Abstract
Lizin metilasyonu yükselen bir translasyon sonrası modifikasyon olup, hücre gelişimi ve bir çok hastalıkta önemli bir rol oynar burada bu, birkaç histon ve histon olmayan proteinleri üzerinde tespit edilmiştir. Yaklaşık 5.000 lisin metilasyon siteleri, protein lisin methyltransferases birkaç onlarca tarafından belirlenen farklı proteinler, tespit edilmiştir. Bu artık, sadece bir ya da iki alt-tabakalar, bu enzimlerin birkaç için tespit edilmiştir, ancak kadar her PKMT birden proteinleri metile işaret etmektedir. Bu sorunu yaklaşım, biz girmiştik peptit dizisi bazlı substrat özgüllüğü PKMTs analizleri. Peptid dizileri farklı dizi ile çeşitli substratların metilasyon bir dizi test edilebilir, çünkü PKMTs özgüllüğünü tanımlamak için güçlü araçlardır. Biz INTAVIS SPOT sentezleyici kullanılarak selüloz zarı üzerinde peptid dizileri sentezlenmiş ve çeşitli PKMTs özgüllüğünü analiz edilmiştir. Bu enzimlerin birçoğu için, sonuçlara göre, yeni substrates tanımlanabilir. Örneğin peptit dizileri kullanılarak NSD1 için, bunun H4 K44 yerine rapor H4K20 metile ve buna ek olarak H1.5K168 önceden bilinen H3K36 üzerinde yüksek ölçüde tercih edilen alt-tabaka olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, peptid dizileri biyokimyasal PKMTs karakterize güçlü araçlardır.
Introduction
Son iki yılda, çeşitli raporlar hücresel gelişim ve kanser gibi çeşitli hastalıkların, ancak son zamanlarda protein lisin metilasyonu bir başka hayati PTM olarak ortaya çıkmıştır içinde post-translasyonel modifikasyonlar (PTM) önemini göstermiştir. Başlangıçta sübstrat olarak histon lizin metilasyon önemli bir kromatin işareti olarak bulunurken, daha sonra çalışmalar da çeşitli sivil histon proteinler 1-4 lizin metilasyon gösterdi. lizin kalıntılarının ε-amino grubunda ve S-adenosil-L-metionin metil gruplarının bir transferi insan genomunda 60 proteinleri içeren protein Lizin metiltransferaz (PKMTs) olarak adlandırılan bir enzim ailesi tarafından katalize edilmektedir. PKMTs başlangıçta belirli lizin kalıntısı metillenmesi ancak daha sonra raporlar da olmayan histon proteinler 5 metillenmesi olabilir gösterdi histon modifiye enzimler olarak tespit edildi. Şimdiye kadar, yaklaşık 5.000 lizin metilasyon siteleri farklı proteinler 6 tespit edildi
Peptid dizileri yaygın olarak antikorlar, peptid değiştirici enzimler ve protein-protein etkileşim bölgeleri (antikor-antijen, reseptör-ligand), 7-9 haritalama biyokimyasal analizi için kullanılan araçlardır. Peptidlerin birkaç yüz suc için gerekli olanh uygulamaları. Farklı yöntemler onları çok yaygın olarak kullanılan bir reçine üzerinde sentez peptit arasında, peptid sentezi için kullanılabilir, ancak bu verim değeri sınırlıdır ve bu nispeten pahalıdır. Bu sorunlar Frank ve arkadaşları 10 tarafından SPOT sentez yöntemi tanıtımıyla çözüldü. SPOT sentez yöntemi paralel olarak birkaç yüz peptitlerin sentezini sağlar ve ortalama reçine sentezi göre ucuzdur. selüloz zarı üzerinde sentezlenen peptidler zar ayrılır ve çözelti deneylerinde serbest peptidler olarak kullanılabilir ya da peptid mikrodiziler 10-13 hazırlamak için edilebilir çeşitli uygulamalar veya peptidlere doğrudan kullanılabilir.
SPOT sentezi katı bir destek olarak bir selüloz zar kullanılır ve standart Fmoc kimyası kullanan 10-13 katı fazlı peptit sentezi, bir çeşididir. Bu nedenle, peptid zincirlerinin sentezlenmesi C-terminal ucunda başlar ve doğru ilerlerRibozomlar biyolojik sentezi aksine N-terminal ucu. Selüloz membranlar ilk olarak aktif amino asitler (Şek. 1) bağlanması için fonksiyonalize edilir. SPOT yöntem otomatik bir pipet sistemi kullanılarak zar üzerinde tanımlanan noktalar için çözücünün bir damlacık içinde aktive edilmiş bir amino asitlerin ardışık doğum dayanmaktadır. sıvı damlacık daha sonra peptit sentezinde kimyasal reaksiyonlar için açık bir reaktör olarak işlev yapan bir dairesel ıslak nokta oluşturur gözenekli zar üzerinde dağıtılır. spot büyüklüğü tevzi hacmi ve membran emme kapasitesi ile belirlenir, bu noktalar katları dizileri olarak düzenlenmiştir. sentez ölçekli nokta büyüklüğü ve membran yükleme kapasitesi ile ilişkilidir. noktalar ve dizilerin yoğunluğu arasındaki mesafe nokta boyutları değişen yönetilmektedir. Selüloz membran peptid sentezinde katı faz olarak bir çok avantajı vardır, bu kullanılan kimyasal için, ucuz toleranslıdırsulu çözeltiler içinde kararlı ve kolay olarak peptid sentezinde kullanılan als. Buna ek olarak, hidrofil bir karakter gösterir çeşitli biyolojik tahlil sistemleri için uygun yapar. SPOT Sentez elle gerçekleştirilir veya peptitler gerekli sayısına bağlı olarak, peptidler (1000'ler için) otomatik hale getirilebilir. INTAVIS (Köln, Almanya) Tam otomatik SPOT sentezleyici bizim uygulamalar için kullanılır. Farklı miktarlarda ve farklı uzunlukta peptit sentezini mümkün kılar. Ayrıca, adım adım sentezi 14,15 hazırlanabilir doğrusal peptidler düzenli 42 amino asidin eklenmesi peptitlerde, 15-20 amino asit uzunluğunda sentezlenir. Bununla birlikte, amino asit sayısının artması peptidlerin kalitesini etkiler genel birleştirme verimi, azalmalara yol açar. Çünkü nokta başına peptidler düşük bir miktarının bu ürünler genel olarak saflaştırılması zor olan ve ayrı ayrı peptitlerin ürünlerin kalitesi daha kolay değerlendirilemez. Bu nedenle, sonuçlar SPOT Pept eldeide dizileri saflaştırılmış ve peptid sentezinde veya arzu edilen peptid dizilerini ihtiva eden proteinlerin sentezlenmesi ile standartlara göre analiz edilebilir büyük ölçekli standart yöntemler ile sentezlenir peptidler ya onaylanmalıdır. Yine, biz son derece güvenilir olması için SPOT sentezini buldum ve tekrarlanabilir olması genellikle sonuçları. SPOT sentez olan peptidler daha önce ve bundan başka son yan zincir koruma grubunun yarılması ve sonra modifiye sağlayan, amino asitler, aynı zamanda sentezi için kullanılabilecek çeşitli ticari olarak temin edilebilen tadil edilmiş amino asitler, proteinojenik ile sınırlı değildir, aynı zamanda dahil edilmesini sağlar fosforile metillenmiş ya da asitile edilmiş amino asitler, 11.
SPOT yöntemi ile sentezlenmiş Hareketsizleştirilmiş peptit kolleksiyonları, çok sayıda biyolojik ve biyokimyasal analizler için de kullanılabilir. Bu PKMTs sübstrat spesifitesinin incelenmesi için 300-400 peptidleri içeren peptid dizileri kullanılabilir. Enzimatik modifi için, peptit dizileri, ilgili PKMT ile inkübe edilir ve uygun bir tampon maddesi içinde [metil- 3H] -AdoMet etiketli. ilgili alt-tabaka metilasyon otoradyografi ile peptid alt-tabakaya AdoMet gelen radyoaktif olarak etiketlenmiş metil grubu enzimatik transferi (Şek. 3) aşağıdaki şekilde analiz edilir. Bu prosedür ile, peptid dizileri, aynı zamanda, farklı peptit alt tabakasma metilasyonu çalışma sağlar. Bu yöntemin önemli bir avantajı, tüm peptidler metilasyon kinetiği doğrusal aşamasında, her bir peptidin nispi metilasyon ayrılma sabiti (k cat / K bölü katalitik hız sabiti ile orantılı olacak şekildedir, rekabet metillenmiş olmasıdır İlgili peptid maddesi için, enzim D). Bu nedenle, her bir nokta ile radyoaktivite miktarı, doğrudan belirli bir peptid karşı enzimatik aktivitesi ile ilişkilidir. Kullanmabir peptit dizisi metilasyon deneyin sonuçları, PKMT özgüllüğü profili teyit edilebilecektir, bu yeni yüzeylerde tanımlandığı gibidir ve dayalı olabilir. Peptit diziler peptid düzeyinde yeni yüzeylerde metilasyonu hızlı ve maliyet etkin doğrulama sağlar. Bunun için, dizi hedef bölgelerde yerine Lys Ala ihtiva eden modifiye edilmiş peptidler olarak pozitif ve negatif kontrol peptidleri ile birlikte tahmin edilen yeni alt tabakaların içeren hazırlanır. Son olarak, yeni alt-tabakalar bir araya mutantları ile protein, burada hedef Lys Ala ile değiştirilmiş olduğu ve metilasyon protein seviyesinde doğrulanabilir gibi hazırlanabilir. Sonuçlarına bağlı olarak, bu daha sonra yeni açıklanan protein maddelerinin metilasyonu potansiyel rolleri ele biyolojik çalışmalar takip edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Peptit Dizilerinin 1. Hazırlık
- Peptit Dizilerin Programlama
- MultiPep gözcü yazılımı kullanılarak sentez için peptid sekansları sunabilirler. Tek harf kodları peptid dizileri girin.
Peptid 1: TARKSTGGKA - Tanımlanmış bir tabakanın tanınması için gerekli önemli amino asitleri ekrana belirli bir komutla (.Kapağı, A) alanin veya arginin yürüyüş kütüphaneleri oluşturun. Aşağıdaki örnekte Örneğin birinci hat yabanıl tip sekans, ikinci hattan bir peptid içinde bulunan her bir amino asit alanin arda değiştirilir.
, A yerine
TARKSTG
Bir -ARKSTG
T A -RKSTG
TA-A -KSTG
TAR A -STG
TARK- bir -TG
TARKS- bir -G
TARKST- A - Benzer komutları (.Kapağı R kullanın.Tüm doğal mevcut amino asit kalıntısının (sonunda sistein, metionin ve triptofan iptaliyle 1.1.2 tarif edildiği gibi, bu tortuları, oksitlenmeye eğilimlidir ve bazen daha düşük sentez verimi olduğu için), N, vs.) yerine konsensüs saptanması için bir peptit dizisini sentezleme Bir enzim için alt-tabaka dizisi motifi.
NOT: Şekil 4A'da gösterildiği gibi, yatay eksen verilen peptit dizisini temsil eder ve dikey eksen ise bir komut için, seçilen amino asitleri temsil eder. 1.1.2 gösterilen sekansına benzer bir şekilde, dikey bir eksen üzerinde bir Ala şekil l'de ilk satırda verilmiştir dizisinin her pozisyonunu değiştirir anlamına gelir. 4A. Benzer şekilde arjinin sekans ve bu başka amino asitler ile ikinci sırada bulunan her bir amino asidi değiştirir. Tam peptid dizisi kütüphaneleri sistematik th ile birlikte gelen peptid alt-tabakası sırayla her bir tortu yerine sentezlenire diğer doğal olarak mevcut amino asit kalıntıları, bu verilen sırada, her pozisyonda her bir kalıntı etkisi anlamaya yardımcı olur. - Seçenek olarak ise, bilinen ya da tahmin edilen peptit alt tabakasma metilasyonu kolayca pozitif ve negatif kontroller metilasyon ile birlikte PKMT hedef peptidleri ile (metillenmiş bilinen ya da metile olduğu bilinmemektedir örneğin peptitler) peptid kütüphaneleri sentezlenmesi doğrulanabilir. Manuel programlama ile aşağıda gösterildiği gibi hedef lizin metilasyonunu onaylamak için alanin için varsayılan hedef lisin alışverişi peptidler sentez.
Yabani tip peptit STGG K PRQFL
Mutant peptit STGG bir PRQFL
NOT: Yazılım aynı zamanda bir etkileşim için gerekli önemli amino asitleri eşleştirmek için dizinin istenen çerçeve kayması ile epitop haritalama gibi, çeşitli kütüphaneleri oluşturmak için doğal komut vardır.
- MultiPep gözcü yazılımı kullanılarak sentez için peptid sekansları sunabilirler. Tek harf kodları peptid dizileri girin.
- Membranın hazırlanması, amino asitler, bird Reaktifler
- 10 dakika boyunca, DMF (N, N-dimetilformamid) SPOT membran Ön kabarma ve bundan sonra da hava kabarcığı ve kırışıklık olmadan yerinde birleştirici çerçeve ıslak membran yerleştirin.
- Membrana% 100 etanol ile üç kez yıkayın. Sentez programına başlamadan önce en az 10 dakika boyunca tamamen membranlar kurulayın.
- Buna paralel olarak, taze NMP içinde çözdürülerek ticari olarak temin edilebilen Fmoc-korumalı amino asitler, 0.5 M çalışma konsantrasyonları hazırlamak ve Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, aynı zamanda aktivatörü ve baz hazırlar.
- SPOT synthesizer tüm atık çözüm kapları boşaltılması emin olun ve DMF, etanol ve piperidin solvent rezervuarları doldurun.
NOT: Şimdi makine sentezi için hazır hale gelir.
- Birinci Amino Asit lekelenme
- Reklam tarafından gelen bir amino asidin karboksi grubunun aktif hale, zar üzerinde serbest amino grubu ile amit bağı oluşturmak içinDing aktivatör (N, N 'diizopropilkarbodiimid) ve amino asit türevine baz çözeltisi (Etil hidroksiimino siyanoasetat).
- Programlanabilir robot kullanarak Amino-PEG işlevlendirilmiş membran üzerinde aktif amino asitler istenen hacimleri Nokta.
NOT: Bu şekilde, bir amino asit, C-terminali zar amino grubuna birleştirilir. - İlk aktive amino asitin iyi kavramayı sağlamak için bu adımı üç kez tekrarlayın. Bağlanmamış amino asitlerini ayırmak için DMF ile yıkama, daha sonra 20 dakika boyunca zarın inkübe ve.
- Sigara nokta Alanları Ücretsiz Mekanların Engelleme
Not: membran amino grubuna tüm peptitlerin birinci C-terminal amino asidin bağlanmasından sonra, lekeler ve ayrıca bir yer alanları içinde amino gruplarının bazıları arasındaki amino grupları, amino asitler ile bağlar oluşturmazlar.- Kapama çözeltisi ile inkübe edilerek, bu, serbest amino grubu bloke (DMF içinde% 20 asetik anhidrit)5 dakika karıştırıldı.
NOT: Bu membran yerine büyüyen peptid zinciri ile diğer çevrimlerde amino asitlerin bağlanmasını önler.
- Kapama çözeltisi ile inkübe edilerek, bu, serbest amino grubu bloke (DMF içinde% 20 asetik anhidrit)5 dakika karıştırıldı.
- Fmoc grubunun çıkarılması,
- Bloke edildikten sonra, DMF ile 4 kez zarın yıkanması ve daha sonra Fmoc koruma grubunun ayrılması için 20 dakika süre ile, DMF içinde% 20 piperidin ile inkübe edilir.
NOT: Bu adım, bir amino-koruyucu Fmoc gruplarının bertaraf yol açar ve bu korumanın kaldırılması olarak adlandırılır. - Daha sonra etanol ile iki kez DMF ile birlikte iki kez, zarı yıkamak ve kurutun.
Not: Hemen zar sonraki amino asitleri bağlamak için hazır hale gelir.
- Bloke edildikten sonra, DMF ile 4 kez zarın yıkanması ve daha sonra Fmoc koruma grubunun ayrılması için 20 dakika süre ile, DMF içinde% 20 piperidin ile inkübe edilir.
- Zincir uzama
Not: her bir amino asit ilave edilmesi, bir devir denir. Yanı sıra, birinci amino asidin bağlanması ile ilgili çevrim bağlanmış amino asidin N Fmoc grubunun korumasının bozulması ile başlamakta ve büyüyen girişken amino grubuna gelen bir amino asidin aktive edilmiş karboksil grubunun bağlanması izlergelgit zinciri.- İstenen peptid uzunluğu elde edilinceye kadar tekrarlayın 1.3 ve 1.5 adımları.
- Boyanma
NOT: Son devirden sonra, peptid dizileri peptitlerin başarılı bir sentez teyit etmek için bromofenol mavisi ile boyanır. Bromofenol mavisi peptidlerin serbest amino grupları ile bağlanmaktadır. Peptit noktalar boyandıktan sonra açık mavi renk göstermek ama noktalar yoğunluğu peptid dizisi bağlı olarak değişir. Bu boyama peptidlerin renklendirilmesi çünkü piperidin bromofenol mavisi mevcudiyetinde, piperidin tamamen kaldırılması onay sağlar. Buna ek olarak, bu aynı zamanda daha fazla kullanım için peptid dizilerini işaretlemek için yardımcı olur.- Son sentez çevriminde Fmoc grubunun korumasının giderilmesinden sonra, DMF ve% 100 etanol ile zarın yıkanması. Bu tamamen mavi olana kadar daha sonra 5 dakikalık bir minimum bromofenol mavisi (DMF içinde% 0.02 bromofenol mavisi) ile membran tedavi.
- Daha sonra, DMF ve ETH ile kesilmesi, zarı yıkamakAnole 10 dakika boyunca kurutuldu. Şimdi synthesizer gelen zarı çıkar ve elle yan zincir Deproteksiyon (bölüm 1.8) gerçekleştirin. Gerekirse, peptid sentezi (Şekil. 2) sonuçlarını belgelemek için membran fotoğraflamak.
- Yan zincir korumasının bozulması
- Yan zincir koruma grupları ve tutucu reaktifler (% 2.5 su ve% 2.5 triizopropilsilan) amino asit yan zincirleri korumak bölmek için% 95 trifloroasetik asit (TFA) 'den oluşan bir yan zincir koruma kaldırma karışımının 20-25 ml membranlar tedavi Bu aşama sırasında değişiklik. Tamamen sıkıca kapalı kimyasal dirençli kutusunda zarı kapsamaktadır sağlamak ve yavaşça çalkalayarak 1-2 saat kuluçkaya yatırmaktır için korumayı kaldırma karışımın yeterli bir hacmi al.
- 2 dakika her biri için, DCM (Diklorometan), 20-25 ml, membran altı kez yıkayın ve son olarak iki kez% 100 etanol ile ve gece boyunca bir kurutucu içinde kurutun.
NOT: ŞimdiMembran deneyleri için de kullanılabilir. Peptid dizisi bir sentezleme şeması Şekil 1 'de verilmiştir.
2. Protein Ekspresyonu ve Saflaştırma
- GST füzyonları olarak PKMTs Protein Ekspresyonu
- Standart teknikler kullanılarak GST-füzyon proteini olarak ifade etmek tam uzunluktaki PKMT ya da (pGEX-6p2) gibi bir bakteriyel ekspresyon vektörü içine katalitik domenini kodlayan genin klonlanması.
- BL21 BL21 veya kodon artı E. takın istenen PKMT ile vektör aktarın ısı şoku yöntemi ya da herhangi bir başka yöntem ile coli hücreleri.
- İfade gün Luria-Bertani (LB) ortamı içinde 30 ml bir ön-kültür hazırlanması ve sürekli çalkalanarak 7-8 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Daha sonra, LB ortamı 1 L ihtiva eden bir 2 L'lik büyük saptırma plakalı şişeler içine ön kültür, 10 ml transferi ve 37 ° C'de inkübe Kültür ulaşamayacağı kadar sürekli sallayarak inkübatör ° C600 nm 'de tanımlanan bir optik yoğunluk, es.
Not: Bu, her bir protein için optimize edilebilir birlikte, rutin olarak yaklaşık 0.8 olan bir OD 600Nm neden olur. indüksiyon sıcaklığı her bir protein için optimize edilmiş olması gerekir, bazı proteinler 22 ° C'de iyi bir ifade göstermektedir ° C ve daha yüksek sıcaklıklarda bir. - Daha sonra izopropil-p-D-tiyogalaktopiranosid 1 mM; özellikle, 15 dakika boyunca indüksiyon sıcaklığına hücreleri Shift Kültür indüksiyon sıcaklığında 10-12 saat boyunca büyümeye olanak sağlar.
- Daha sonra 15 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj ile hücreler hasat ve son olarak da daha fazla kullanım için -20 ° C 'de STE tampon maddesi (10 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCI ve 0.1 mM EDTA) ve mağaza 30 ml pelet yıkayın.
- Protein Saflaştırma
- Hücre topağı çözülme ve sonikasyon tamponu (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCI, 1 mM DTT ve% 5 gliserol) 30 ml yeniden askıya ve sonikasyon ile bozmaktadır.
NOT: Bu tampon nEEDS sonuç olarak her bir protein için optimize edilmiş olması. - 1 saat süre ile 22,000 x g'de hücre lizat santrifüj ve daha sonra süpernatan toplamak ve glutatiyon Sefaroz 4B reçine 600 ul ihtiva eden bir sütun içinden geçer.
- 50 sonikasyon tamponu ml yüksek tuz tamponu (7.5 50 mM Tris pH, 500 mM NaCI, 1 mM DTT ve% 5 gliserol), belirlenmemiş biçimde bağlı proteinleri uzaklaştırmak için 100 ml bir sonraki ile kolon yıkayın. 40 mM glutatiyon içeren yüksek tuz tamponu, 5 ml ile bağlı proteini elüte.
- Düşük gliserol (20 mM Tris pH 7.4, 100 mM KCI, 0.5 mM DTT ve% 10 gliserol), pH 7.4, 2 saat boyunca ve daha sonra 20 mM Tris, 100 mM KCI, 0.5 mM diyaliz tampon maddesinin 2 L Tasfiye edilen proteini Dialyze DTT ve% 70 gliserol 8 saat veya gece boyunca karıştırılmıştır. Tüm saflaştırma tampon, 4 ° C 'de olduğundan emin olun ve protein denatürasyonunu önlemek için soğuk bir odada, protein saflaştırma gerçekleştirmek.
- Hücre topağı çözülme ve sonikasyon tamponu (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCI, 1 mM DTT ve% 5 gliserol) 30 ml yeniden askıya ve sonikasyon ile bozmaktadır.
3. Peptid dizisi Metilasyon
- Ön incuPeptit Dizilerin lenme
- Enzim ve pahalı radyoaktif etiketli AdoMet israfını önlemek için uygun büyüklükte bir kutu ya da plastik bir torbaya ya peptit dizisi metilasyon gerçekleştirin. 10 dakika boyunca enzimsiz ilgili metilasyon tampon içeren plastik torba içinde peptid dizisi membran ve etiketlenmiş [metil-3H] -AdoMet önceden inkübe edin. Örnek tam özellik profilini peptid dizisi için metilasyon tamponu 8 ml kullanmak için tampon hacmi, dizinin boyutuna bağlıdır. Her enzim için miktar ve AdoMet konsantrasyonu optimize.
- Peptit Dizilerinin metilasyonu
- Ön kuluçka tamponu atılır ve ilgili PKMT içeren metilasyon tamponu 8 ml membran inkübe ve etiketli [metil-3H] -AdoMet 1 saat ila 2.
Not: bir metilasyon reaksiyonu için gerekli olan enzim miktarı belirli PKMT aktivitesine bağlıdır, bizim tarama deneyleri, 50 nM enzim yüzgeç genellikle başlatmaark konsantrasyonu.
- Ön kuluçka tamponu atılır ve ilgili PKMT içeren metilasyon tamponu 8 ml membran inkübe ve etiketli [metil-3H] -AdoMet 1 saat ila 2.
- Peptit Dizilerinin Yıkama
- Daha sonra radyoaktif atık konteynerine metilasyon tampon atın ve bağlanmış proteinin ayrılması için 5 dakika için 100 mM amonyum bikarbonat ve% 1 SDS içeren tampon içinde, 20 ml ile 5 kez peptid dizileri yıkayın. Bir radyoaktif atık kabına yıkama tampon atın.
- Radyoaktif Sinyal Algılama
- Yıkamalardan sonra, radyo frekans sinyallerini çözeltisi (NAMP100V), 10 ml, 5 dakika boyunca zarın inkübe edilir.
- Sonra, organik çözücüler için radyoaktif atık kabına güçlendir çözüm atmak bir plastik torba içinde peptit dizisi mühür ve bir otoradyografisidir kasetine koymak.
- Karanlık bir odada peptid dizisindeki otoradyografisi filmi yerleştirin. Dikkatle kaseti kapatın ve en maruz -80 Gerekli süre için C °. Sonra, sonuçları analiz filmi geliştirmek. Farklı Expositio ile kez görüntü birkaç Yakalaman kere kuvvetle metile peptid yüzeylerde doygunluğunu önlemek için.
4. Veri İşleme ve Analizi
- Nokta şiddetler dansitometrik Analizi
- Geleneksel tarayıcı filmi tarayın ve densitometri spot yoğunluklarını analiz. (Ücretsiz) bu kullanarak ImageJ veya ticari bir program yapın.
NOT: Bu görev için Phoretix yazılımını kullanın.
- Geleneksel tarayıcı filmi tarayın ve densitometri spot yoğunluklarını analiz. (Ücretsiz) bu kullanarak ImageJ veya ticari bir program yapın.
- Normalleştirme ve Farklı Membranların gelen Sonuçlarının Ortalaması
- En az üç kez peptit dizisi metilasyon deneyler. 1.0 gibi bir referans yüzeyde arka plan çıkarma ve aktivitesini ayarlayarak her deney için taranan yoğunluklarını Normale. Bireysel noktalar için veri ortalama ve onlara olarak ortalama değerleri ve standart sapmaları rapor.
- Veri Analizi ve Görüntü
- Göreceli aktivitesini belirtmek için bir gri tonlama veya renk düzeni kullanarak 2D verileri çizilir. Bu wi yapınth Excel veya SigmaPlot burada gösterildiği gibi. Aynı zamanda, veri kalitesi analizi için tekrarlanan deneylerde standart sapmalarının bir dağılım grafiği hazırlanır.
- Karşılaştırarak nicel substrat peptit her bakiyenin tanıma doğruluğu görüntülemek için bir ayrım faktör D 16,17 pozisyonunda x her bir amino asit i PKMT göreli tercih hesaplanır:
D X i = <V j ≠ i> / V i - 1
V I pozisyon X ve amino asit i taşıyan peptit varyantının metilasyon oranı Burada <h j ≠ i> de dahil olmak üzere, x konumuna, farklı bir amino asit j ≠ i taşıyan 19 peptitlerin metilasyonu ortalama oranı (bir Vahşi tip sekansı).
NOT: Bu tanımlanan ayrımcılık faktörü arka plan düzeyine bağlıdır. Tek Tortu,% 3 bir arka plan, bir ayrım ile belli bir pozisyonda kabul edilirse32,3 faktör elde edilmiştir. Bir pozisyonda hiçbir tercih 0 bir ayrımcılık faktörü sonuçlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yaklaşım 5,16-19 ile peptid dizileri başarılı bir şekilde biyokimyasal olarak PKMTs özgüllüğünü tanımlamak için kullanılmıştır ve PKMT birkaç yeni histon ve histon olmayan alt-tabakalar tanımlanmıştır. Bir PKMT (veya herhangi bir enzim) doğru substrat spektrumunu tanımlama moleküler mekanizması ve hücresel fonksiyonların anlaşılması yönünde önemli bir adımdır.
Peptid SPOT dizi metilasyon yöntemin bir uygulama örnek olarak, NSD1 PKMT 19 özgüllüğü analiz sonuçlarını tarif etmektedir. Bizim işe Önceki, bu enzim K36 de histon H3 ve H4 histon K20 değil, aynı zamanda K218 ve K221. Şek NF-kB ailesi transkripsiyon faktörü p65 dahil methylate birçok yüzeylerde tarif edilmiştir. 4A NSD1 sahip olan bir peptit dizisinin bir metilasyon reaksiyonu bir örneğini göstermektedir. Bu deneyler, H3 dayalı büyük bir peptit dizi için (31-49) dizisinin tüm olası içeren sentezlendiOrijinal dizisinin tek bir amino asit değişikliği NSD1 etkileşim ve metilasyon için kullanılan her bir amino asit önemini araştırmak. Toplam 380 peptitler sentezlendi (20 olası amino asit kalıntıları 18 artı her satırda bir orijinal H3 dizisi x). yatay ekseni ise, peptid dizisini temsil eder ve dikey yönde gelen peptid 'in değiştirilmiş amino asit belirtilir. Örneğin, satır 17 ile sütun 4, spot, yabani tipteki sekans (Şek. 4A) içinde mevcut olan glisin yerine üçüncü pozisyonda bir treonin içerir. Böyle bir şekilde, nokta mutasyonları, peptid alt-tabaka her pozisyonda her bir doğal amino asit için NSD1 tercihini test etmek için üretilmiştir. NSD1 ile metilasyon spesifik olarak H3K36 üzerinde hareket eder ve 34-38 hedef lizin iki tarafında tercihleri sahip olduğunu göstermiştir.
Şekil 4B üç peptit dizisi metilasyon konsolidasyon temsilNSD1 ile deneyler. nicel bilgiler tek tek peptid dizileri elde edilmiş ve sonuçlar normalize edilmiş ve yukarıda tarif edildiği gibi ortalama. Bireysel ortalamalar ve standart sapmaları verileri son derece tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir. Genel olarak peptidler yaklaşık 85% 20% 'den daha küçük ve peptit alt tabakaların fazla% 97 SDS (Şek. 4C) SDS daha küçük% 30 gösterdi gösterir. Buna ek olarak, aynı zamanda hassas bir test pozisyonlarda her bir amino asit katkısının belirlenmesi için ayrım faktörü hesaplanmaktadır. Sağladığı tarif edildiği gibi, peptidi nicel tanımı okumak ve belirli bir konuma (Şek. 5A) amino asitlerin tercih. Bizim verilerimiz NSD1 (F> Y> G) (0 konumunda olarak K36 dikkate alınarak) -2 konumundaki aromatik artıkları tercih olduğunu göstermektedir; hidrofobik kalıntıları -1 (l> L> V); hidrofobik veya aromatik artıkları tahammül edemez +1 (R> QKNM), temel kalıntıları; ve hyd+2 de rophobic kalıntılar (V> IA> P). Diğer bölgelerde, (Örn -3, 3, ya da 6), NSD1, bazı amino asitleri tercih eder, fakat güçlü bir tortu, özel okuma tespit edildi.
Bu profile göre, potansiyel yeni peptit yüzeyler Scansite 20 (Şekil. 5B) kullanarak gibi veritabanı aramalarda bulunabilir. Bu peptidler, pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere, bir SPOT dizisinde hazırlanmış ve NSD1 ile inkübe edilir ve radyoaktif olarak peptid seviyesi (Şek. 5C) ile metile edilmiştir bunların bir alt kümesini belirlemek için AdoMet etiketlenmiştir. Takipleri gibi, peptid dizileri bu metilasyon öngörülmüş yerde gerçekleşir teyit etmek için, hedef lisin, alanin ile ikame edildiği peptit türevleri arasında, bu hazırlanabilir. Daha sonra, hedef proteinler veya hedef lisin ihtiva eden bunların alt etki alanları rekombinant olarak üretilebilir ve Metilasyon, protein seviyesinde test edilmiştir. Son olarak, sonuçlara bağlı olarak, ben deneyler yapabilirsiniz takip metilasyon de biyolojik hangi rolü vardır hücrelerde görülür ve eğer nvestigate.
Şekil 1:. Selüloz zarı üzerinde SPOT yöntemiyle peptid sentezi Plan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 2:. Peptidlerin sentezini onaylamak için Bromofenol mavisi ile boyandı bir peptit dizisi Örnek , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
p_upload / 52203 / 52203fig3highres.jpg "/>
Şekil 3: peptid dizisi metilasyon deney şeması; peptid dizileri PKMT ile kuluçkalama ile metillenmiş ve uygun tampon maddesi içinde [metil- 3H] -AdoMet etiketlenmiştir. Daha sonra her noktaya transfer radyoaktivite Otoradyografi ile tespit edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Şekil 4: NSD1 PKMT A) H3, şablon olarak (31-49) sırası ile NSD1 için bir alt-tabaka özgüllüğü peptid dizisi Örnek ile elde edilen örnek ile sonuçlanır. yatay ekseni ise, H3 dizisini temsil eder ve dikey eksen gelen satır mutasyona uğramış olan amino asitleri temsil eder. ilk satır ile peptidler içerirorijinal sekansı. B) NSD1 3 bağımsız peptid dizisi metilasyon deneylerden elde edilen sonuçların birleştirilmesi, veri Kudithipudi et gelen çoğaltılmıştır panel B'de gösterilen ortalama metilasyon verileri için standart hataların normalleştirme. C) Dağıtım sonuçta deneylerden elde edilen sonuçlar ortalaması alındı ark. (2014), bazı değişikliklerle 19. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:., Yeni PKMT substratların Keşif A) bir sonraki hedef lisin pozisyonlarındaki amino asit kalıntıları tanınması için NSD1 Ayrımı faktörleri (K36 deneyinde) Burada gösterilen. Eldeki NSD1 -2 p aromatik artıkları tercih olduğunu göstermektedirkonumumuzu (0 konumunda olarak K36 düşünüyor). Hidrofobik kalıntıları ayrıntıları belirgin farklılıklar olsa, -1 ve 2 konumlarında kabul edilmektedir. 1 sahasında temel kalıntılar ve amidler tercih edilir. Diğer sitelerdeki bazı zayıf tercihleri, ancak güçlü bir kalıntı özel okuma tespit edildi. B Scansite bir örnek arama) Ekran, NSD1. C) Peptit SPOT dizi NSD1 pozitif birlikte yüzeylerde birkaç tahmin romanı içeren (H3K36 için belirlenen özgüllük profili kullanılarak ) ve negatif kontroller (H3K36A). Esas yeni hedeflerin bazıları kuvvetle (bazıları açıklamalı) metillenmektedir edildi, diğer durumlarda tahminleri doğrulanamadı. Panel A ve C Kudithipudi ark çoğaltılamaz. (2014), bazı değişikliklerle 19. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Baz | NMP içinde 1 M Oxyma Saf - 15 mi NMP içinde> 2,13 g Oxyma Saf |
| Aktivatör | 2.4 ihtiva eden bir çözeltiye, 15 mi NMP içinde N 'diizopropilkarbodiimid |
| Kapak Kapatma Karışım | DMF içinde% 20 asetik anhidrid - 30 ml DMF içinde> 6 mL asetik anhidrit |
| Fmoc korumasının kaldırılması | DMF içerisinde% 20 piperidin - 1000 ml DMF içindeki> 200 mi |
| Sidechain korumasının kaldırılması | 900 ul triizopropilsilan + 600 ul GKD 2 O 30 ml TFA |
| Boyanma | DMF içinde% 0.02 bromofenol mavisi |
Tablo 1: Kimyasal karışımlar ve protokolde kullanılan onların kompozisyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edildiği gibi SPOT sentezi, protein-protein etkileşimi sitesi harita ve peptit değiştirici enzim alt-tabaka tanıma araştırmak için güçlü bir yöntemdir. SPOT yöntemi ile sentezlenmiş peptitler, bu, her bir durumda teyit etmek zordur% 90'dan daha fazla saflığa 21 için rapor edilmiştir, ancak Ancak, SPOT sentezi, hala bazı dezavantajlara sahiptir. Bu nedenle, sonuçlar örneği kullanılarak protein etki ya da standart yöntemlerle sentezlenebilir saflaştırılmış peptidler ile diğer yöntemler ile tekrar edilmez. Buna ek olarak, SPOT dizilerin diğer önemli dezavantajı, yeniden kullanılamaz en zaman bir dizi çeşitli deneyleri yürütmek için olmasıdır.
Düşük stabilite amino asitler sentez verimi artırmak için, korunan arginin gibi, her 5 çevrim için onları taze hale getirmek için önemlidir. Enzimatik reaksiyonların veya protein bağlayıcı çalışmalarda genellikle peptid nokta çevresi mo olduğu görülmektedirmerkezi ("halka nokta etkisi") den sinyal yoğunluğu yeniden. Bu etki, nokta orta kesiminde peptidlerin yüksek yoğunluğu nedeniyle olabilir ve daha sonra peptit sentezi 22 ölçek küçültme ile çözülebilir. Peptid daha sorun giderme için makine el kitabı sentez ve firma hizmeti danışılmalıdır. Metilasyon gözlenmez varsa, pozitif kontrol peptidi (İnceleme enzim tarafından metillenmiş bilinen örneğin peptitler) membranı ilave edilmelidir.
SPOT diziler alternatif, yüksek yoğunluklu peptid mikro diziler 23 mevcuttur, ancak bunlar daha pahalı ve kullanımı için özel ekipman gerektirir. Ayrıca nokta başına peptid miktarının daha duyarlı okuma prosedürleri gerektiren, daha küçüktür. Protein dizileri de bu işlevleri 24,25 çalışma mevcuttur, ancak her bir protein ifade ve saflaştırılmış ve gerektiğinden onlar hazırlamak daha zordizi protein katlanması muhafaza edilmesi gerekmektedir. Peptid dizilerinin ilave bir avantajı, sentezi sırasında çevrim sonrası modifikasyon mümkündür giriş ve bireysel amino asit kalıntılarının rolüne mutasyon testi kolaylığıdır.
Bu protokol için önemli bir başlangıç noktası, araştırma altındaki bir enzim ile metillenmektedir tanımlanan en az bir peptid, var. Metilasyon durumu ve tamponlar optimize yanı sıra, metiltransferaz konsantrasyonu gerekmektedir. Metilasyon Örnek zamanlı kurslar dinamik aralık kaybına neden olacak en iyi substrat, tam metilasyon önlemek için belirlenmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
