp av proteindomäner eller med renade peptider syntetiseras av standardmetoder. Dessutom är den andra stora nackdelen med SPOT arrayer som mest tid kan de inte återanvändas för att utföra flera analyser med en matris.
För att öka effektiviteten i syntes med aminosyror av låg stabilitet, liksom den skyddade arginin, är det viktigt att göra dem färska för varje 5 cykler. I enzymatiska reaktioner eller proteinbindande studier påpekas ofta att periferin av peptiden plats har more signalintensitet än mitten ("ring spot effekt"). Denna effekt kan bero på den höga tätheten av peptider i den centrala delen av platsen och då kan det lösas genom nedskalning peptidsyntes 22. För ytterligare felsökning av peptidsyntes maskinens handbok och företagets tjänst bör konsulteras. Om metylering inte observeras ska positiva kontroll peptider (dvs peptider kända för att vara metyleras av enzymet under utredning) läggas till membranet.
Alternate till SPOT arrayer, hög densitet peptidmikro arrayer 23 finns tillgängliga, men de är dyrare och kräver specialutrustning för användning. Vidare mängden peptid per fläck är mindre, vilket kräver mer känsliga avläsningsförfaranden. Proteinchip finns också att studera dessa funktioner 24,25, men de är svårare att förbereda eftersom varje enskilt protein behöver uttryckas och renas ochproteinveck på matrisen behöver upprätthållas. En ytterligare fördel med peptid matriser är ett eventuellt införande av posttranslationella modifieringar under syntesen och hur lätt mutationstestning av betydelsen av enskilda aminosyror.
Det är en viktig utgångspunkt för detta protokoll, för att ha minst en peptid identifierats, vilket metyleras av enzymet under utredning. Metylering villkor och buffertar måste optimeras, liksom koncentrationen av metyltransferas. Exempel tidsförlopp för metylering måste bestämmas för att undvika fullständig metylering av de bästa underlaget, vilket kommer att orsaka förlust av dynamiskt omfång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
