Introduction
Mesenchymal स्टेम सेल (MSCS) पुनर्योजी चिकित्सा और ऊतक इंजीनियरिंग में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं। वे उन्हें ऑटोलॉगस उपचारों 2,3 के लिए आदर्श उम्मीदवार renders, जो विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं एक में अंतर और टीका लगाना, विस्थापित कर सकते हैं। हाल ही में, हड्डी और उपास्थि की मरम्मत के लिए MSCs का उपयोग कर क्लिनिकल परीक्षण, मेजबान रोग या दिल की बीमारी बनाम भ्रष्टाचार 4 का शुभारंभ किया गया। ये MSCs गर्भनाल या वसा ऊतकों से काटा जा सकता है, लेकिन सबसे आशाजनक परिणाम अस्थि मज्जा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं 5 से प्राप्त किया गया।
श्रोणिफलक शिखा अस्थि मज्जा की काफी मात्रा में एकत्र करने के लिए अनुमति देता है और इसलिए आकांक्षा 6 की मुख्य साइट के रूप में कार्य करता है। हालांकि, महाप्राण की गुणवत्ता में वापस ले लिया अस्थि मज्जा की मात्रा बढ़ाने के साथ घट जाती है। अस्थि मज्जा महाप्राण के पहले 5 मिलीलीटर उच्च गुणवत्ता के MSCs होते हैं, वहीं बड़ी मात्रा की वापसी परिधीय रक्त च के साथ महाप्राण के कमजोर पड़ने की ओर जाता हैअत्यधिक vascularized हड्डी 7 रोम। Anticoagulants उपयोग किया जाता है क्योंकि जब तक वर्तमान megakaryocytes और प्लेटलेट्स की, अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस, थक्के होने का खतरा है। लेकिन फिर भी anticoagulants के साथ, थक्के हो सकती है।
अस्थि मज्जा में, MSCs कुल सेल पूल 8 का केवल एक छोटे से अनुपात का प्रतिनिधित्व करते हैं और सबसे ऊतक इंजीनियरिंग या चिकित्सीय अनुप्रयोगों 4 के लिए संस्कृति में विस्तार किया जाना है। इस तरह के एक संस्कृति की गुणवत्ता में काफी हद तक प्रारंभिक सेल पूल, यानी पर निर्भर करता है।, विविधता और एक उच्च प्रारंभिक संख्या 9। निकासी से MSCs की कम संख्या आंशिक रूप से दाता परिवर्तनशीलता से समझाया जा सकता है। दूसरी ओर, कम गुणवत्ता नमूनों से MSCs कोशिकाओं की वांछित संख्या तक पहुंचने के लिए संस्कृति में लंबे समय के लिए और बढ़ा दिया passaging की आवश्यकता होती है। या तो मामले में, विस्तारित passaging सेल वार्धक्य का एक स्रोत है और 10 संभावित भेदभाव की हानि हो सकती है। इसलिए, सेल Y अधिकतम कर सकते हैं कि प्रोटोकॉल अनुकूलितield और हानिकारक प्रभावों 11,12 विकसित किया जाना है से रोका जा सके।
हम कुत्ते MSCs के साथ काम करना शुरू किया जब सौभाग्य से पका मानव नमूने (दस में से एक) लगातार कम थे, हम, के बारे में तीन से चार में कुत्ते अस्थि मज्जा के नमूनों के थक्के निहित है कि देखने के लिए चकित थे। दूसरी ओर यह हम पका नमूनों से MSCs की बहुत कम पैदावार मनाया कि, कोई आश्चर्य की बात थी। पका हुआ नमूनों की आवर्ती मुद्दे को हल करने के लिए, हम resampling की बजाय थ्रांबोलिटिक दवा Urokinase का उपयोग कर प्रोटोकॉल विकसित की है।
थ्रांबोलिटिक उपचारों जैसे दिल का दौरा, स्ट्रोक या क्योंकि अवांछित थक्के की embolisms के कारण रक्त वाहिकाओं की आड़ के रूप में जीवन स्थितियों की धमकी प्रतिक्रिया कर सकते हैं। वे plasmin और enzymatic plasminogen activators द्वारा आतंच के enzymatic दरार के माध्यम से थक्के की गिरावट से काम करते हैं। रोगियों के उपचार के लिए व्यापक उपयोग के बावजूद, केवल बहुत कुछ प्रकाशनों उपयोग किया थ्रांबोलिटिक गतिविधियों कि मौजूदप्रयोगशाला अनुप्रयोगों पका नमूने बचाव करने के लिए, ज्यादातर लिम्फोसाइटों पर केंद्रित थी। 1987 में, निकू एट अल। 13 और चार साल बाद कार्यात्मक लिम्फोसाइटों में जिसके परिणामस्वरूप रक्त के थक्के को भंग करने के लिए streptokinase के उपयोग का वर्णन किया, डी विज़ एट अल। प्रवाह cytometric आवेदनों 14 के लिए रक्त और अस्थि मज्जा से ल्यूकेमिया कोशिकाओं को अलग करने के लिए streptokinase का उपयोग बढ़ाया। एक और अधिक हाल ही में प्रकाशन कैंसर निदान 15 के लिए Alteplase के उपयोग का सुझाव देते हैं। एक ही एंजाइमी दृष्टिकोण का उपयोग करते हैं, हमारे प्रोटोकॉल स्टेम सेल के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए एक उपकरण प्रदान करने के लिए multipotent MSCs फार्म अस्थि मज्जा के अलगाव पर केंद्रित है।
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Protocol
नोट: श्रोणिफलक शिखा से मानव अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस ल्यूसर्न के केंटन की आचार समिति के अनुमोदन के साथ दाताओं सहमति से एकत्र किए गए थे। श्रोणिफलक शिखा से कुत्ते अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस (लगभग। 20 मिलीलीटर) कुत्ते के मालिक के consent.Human साथ एकत्र किए गए थे और कुत्ते (लगभग। 10 एमएल) अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस थे विरोधी जम तुरंत वापसी के बाद 3.8% सोडियम साइट्रेट की 15 मिलीलीटर के अलावा द्वारा आपरेशन थिएटर में। नमूने वापस ले लिया के रूप में एक ही दिन में प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला में पर्यावरण के लिए स्थानांतरित कर दिया गया।
Urokinase 1. तैयारी (पहले एक ST उपयोग करने के लिए)
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) का उपयोग Urokinase पुनर्गठित: एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग पट-इनलेट कुप्पी को 10 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें। मिलीलीटर प्रति 50,000 इंजेक्शन इकाइयों (यू) प्राप्त करने के लिए घूमता द्वारा शुष्क पदार्थ भंग।
- एस में 500 μl aliquots (25,000 यू प्रत्येक) तैयारterile ट्यूबों। स्टोर aliquots -20 डिग्री सेल्सियस और कम से कम छह महीने के लिए जरूरत पड़ने पर इसका इस्तेमाल करते हैं।
2. प्रारंभिक कदम (पहले हर अस्थि मज्जा उपचार के लिए)
- Urokinase की एक विभाज्य पका अस्थि मज्जा महाप्राण प्रति (25,000 यू) (25 मिलीलीटर महाप्राण संस्करणों का सफलतापूर्वक 25,000 यू की एक भी विभाज्य का उपयोग कर इलाज किया गया है) पिघलना।
- 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी के स्नान या मिलाते इनक्यूबेटर पहले से गरम।
थक्का के 3. एंजाइमी डाइजेस्ट
- प्रसंस्करण के दौरान अस्थि मज्जा के नमूनों की माइक्रोबियल संदूषण से बचने के लिए एक लामिना का प्रवाह जैव सुरक्षा कैबिनेट में सब काम करते हैं। संभावित संक्रामक मानव सामग्री के साथ काम करते हैं, सुरक्षात्मक दस्ताने के साथ ही सावधानी से निपटने के उपयोग की सलाह दी है।
- एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर एक 100 माइक्रोन सेल झरनी रखें। ध्यान से छलनी झुकने या थक्का सामग्री के आसपास घूम रहा है, सेल झरनी के माध्यम से अस्थि मज्जा महाप्राण डालना। के लिए एक बाँझ pipet टिप का प्रयोग करेंफिल्टर जाल के माध्यम से बेहतर प्रवाह।
नोट: पीबीएस के साथ थक्का धोने से, जैसे, थक्का के किसी भी कमजोर पड़ने से बचें। Urokinase परोक्ष रूप से कार्य करता है और सीरम के घटकों (यानी।, Plasminogen) प्रभावी डाइजेस्ट के लिए बायोप्सी से की आवश्यकता है। थक्का सामग्री के साथ प्रक्रिया जारी रखते हुए छानना कदम 3.6 में आगे उपयोग करें जब तक आरटी पर रखा जा सकता है। - बाँझ संदंश का उपयोग कर एक खाली सेल संस्कृति डिश में अस्थि मज्जा का थक्का सामग्री हस्तांतरण। लगभग 2 मिमी 3 एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग कर के छोटे टुकड़ों में मलबे काटें।
- बाँझ संदंश का उपयोग कर एक 50 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में थक्का के छोटे टुकड़े स्थानांतरण। कीमा बनाया हुआ थक्का एक गीला उपस्थिति है कि सुनिश्चित करें। यह सूखा होने के लिए प्रकट होता है, गीला करने के लिए 3.1 कदम से छानना में से कुछ का उपयोग करें।
- ऊपर और नीचे pipetting एक 5 मिलीलीटर से microtiter pipet का उपयोग 5 बार के लिए द्वारा थक्का Triturate। नमूने के लिए Urokinase की एक विभाज्य जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर या तो एक पानी के स्नान में या में 30 मिनट के लिए सेतेएक मिलाते हुए (धीरे से) इनक्यूबेटर।
- ऊपर और नीचे pipetting एक 5 मिलीलीटर pipet का उपयोग 5 बार के लिए द्वारा महीन चुर्ण बनाना। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में इस चरण को पूरा करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 30 मिनट के लिए सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, एक 5 मिलीलीटर pipet का उपयोग फिर से 5 बार triturate। 3.2 कदम से छानना के साथ पूल के लिए एक नए सिरे से 100 माइक्रोन सेल झरनी के ऊपर से गुजरती हैं।
- अपकेंद्रित्र 500 x जी पर 10 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर सेल निलंबन। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। नीचे वर्णित या एमएससी विस्तार संस्कृति के लिए अपनी प्रयोगशाला की मानक प्रक्रिया के अनुसार के रूप में मीडिया में सेल गोली फिर से निलंबित।
विस्तार सेल संस्कृति और CFU प्लेटों के लिए 4. सीडिंग
- अल्फा सदस्य 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2.5 मिलीग्राम / एमएल Amphotericin बी के साथ पूरक: बेसल माध्यम के 50 मिलीलीटर में (एरिथ्रोसाइट्स और मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से मिलकर) कोशिकाओं Resuspend । कोशिकाओं को एक Neubauer chambe का उपयोग कर Trypan ब्लू समाधान में पतला 01:10 गणनाआर।
- 5 10 x 7 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व में सेल संस्कृति बोतल में कोशिकाओं की थाली और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में सेते हैं। यदि उपलब्ध है, hypoxic (5% ऑक्सीजन) की स्थिति का उपयोग करें। CFU परख नियंत्रण के लिए, 10 सेमी व्यास का एक सेल संस्कृति डिश में 10 9 कोशिकाओं थाली।
- अन्य कोशिकाओं निलंबन में रहते हैं, जबकि संस्कृति के तीन दिनों के बाद, mesenchymal स्टेम सेल सेल संस्कृति पकवान से जुड़े होते हैं। 5 एनजी / एमएल बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF के) के साथ पूरक बेसल मध्यम के साथ मीडिया बदलें। CFU परख नियंत्रण के लिए, इसी तरह सेल संस्कृति डिश का इलाज।
- मीडिया में तीन बार एक सप्ताह का आदान प्रदान, 2 सप्ताह के कुल के लिए सेल संस्कृति को जारी रखें। कोशिकाओं 80 confluency% से अधिक है, trypsinization द्वारा विभाजित। CFU परख नियंत्रण के लिए, वैसे ही मीडिया का आदान-प्रदान, लेकिन दो सप्ताह के पाठ्यक्रम के लिए कोशिकाओं को विभाजित नहीं है।
CFU परख के लिए 5. Giemsa दाग
- पकवान प्रति Giemsa-समाधान के 10 मिलीलीटर की तैयारी: दिलUTE शेयर समाधान (ग्लिसरॉल में 7.6 ग्राम / एल Giemsa: मेथनॉल) 01:10 बाँझ पानी में (हमेशा एक ताजा काम कर कमजोर पड़ने को तैयार)।
- सेल संस्कृति डिश से मीडिया निकालें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। पेट्री डिश के लिए तरल आवेदन करते समय बहुत precautious हो सकता है और कोशिकाओं को धोने के लिए रवाना करने से बचें।
- आरटी पर 5 मिनट के लिए शुद्ध मेथनॉल में कोशिकाओं को ठीक करें। मेथनॉल त्यागें। Giemsa-समाधान जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में 60 मिनट के लिए सेते हैं।
- पीबीएस के साथ दो बार धोएं। एयर एक कागज तौलिया पर पहली थाली सिर सूखी। मैन्युअल रूप से कालोनियों गणना। यह सबसे अच्छा थाली की पीठ पर एक मार्कर पेन का उपयोग कर हासिल की है।
6. एमएससी भेदभाव
- कुत्ते MSCs भेदभाव
नोट: कुत्ते MSCs चार सप्ताह के लिए उपयुक्त मीडिया के साथ उत्तेजना से chondrogenic, osteogenic और adipogenic प्रजातियों में भेदभाव कर रहे थे। - के लिए Adipogenic भेदभाव, 4 एक्स 10 5 सीई पर monolayer में संस्कृति MSCsइस प्रकार के रूप LLS / 2 सेमी दो अलग-अलग संस्कृति की स्थिति बारी;
- DMEM + GlutaMAX, 3% FBS के, 100 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / Amphotericin बी और 170 मिमी इंसुलिन युक्त adipogenesis रखरखाव मीडिया में संस्कृति।
- 3% FBS के, 5% खरगोश सीरम, 1 माइक्रोन dexamethasone के साथ पूरक रखरखाव माध्यम के साथ adipogenesis उत्प्रेरण मीडिया में संस्कृति, 500 माइक्रोन 3-Isobutyl-1-methylxanthine, 33 माइक्रोन बायोटिन, 5 माइक्रोन रोसिग्लिटाज़ोन और 16 से 17 माइक्रोन Pantothenate।
- तेल लाल-ओ के साथ धुंधला द्वारा लिपिड बूंदों आनंद लेना। संक्षेप में, 10% formaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक पीबीएस के साथ धोने और isopropanol में 0.35% तेल लाल ओ के साथ दाग।
- 7 एक्स 10 3 कोशिकाओं / 2 सेमी और निम्नलिखित में उत्तेजित पर monolayer में osteogenic भेदभाव संस्कृति MSCs के लिए:
- उन्नत DMEM (Gibco) + GlutaMAX, 5% FBS के, 100 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / Amphotericin बी, 501, एम एल ascorbic एसिड 2-फॉस्फेट, 10 मिमी एसएस glycerophosphate और 100 एनएम dexamethasone।
- वॉन Kossa दाग (5% Agno 3) द्वारा खनिज जमाओं को पहचानें। संक्षेप में, 10% formaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक 5% आसुत जल में Agno 3 के साथ पीबीएस और दाग से धो लें।
- Chondrogenic भेदभाव
- एक स्पंज आकार चिकित्सा उपकरण से कट क्यूब्स (पक्ष के अनुसार 3 मिमी), lyophilized कोलेजन प्रकार मैं से गठित, और कोशिकाओं 17 का समर्थन करने के पाड़ सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया।
- 4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल (~ 70,000 कोशिकाओं / घन) की एकाग्रता पर क्यूब्स के शीर्ष पर बीज MSCs।
- मीडिया के अलावा करने से पहले, कोशिकाओं 30 मिनट के लिए क्यूब्स का पालन करने की अनुमति देते हैं।
- DMEM / F12 + GlutaMAX, 2.5% FBS के, 100 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / Amphotericin बी, 40 एनजी / एमएल dexamethasone, 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / एस्कॉर्बिक से मिलकर chondrogenic मीडिया में एमएससी-कोलेजन निर्माणों बनाए रखें एसिड 2-फॉस्फेट,50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / एल प्रोलाइन, 1x इंसुलिन transferrin-सेलेनियम एक्स, और वृद्धि कारक-β1 बदलने 10 एनजी / एमएल।
- निर्माणों वर्गों में proteoglycans के संचय कल्पना करने के लिए alcian नीले धुंधला का प्रयोग करें। संक्षेप में, 0.01% एच 2 अतः 4 और 0.5m guanidine हाइड्रोक्लोराइड में भंग 0.4% alcian नीले रंग के साथ वर्गों हे / एन दाग। अगला, धोने वर्गों में 40% DMSO और 0.05M 2 MgCl में 30 मिनट के लिए धोया गया। प्रकोष्ठों परमाणु तेज लाल के साथ counterstained थे।
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Representative Results
साथ-साथ वे हमारी प्रयोगशाला (चित्रा 1 ए) में आ गया जब कुत्ते अस्थि मज्जा के नमूनों का 74% (एन = 54) के थक्के कि निहित तथ्यों हमें MSCs की काफी संख्या के थक्के के अंदर फंस गया था कि विश्वास दिलाया, इन नमूनों से एमएससी की पैदावार में कमी आई । दरअसल, sectioned थक्का सामग्री का एक सरल DAPI के दाग उच्च घनत्व (चित्रा 1 बी) में एकल कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करता है। यह अंततः Urokinase का उपयोग कर प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए हमें ट्रिगर जो विस्तार संस्कृति के लिए उपलब्ध MSCs की कम संख्या की ओर जाता है। आम तौर पर हमारे प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए जब लगभग पूरी तरह से गायब हो जाते हैं थक्के। हालांकि, विधि विकास के दौरान हम थक्का के सवाल से पहले वजन द्वारा और पचाने के बाद योजनाबद्ध तरीके से पचाने को संबोधित किया। इन प्रयोगों पचाया शेष 15% (कुत्ता) या प्रारंभिक थक्का वजन (2A चित्रा) के 9% (मानव) थे कि पता चला।
MSCs व्युत्पन्न अस्थि मज्जा की एक खास विशेषता एक हैसाख सेल संस्कृति व्यंजन का पालन करना। शोधकर्ताओं MSCs के लिए चयन करने के लिए इस विशेषता का उपयोग करते हैं। एक परिणाम के रूप में, परख के गठन के लिए एक कॉलोनी में एक सरल, मात्रात्मक और विश्वसनीय तरीके से सेल पूल की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है। हमारी प्रयोगशाला में, यहाँ बताया कॉलोनी बनाने परख संसाधित सभी अस्थि मज्जा नमूने (भी गैर-पका वाले) के लिए नियमित रूप से लागू किया गया है। यह हमें Urokinase डाइजेस्ट की प्रभावकारिता का निर्धारण करने के लिए मुख्य कसौटी के रूप में परख का उपयोग करने की अनुमति दी। प्रत्यक्ष तुलना, पका नमूना filtrates से कोशिकाओं को अनुमति देने के लिए (यानी पका नमूने सिर्फ फ़िल्टर्ड लेकिन enzymatically इलाज नहीं थे) और थक्के दो सप्ताह के लिए ऊष्मायन द्वारा पीछा अलग 10 सेमी व्यंजन पर वरीयता प्राप्त थे पच। (चित्रा 2B में दिखाया गया है) Giemsa दाग के साथ कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) visualizing करते हैं, तो हम इसी प्रारंभिक filtrates (चित्रा -2) से तुलना कुत्ते नमूनों की Urokinase प्रतिक्रियाओं से 3.8 गुना अधिक CFU मनाया। Although कम प्रमुख, मानव नमूने प्रोटोकॉल की उपयुक्तता की पुष्टि, इलाज के नमूने से 1.6 गुना अधिक CFU के साथ एक इसी तरह की प्रवृत्ति का पालन किया। दरअसल, चित्रा 2B में सही पंक्ति में सचित्र पच थक्का की प्लेटें एक जमा नमूना के लिए देखा ठेठ परिणाम के अनुरूप हैं। हालांकि, दाता भिन्नता आसानी से दर्शाया जाता है की डबल करने के लिए आधे से CFU संख्या में हो सकता है।
प्लेटों filtrates से CFU (चित्रा -2) की तुलना में थक्के से वरीयता प्राप्त पर सेल पूल गुणवत्ता का सूचक है, और अधिक मध्यम (2-5 मिमी) और बड़े रूप में कॉलोनी आकार ले रहा है (> 5 मिमी) कालोनियों दिखाई दिया। यह आम तौर पर MSCs Urokinase उपचार के बाद सामान्य रूप से बढ़ने का संकेत है कि। इसके अलावा थक्का बिना नमूने के लिए कुल, पच कुत्ते नमूनों की तुलना (एन = 21) में (एन = 7) एक बड़ा अंतर-नमूना विभिन्नता विषम दाता जनसंख्या की वजह से मनाया गया, हालांकि इलाज के नमूने के लिए कुल MSCs के तुलनीय संख्या झुकेंगे (चित्रा2 डी)।
उपयुक्तता की एक अंतिम कार्यात्मक परीक्षण के रूप में, हम पचा अस्थि मज्जा के नमूनों से व्युत्पन्न MSCs के भेदभाव प्रेरित किया। ऑटोलॉगस स्टेम सेल उपचार में आवेदन उपास्थि, हड्डी या वसा ऊतकों या 18 सिगनल एमएससी पैराक्राइन में एमएससी भेदभाव पर आधारित हैं। प्रकोष्ठों adipogenic भेदभाव 19 osteogenic भेदभाव 20 या chondrogenic वंश 17 के लिए उपयुक्त संस्कृति शर्तों का चयन करके भेदभाव के वांछित पथ की ओर निर्देशित किया जा सकता है। इसलिए, हम अस्थि मज्जा का थक्का से unclotted अस्थि मज्जा नमूना से निकाली गई MSCs को MSCs की तुलना में। संस्कृति में चार सप्ताह के बाद, यह सब तीन ऊपर उल्लेख किया प्रजातियों में MSCs अंतर करने के लिए संभव था। इस histologically, वॉन Kossa (osteogenic वंश के लिए) के साथ परीक्षण किया गया था समूहों के बीच भेदभाव की कक्षा में कोई मतभेद नहीं दिखा तेल रेड हे (adipogenic) और Alcian ब्लू (chondrogenic) stainings, ( 
चित्रा 1. अस्थि मज्जा के थक्के। आगमन (ए) पर आंशिक रूप से पका हुआ राज्य में कुत्ते और मानव अस्थि मज्जा के नमूनों का प्रतिशत। इसके अलावा, हम पका नमूनों से एमएससी की पैदावार जोरदार कारण थक्के के अंदर फंस कोशिकाओं के एक उच्च संख्या कम हो गई थी कि पाया। एकल कोशिकाओं के एक उच्च संख्या एक कुत्ते अस्थि मज्जा का थक्का (बी) से एक cryosection की DAPI धुंधला द्वारा प्रदर्शन के रूप में थक्के के भीतर मौजूद हैं। स्केल बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। 
Urokinase के साथ पचा अस्थि मज्जा के थक्के से MSCs 2. अलगाव चित्रा। (ए) आमतौर पर, अस्थि मज्जा के थक्के Urokinase डाइजेस्ट पर लगभग पूरी तरह से गायब हो जाते हैं।विधि विकास पर, हम (एन = 5, ≤0.01 पी **, एसडी ± मतलब है) और मानव नमूनों कुत्ते के लिए थक्का भार का आकलन (एन = 3, एसडी ± मतलब, एन एस = नहीं महत्वपूर्ण पी = 0.10) दृढ़ता पर कम हो गई थी कि Urokinase डाइजेस्ट। (बी) के एक साधारण CFU परख एक एमएससी तैयारी की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए एक जानकारीपूर्ण उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं। डाइजेस्ट की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए, CFU परख अलग से अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस से filtrates और पचा थक्के के लिए प्रदर्शन किया था। संस्कृति में दो सप्ताह के बाद, 10 सेमी नियंत्रण प्लेटें Giemsa साथ दाग रहे थे और CFU गिना रहे थे। परख CFU की उच्च संख्या को पचाने और कार्यात्मक रहना Urokinase द्वारा थक्का से रिहा किया जा सकता है कि पुष्टि की। यह भी बड़ी कालोनियों (कक्षा-डिवीजन के उच्च आवृत्ति द्वारा पुष्टि की है। काले रंग में> 5 मिमी, गहरे भूरे रंग में 2-5 मिमी और हल्के भूरे रंग में <2 मिमी त्रुटि सलाखों के कुत्ते के लिए एन = 5 (कुल CFU के एसडी प्रतिनिधित्व n = मानव के लिए 3, पी ** ≤0.01, एन एस = नहीं महत्वपूर्ण, पी = 0.17)। (सी) चित्रGiemsa से सना हुआ प्लेटों से एस दिखाया परिणामों की पुष्टि करें। पचा थक्का के लिए दिखाया प्लेटें एक पच अस्थि मज्जा नमूना के लिए एक विशिष्ट परिणाम के अनुरूप - हालांकि, संख्या दाता परिवर्तनशीलता के लिए बड़े पैमाने पर होने के कारण अलग-अलग हो सकते हैं। संक्षेप में (डी), Urokinase स्वाभाविक रूप से थक्का मुक्त नमूनों (एन = 7, एसडी ± मतलब है) करने के लिए विस्तार संस्कृति के बाद तुलनीय कुल एमएससी पैदावार में (एन = 21) परिणाम प्रोटोकॉल पचाने आवेदन। पूरे चित्रा 2 के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी -test उपयोग किया गया था। 
नेटिव रूप unclotted नमूने बनाम पच के भेदभाव की क्षमता का चित्रा 3. तुलना। Urokinase (शीर्ष पंक्ति) और unclotted अस्थि मज्जा (नीचे पंक्ति) के साथ इलाज पका अस्थि मज्जा से अलग कैनाइन MSCs osteogenic फेनोटाइप में भेदभाव और वॉन Kossa (बार = द्वारा दाग रहे थे200 माइक्रोन), adipogenic फेनोटाइप से सना हुआ था तेल रेड हे (बार = 100 माइक्रोन; insets वसा रिक्तिकाएं का बड़ा बढ़ाई में), उपास्थिजनन Alcian नीले धुंधला द्वारा पता चला था जबकि (बार = 100 माइक्रोन, परमाणु तेज लाल counterstaining)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
रोगी केवल थोड़ा अतिरिक्त काम आपरेशन थिएटर में कर्मियों द्वारा किया जा करने के लिए है कि लाभ के साथ, (हमारे मामले में मुख्य रूप से रीढ़ की हड्डी की सर्जरी में) सर्जरी के दौर से गुजर रहा है, जबकि नियमित रूप से हम अस्थि मज्जा नमूना। नमूने तुरंत वापसी के बाद सोडियम साइट्रेट के साथ मिश्रित कर रहे हैं, भले ही वे प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला में आ गया है, जब कई नमूने आंशिक रूप से पका रहे थे। इस स्तर पर, पका नमूनों को बदलने के लिए resampling एक अलग अतिरिक्त हस्तक्षेप फिर स्थानीय या सामान्य संज्ञाहरण 6 की जरूरत महसूस होगी। इस योगदान के लिए चिकित्सीय स्टाफ और दाता दोनों की इच्छा की आवश्यकता है और संसाधनों 21 की एक बहुत सेवन करती है।
यहाँ हम multipotent MSCs अलग करने के लिए पका अस्थि मज्जा के नमूनों पर पुनः संयोजक मानव Urokinase का उपयोग करता है कि एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम Urokinase उपचार कोशिकाओं को नुकसान नहीं करता और भेदभाव संभावित बनाए रखा है कि प्रदर्शन कर सकता है। प्रोटोकॉलतुलनीय सेल पूल से बेदखल करते हुए unclotted नमूनों की तुलना में यह केवल लगभग 1 आधा घंटा से नमूना प्रसंस्करण prolongs के बाद से कम है। तिथि करने के लिए, इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक कई बहुत से Urokinase का उपयोग कर विभिन्न व्यक्तियों और कुत्तों से अस्थि मज्जा के थक्के पर लागू किया गया है और मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सफलता दिखाया गया है। इसके अलावा, Urokinase नमूना आंतरिक plasminogen के सक्रियण के माध्यम से परोक्ष रूप से कार्य करता है। इस Urokinase प्रतिक्रिया प्लाज्मा वातावरण की आवश्यकता है कि निकलता है। यह उदाहरण के लिए, पीबीएस के साथ थक्का से rinsing या एक जैसे के इस कदम को पेश करने के लिए इसलिए unadvisable है। इस सीरम पर्यावरण पतला और enzymatic प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण धीमी गति से नीचे के लिए नेतृत्व करेंगे।
निर्णय हमारे विधि के लिए Urokinase उपयोग करने के लिए नहीं है और एक और थ्रांबोलिटिक दवा तुच्छ था: हम हमारे अस्पताल फार्मेसी में आसानी से उपलब्ध थ्रांबोलिटिक दवा पर आधारित प्रोटोकॉल विकसित की है। अन्य अनुसंधान समूहों के लिए यह इसलिए एक ऊतक typ के उपयोग करने के लिए आसान हो सकता हैई plasminogen उत्प्रेरक (यानी।, alteplase, reteplase या tenecteplase की तरह एक अलग दवा उत्पाद) Urokinase उपलब्ध नहीं है। हालांकि, दवाओं के बीच संभावित महत्वपूर्ण मतभेद मौजूद हैं: Urokinase प्रकार plasminogen उत्प्रेरक रिसेप्टर (upar) 22 करने के लिए बाध्य है जब ऊतक प्रकार plasminogen activators के विपरीत, Urokinase सेल सक्रियण और प्रसार को गति प्रदान कर सकते हैं। बाध्यकारी पर, intracellular संकेतन Cascades सेल प्रवास और प्रसार करने के लिए कि नेतृत्व सक्रिय कर रहे हैं। एक शारीरिक स्थिति में यह आगे सक्रिय कोशिकाओं द्वारा मैट्रिक्स metalloproteinases के स्राव द्वारा समर्थित है। हालांकि, हमारी प्रणाली में, Urokinase पतला है और धीरे-धीरे हानिकारक प्रभाव दिखाने के बिना विस्तार संस्कृति पर हटा दिया। फिर भी, अलग MSCs के उद्देश्य का उपयोग करने के लिए सम्मान के साथ, थ्रांबोलिटिक दवाओं में से किसी की उपयुक्तता व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।
आम तौर पर, तेजी से और पूरी थक्का डाइजेस्ट के लिए उच्च dosages मील के लिए सिफारिश कर रहे हैंथक्का प्रसंस्करण के दौरान अवांछित चयन nimize। उल्लेखनीय है, कई पिछले अध्ययनों रक्त और अस्थि मज्जा के थक्के 13,14 पचाने के लिए जीवाणु streptokinase इस्तेमाल किया। हालांकि, इस दवा के अवांछित सक्रियण और मरीजों के लिए कोशिकाओं के आवेदन का इरादा है जब विशेष रूप से एक बड़ी खामी हो सकती है, जो प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया भड़काने सकता है।
इसलिए हम अपने प्रोटोकॉल केवल समय की बचत और लागत को कम करने के लिए शोधकर्ताओं और चिकित्सा पेशेवरों की मदद नहीं करता है कि विश्वास करते हैं। Urokinase का उपयोग करना - एक अनुमोदित एंजाइमी दवा जाना जाता प्रतिजनकता बिना - यहां तक कि एमएससी तैयारी के चिकित्सकीय प्रयोग पर निशाना कई शोधों प्रयोगशालाओं के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण उपलब्ध करा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
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