Introduction
Mezenkimal kök hücreler (MKH) rejeneratif tıp ve doku mühendisliğinde önemli bir rol oynamaktadır. Onlara otolog tedaviler 2,3 için ideal bir aday kılan, hangi çeşitli hücre tipleri 1 içine ayırt ve aşılamak, göç edebilir. Son zamanlarda, kemik ve kıkırdak onarımı için MKH'lerin kullanarak klinik çalışmalarda, host hastalığı veya kalp hastalığı greft versus 4 başlatıldı. Bu MSC'ler göbek kordonu ya da yağ dokusu hasat edilir, ancak en fazla umut vaat eden sonuçlar kemik iliğinden elde edilen kök hücreleri 5 elde edilmiştir.
iliak kemik iliği önemli miktarda toplamak için izin verir ve bu nedenle aspirasyon 6 ana site olarak hizmet vermektedir. Ancak, aspirat kalitesi çekilen kemik iliği hacmini artması ile azalmaktadır. Kemik iliği aspirasyon ilk 5 ml kaliteli MKH'lerin ihtiva ederken, daha büyük hacimli çekilmesi periferik kan f aspirat seyreltme yol açarçok kanlanan kemik 7 rom. Antikoagülan kullanıldığı sürece Çünkü mevcut megakaryositlerin ve trombosit, kemik iliği aspirasyon, pıhtılaşma yatkındır. Ama bile antikoagülan, pıhtıları oluşabilir.
Kemik iliğinde, MKH toplam hücre havuzunun 8 sadece küçük bir kısmını temsil ve birçok doku mühendisliği veya terapötik uygulamalar 4 kültür genişletilmiş gerekir. Böyle bir kültürün kalitesi büyük ölçüde ilk hücre havuzu, yani bağlıdır., çeşitlilik ve yüksek başlangıç numarası 9. Çekme gelen MKH Düşük sayılar kısmen donör değişkenliği ile açıklanabilir. Diğer taraftan, düşük kaliteli örneklerinden MKH hücre istenilen sayıda ulaşmak için kültürde uzun süre ve genişletilmiş Pasajlanması gerektirir. Her iki durumda da, uzun pasajı hücre yaşlanmasının kaynağıdır ve 10, potansiyel farklılaşmanın aşamalı olarak kaybına yol açabilir. Bu nedenle, hücre y maksimize protokolleri optimizeield ve zararlı etkileri 11,12 geliştirilmesi gerekmektedir engellemek.
Biz köpek MSC ile çalışmaya başladığında neyse pıhtılaşmış insan örnekleri (on bir) daha az sıklıkta iken, biz, yaklaşık üç dört köpek kemik iliği örnekleri pıhtıları içerdiğini görmek için şaşkın. Öte yandan biz pıhtılaşmış örneklerinden MKH çok daha düşük verim gözlenen, hiçbir sürpriz oldu. Pıhtılaşmış numuneler tekrarlanan sorunu çözmek için, biz yeniden örnekleme yerine trombolitik ilaç urokinez kullanarak protokolü geliştirdi.
Trombolitik tedavi, kalp krizi, felç nedeniyle veya istenmeyen pıhtılaşma embolileri neden kan damarlarının tıkanması gibi hayatı tehdit eden durumları ortadan edebilirsiniz. Onlar plazmin ve enzimatik plazminojen aktivatörleri ile fibrin enzimatik bölünme yoluyla pıhtıların bozulması ile çalışır. Hastaların tedavisi için geniş kullanım rağmen, sadece çok az yayın çok kullanılan trombolitik faaliyetler olduğunu varLaboratuvar uygulamaları pıhtılaşmış numuneler kurtarmak için, çoğunlukla lenfositler üzerinde duruluyor. 1987 yılında, Niku ve ark. 13 ve dört yıl sonra fonksiyonel lenfosit sonuçlanan kan pıhtıları eriterek streptokinaz kullanımını tarif De Vis ark. Akış sitometri uygulamaları 14 kan ve kemik iliğinden lösemi hücreleri izole etmek için streptokinaz kullanımı genişletilmiş. Daha yeni bir yayın kanser teşhisinde 15 Alteplaz kullanımını önermektedir. Aynı enzimatik yaklaşımı kullanırken, bizim protokol kök hücre alanındaki araştırmacılar için bir araç sağlamak için multipotent MKH formu kemik iliği izolasyonu üzerinde duruluyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: iliak İnsan kemik iliği aspirasyon Lucerne kantonunda etik kurul onayı ile donör rıza toplanmıştır. Iliak gelen köpek kemik iliği aspiratlan (yakl. 20 mL) ile köpek sahibinin consent.Human ile toplandı ve köpek (yaklaşık. 10 mi), kemik iliği aspiratları, anti-pıhtılaşmış hemen kesilmesinden sonra,% 3.8 sodyum sitrat solüsyonu, 15 ml ilave edilerek ameliyathanede. Numuneler geri aynı gün işleme laboratuar ortamına transfer edilmiştir.
Urokinaz 1. Hazırlama (önce 1 st Kullanımı)
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile ürokinaz sulandırın: 10 ml'lik bir şırınga kullanılarak, septum-giriş şişeye 10 ml PBS ekleyin. Ml başına 50.000 enjeksiyon üniteleri (U) elde etmek için dönen kuru madde çözülür.
- S içine 500 ul alikotları (25.000 U her) hazırlanmasıterile tüpler. Mağaza alikotları -20 ° C ve en az 6 ay için gerekli olan zaman kullanın.
2. Hazırlama Adımları (Önceki Her Kemik İliği Tedavisi)
- Ürokinaz bir kısım pıhtılaşmış kemik iliği aspiratı başı (25,000 U), (25 ml aspirasyon hacmi başarıyla 25000 U, tek bir kısım ile tedavi edilmiştir) çözülme.
- 37 ° C su banyosu veya sallayarak inkübatör ısıtın.
Pıhtısı 3. Enzimatik Digest
- Işleme sırasında kemik iliği örneklerinin mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için bir laminer akış biyogüvenlik kabininde tüm çalışmaları gerçekleştirin. Potansiyel bulaşıcı insan malzeme ile çalışırken, koruyucu eldiven yanı sıra dikkatli taşıma kullanımı tavsiye edilir.
- Bir steril 50 ml tüp üstünde bir 100 um hücre süzgecinden yerleştirin. Dikkatle süzgeç eğerek veya pıhtı malzemesinin dolaşırım, hücre süzgecinden kemik iliği aspiratını dökün. Için steril bir pipet ucu kullanarakFiltre örgü ile daha iyi akış.
NOT: PBS ile pıhtı yıkanmasıyla, örneğin, pıhtı herhangi bir seyreltme kaçının. Urokinaz dolaylı hareket ve serum bileşenlerini (yani., Plazminojen) etkili sindirmek için biyopsi gerektirir. Pıhtı malzeme ile işlem devam ederken, filtre ürünü adım 3.6 de kullanılana kadar oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. - Steril forseps kullanarak boş bir hücre kültürü çanak içine kemik iliği pıhtı malzemeyi aktarın. Yaklaşık 2 ile 3 mm Steril bir bisturi bıçağını kullanarak küçük parçalar halinde çöpleri kesilir.
- Steril pensler kullanılarak 50 ml'lik bir reaksiyon tüpüne pıhtı küçük parçalar aktarın. Kıyılmış pıhtı ıslak görünüme sahiptir emin olun. Kuru görünüyorsa, nemlendirmek için adım 3.1 den bazı süzülen kullanın.
- Yukarı ve aşağı pipetleme 5 ml mikrotitre pipet kullanarak 5 kez ile pıhtı çiğnemek. Örnek ürokinazın 1 kısım ekleyin. 37 ° C'de ya da bir su banyosunda ya da 30 dakika boyunca inkübe edinBir sallayarak (hafifçe) inkübatör.
- Yukarı ve aşağı pipetleme 5 ml pipet kullanarak 5 kez ile triturate. Bir biyogüvenlik kabini bu adımı gerçekleştirin. 37 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, 5 ml'lik bir pipet kullanılarak 5 kez çiğnemek. Adım 3.2 filtrata ile havuz taze 100 mikron hücre süzgeç üzerinden geçmek.
- Santrifüj 500 x g'de 10 dakika süre ile oda sıcaklığında hücre süspansiyonu. Süpernatantı atın. Aşağıda açıklanan veya MSC genişleme kültürü için laboratuvar standart prosedüre göre medya hücre pelet yeniden askıya.
Genişleme Hücre Kültürü ve CFU Tabaklar 4. Tohumculuk
- Alfa-MEM,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin ve 2.5 mg / ml amfoterisin B ile desteklenmiş: bazal ortam, 50 ml (eritrositler ve mononükleer hücrelerinden oluşan) hücreler yeniden süspanse . hücreleri bir Neubauer Chambe kullanarak Tripan Mavi çözeltisi içinde seyreltilmiş 01:10 Sayısır.
- 5 x 10 7 hücre / cm2 yoğunluğunda, hücre kültürü şişelerinde, hücreler plaka ve 37 ° C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde inkübe edilir. Varsa, hipoksik (% 5 oksijen) koşulları kullanın. CFU tahlili kontrolü için, 10 cm çapında bir hücre kültürü çanağı içinde 10 9 hücreleri plaka.
- Diğer hücreler, süspansiyon devam ederken, kültür, 3 gün sonra, mezenkimal kök hücreler, hücre kültür kaplarına eklenir. 5 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile desteklenmiş bazal ortam maddesi ile ortam kullanın. CFU tahlili kontrolü için, aynı şekilde hücre kültürü çanak davranın.
- Ortam haftada üç kez değiş tokuş, 2 haftada bir toplam hücre kültürü devam edin. Hücreler% 80 confluency aşarsanız, tripsinizasyonla bölünmüş. CFU tahlili kontrolü için, aynı şekilde medya alışverişi, ancak iki hafta kurs için hücreleri bölmek değil.
CFU tahlili için 5. Giemsa
- Tabak başına Giemsa çözeltisi 10 ml hazırlayın: İnceltilmişute stok solüsyonu (gliserol 7.6 g / l Giemsa: metanol) 01:10 steril su (her zaman taze bir çalışma seyreltme hazırlamak).
- Hücre kültürü çanak ortamı çıkarın ve PBS ile hücreleri yıkayın. Petri sıvı uygulanırken çok temkinli olun ve hücreleri yıkama kapalı kaçının.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca saf metanol içinde hücreleri saptamak. Metanol atın. Giemsa çözeltisi ilave edin ve 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, 60 dakika boyunca inkübe edin.
- PBS ile iki kez yıkanır. Hava bir kağıt havlu üzerine ilk plaka kafasını kurulayın. Elle kolonileri sayın. Bu, en iyi plakanın arkasında bir işaretleyici kalem kullanılarak elde edilmektedir.
6. MSC Farklılaşma
- Köpek MKH farklılaşma
NOT: Köpek MKH dört hafta için uygun medya ile stimülasyonu ile kondrojenik, osteojenik ve adipojenik soy içine ayırt edildi. - Için Adipogenic farklılaşma, 4 x 10 5 ce de tek tabaka kültür MKHaşağıdaki gibi rf / cm 2, iki farklı kültür koşulları alternatif;
- DMEM Glutamax,% 3 FBS, 100 ünite / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin, 2.5 ug / ml amfoterisin B ve 170 mM insülin içeren adipogenesis muhafaza ortamında kültürü.
- 3,% FBS,% 5 tavşan serumu, 1 uM deksametazon ile desteklenen koruma aracına sahip adipogenesis indükleyici ortamdan Kültür, 500 uM 3-izobutil-1-metilksantin, 33 uM biyotin, 5 uM roziglitazon ve 16 17 uM pantotenat içerebilir.
- Yağ Kırmızı O ile boyanarak lipid damlacıkları Revel. Kısaca,% 10 formaldehid ile hücrelerin tespit PBS ile yıkayın ve izopropanol içinde% 0.35 yağ-kırmızı O ile boyanır.
- 7 x 10 3 hücre / cm2 ve aşağıdaki teşvik de tek tabakalı Osteogenik farklılaşma kültür MSC'ler için:
- Gelişmiş DMEM (Gibco) + GlutaMAX,% 5 FBS, 100 ünite / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin, 2.5 ug / ml amfoterisin B, 501 M L-askorbik asit 2-fosfat, 10 mM beta-gliserofosfat, 100 nM deksametason.
- Von Kossa leke (% 5 AgNO 3) ile mineralizasyon mevduat belirleyin. Kısaca,% 10 formaldehid ile hücrelerin tespit% 5 damıtılmış su içinde iyodinin 3 ile PBS ve leke ile yıkayın.
- Kondrojenik farklılaşma
- Bir sünger şeklindeki tıbbi cihazdan Kesme küpleri (her iki tarafta da, 3 mm), liofilize kollajen tip I'den oluşturulur ve hücreler 17 desteklemek için iskele malzemesi olarak kullanılır.
- 4 x 10 6 hücre / ml (~ 70,000 hücre / küp) konsantrasyonda küpler üzerine Tohum MSC'ler.
- Ortam eklenmesinden önce, hücreler 30 dakika boyunca küp uymak için izin verir.
- DMEM / F12 + Glutamax,% 2.5 FBS, 100 ünite / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin, 2.5 ug / ml amfoterisin B, 40 ng / ml deksametazon, 50 ug / ml askorbik oluşan kondrojenik ortam MSC-kollajen yapıları korumak asit 2-fosfat,50 ug / ml L-prolin, 1x İnsülin-Transferrin-Selenyum X ve büyüme faktörü-β1 transforme 10 ng / ml olmuştur.
- Yapılar bölümlerde proteoglikanlarla birikimini görselleştirmek için alcian mavi boyama kullanın. Kısaca,% 0.01 H 2SO 4 ve 0.5 M guanidin hidroklorür içinde çözülmüş% 0.4 alcian mavisi ile bölümlere göre O / N leke. Daha sonra, yıkama bölümleri% 40 DMSO ve 0.05 M MgCl2 30 dakika boyunca yıkanmıştır. Hücreler nükleer fast red ile zıt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ile birlikte onlar bizim laboratuvar (Şekil 1A) geldi köpek kemik iliği örneklerinin% 74 (n = 54) pıhtıları içerdiği gerçekler bize MKH önemli sayıda pıhtıları içinde tuzağa inanıyorum yaptı, bu örneklerden MSC verimi düşmüştür . Gerçekten de, kesit pıhtı malzemesinin basit bir DAPI leke yüksek yoğunluklu (Şekil 1B) çekirdekli hücrelerin varlığını teyit eder. Bu sonuçta urokinez kullanarak protokolü geliştirmek için bize tetikleyen genişleme kültürü için mevcut MSC düşük sayılar, yol açar. Genellikle bizim protokol uygulanırken neredeyse tamamen yok pıhtılarını. Ancak, yöntem geliştirme sırasında pıhtı sorunu önce tartılarak ve sindirmek sonra sistematik sindirmek ele. Bu deneyler sindirilmemiş kalanları% 15 (köpek) veya ilk pıhtı ağırlığı (Şekil 2A) 9 (% insan) olduğunu ortaya çıkardı.
MKH kemik iliğinden elde edilen tipik özelliği olanbility hücre kültürü yemekleri uymak için. Araştırmacılar MSC için seçmek için bu özelliğinden faydalanmak. Bunun bir sonucu olarak, deneyi oluşturan bir koloni, basit, nicel ve güvenilir bir şekilde hücre havuzu kalitesini değerlendirmek için izin verir. Laboratuvarımızda, burada açıklanan koloni oluşturan deneyi işlenen tüm kemik iliği örneklerinde (non-pıhtılaşmış olanlar) rutin uygulanmıştır. Bu bize ürokinazın sindirmek etkinliğini belirlemek için ana kriter olarak tahlil kullanmak için izin. Doğrudan karşılaştırma, pıhtılaşmış örnek süzülen hücreleri izin vermek için (yani pıhtılaşmış örnekler sadece süzüldü fakat enzimatik tedavi edilmediği takdirde gibi) ve pıhtılar iki hafta süreyle kuluçkaya bırakma takip ayrı 10 cm'lik kaplar üzerine serpildi dijeste edilmiştir. (Şekil 2B'de gösterildiği gibi), Giemsa ile koloni oluşturan birim (CFU) görselleştirme zaman, karşılık gelen ilk süzüntüler (Şekil 2C) için daha köpek örneklerin ürokinaz reaksiyonlar 3.8 kat daha fazla CFU görülmektedir. Although az belirgin, insan örnekleri protokol uygunluğunu teyit tedavi örneklerden 1.6 kat daha fazla CFU ile benzer bir seyir izlemiştir. Gerçekten de, Şekil 2B'de sağ üst üste gösterilen sindirilmiş pıhtı plakalar bir araya getirilmiş numune için görülen tipik sonuç karşılık gelmektedir. Bununla birlikte, donor varyasyon kolaylıkla gösterilmiştir ne iki katına yarısından CFU numaraları ile sonuçlanabilir.
Plakalar filtratlardan CFU (Şekil 2C) göre pıhtı gelen seribaşı hücre havuzu kalitesinin göstergesi, daha orta (2-5 mm) ve geniş olarak koloni boyutu alarak (> 5 mm) koloniler ortaya çıktı. Bu genellikle MKH ürokinazın tedaviden sonra normal büyümeye işaret etmektedir. Ayrıca pıhtı olmayan örnekler agrega, sindirilmiş köpek örneklerin karşılaştırılması (n = 21) (n = 7) büyük arası örnek varyasyonu heterojen verici popülasyonuna bağlı olarak gözlenmiş olmasına rağmen, muamele edilmiş numuneler için, toplam MSC, benzer sayılarda vermiştir (Şekil2B).
Uygunluk son fonksiyonel testi olarak, biz sindirilmiş kemik iliği örneklerinden elde edilen MSC farklılaşmasını bağlı. Otolog kök hücre tedavileri Uygulamalar kıkırdak, kemik veya adipoz dokusu veya 18 sinyalizasyon MSC parakrin içine MSC farklılaşma dayanmaktadır. Hücreler, adipojenik farklılaşma 19 osteojenik farklılaşma 20 veya kondrojenik soy 17 için uygun bir kültür koşullarını seçerek farklılaşma olarak istenen yolun doğru yönlendirilebilir. Dolayısıyla, biz kemik iliği pıhtı gelen Pıhtılaşmamış kemik iliği örneğinden elde edilen MSC ile MKH'lerin karşılaştırıldı. Kültürde dört hafta sonra, her üç yukarıda bahsedilen soylar olarak MSC ayırt etmek mümkün olmuştur. Bu histolojik, Von Kossa (osteojenik soyu için) ile test edilmiştir Gruplar arasında farklılaşma derecesi hiçbir farklılık gösteren Petrol Kırmızı O (adipojenik) ve Alcian Mavi (kondrojenik) Renklendirmeler, ( 
Şekil 1. Kemik iliği pıhtıları. Varış (A) üzerine kısmen pıhtılaşmış halde köpek ve insan kemik iliği örneklerinin yüzdesi. Ayrıca, biz pıhtılaşmış numuneler MSC verimleri kuvvetle nedeniyle pıhtı içinde hapsolmuş hücrelerin sayısının yüksek azaltıldı bulundu. Çekirdekli hücrelerin sayısının yüksek olması, bir köpek, kemik iliği pıhtı (B) bir cryosection DAPI lekelenmeye gösterildiği gibi pıhtı içinde mevcuttur. Ölçek çubuğu 200 mikron temsil eder. 
Ürokinazın ile sindirilmiş kemik iliği pıhtılaşması gelen MKH 2. İzolasyon Şekil. (A) Tipik olarak, kemik iliği pıhtıları urokinaz sindirmek üzerine neredeyse tamamen kaybolur.Yöntem geliştirme üzerine, biz (n = 5, ≤0.01 ** p, ortalama ± SD) ve insan örnekleri köpek için pıhtı ağırlıkları değerlendirildi (n = 3, ortalama ± SD, ns = anlamlı p = 0.10) güçlü üzerine düştüğünü söyledi urokinaz özeti. (B) Basit bir CFU tahlili MSC hazırlık kalitesini değerlendirmek için bilgilendirici bir araç olarak hizmet verebilir. Sindirmek etkinliğini değerlendirmek için, CFU tahlili ayrı kemik iliği aspiratları gelen süzüntülerden ve sindirilir pıhtıları uygulandı. Kültür içinde iki hafta sonra, 10 cm kontrol plakaları, GIEMSA ile boyanmış ve CFU sayıldı. Tahlil CFU sayısının yüksek sindirimi ve işlevsel kalır ürokinaz ile pıhtı serbest bırakılabilir doğruladı. Bu aynı zamanda büyük koloniler (sınıf-bölünme yüksek frekans ile teyit edilir:. Siyah> 5 mm, koyu gri 2-5 mm ve açık gri <2 mm hata çubukları köpek için n = 5 (toplam CFU SD temsil n = insan için 3, ** p ≤0.01, ns = anlamlı, p = 0.17). (C) ResimGiemsa lekeli plakalardan s gösterilen sonuçları doğrulamaktadır. sindirilmiş pıhtı için gösterilen plakalar sindirilmiş kemik iliği örneği için tipik bir sonuca karşılık - ancak, sayılar donör değişkenliği nedeniyle büyük ölçüde değişebilir. Özetle (D), ürokinaz doğal pıhtı ücretsiz örnekler (n = 7, ortalama ± SD) genişleme kültürden sonra karşılaştırılabilir toplam MSC verimleri (n = 21) sonuçlarını protokolü sindirmek uygulayarak. Tüm Şekil 2'de istatistiksel analiz Student t-testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 
Doğal Pıhtılaşmamış örneklerin karşı sindirilmiş farklılaşma potansiyelinin Şekil 3. karşılaştırılması. Urokinaz (üst satır) ve Pıhtılaşmamış kemik iliği (alt sıra) ile muamele pıhtılaşmış kemik iliğinden izole Köpek MKH osteojenik fenotip ayırt ve Von Kossa (bar = tarafından boyandı200 mikron), adipojenik fenotip ile boyandı Yağ Kırmızı O (bar = 100 mikron; girintisiyle yağ vakuollerin büyük büyütme olarak), kondrogenezis Alsiyan mavi boyama ile ortaya iken (bar = 100 mikron nükleer hızlı kırmızı counterstaining). Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hasta sadece küçük bir ek iş ameliyathanede personel tarafından yapılmalıdır avantajı ile, (bizim durumumuzda özellikle omurga cerrahisi olarak) ameliyat geçiren iken rutin kemik iliği örnek. Numuneler hemen çekilmesinden sonra, sodyum sitrat ile karıştırılır olsa onlar işleme laboratuarda geldi, birçok örnekleri kısmen pıhtılaşmış idi. Bu aşamada, pıhtılaşmış numuneler yerine örnekleme ayrı bir ek müdahale yine yerel veya genel anestezi gerektiren 6 olacaktır. Bu katkı, klinik personeli ve donör hem de istekli gerektirir ve kaynakların 21 çok tüketir.
Burada multipotent MSC izole etmek pıhtılaşmış kemik iliği numunesi üzerinde rekombinant insan ürokinaz kullanan bir protokol sağlar. Biz ürokinaz tedavi hücrelere zarar vermez ve farklılaşma potansiyeli muhafaza olduğunu göstermek olabilir. protokolkarşılaştırılabilir hücre havuzları elde ederken Pıhtılaşmamış örneklere kıyasla sadece yaklaşık 1 ½ saat ile örnek işleme uzatır çünkü kısa. Bugüne kadar, bu protokol başarıyla birkaç sürü urokinez kullanarak farklı bireyler ve köpekler kemik iliği pıhtıları üzerinde uygulanmış ve sağlam ve tekrarlanabilir başarı göstermiştir. Bunun dışında, ürokinaz numune iç plazminojen aktivasyon üzerinden dolaylı olarak tesir etmektedir. Bu ürokinaz reaksiyon plazma ortamı gerektirir anlamına gelir. Bu örneğin, PBS ile pıhtı durulama veya benzeri adımları tanıtmak nedenle unadvisable olduğunu. Bu serum ortamı sulandırmak ve enzimatik reaksiyonun önemli bir yavaşlama neden olur.
Karar bizim yöntem için urokinez kullanmak ve başka bir trombolitik ilaç önemsiz: bizim hastane eczane hazır trombolitik ilaç dayalı protokol geliştirmiştir. Diğer araştırma grubu için, bu nedenle, bir doku-Typ kullanımı daha kolay olabilir,E plazminojen aktivatörü (yani., alteplaz, reteplaz veya tenekteplaz gibi farklı bir ilaç ürünü) ürokinaz mevcut değilse. Bununla birlikte, ilaçlar arasında potansiyel olarak önemli bir fark bulunmaktadır: ürokinaz tipi plasminojen aktivatör reseptörüne (uPAR) 22 ile bağlandığı zaman, doku tipi plazminojen aktivatörleri aksine, ürokinaz hücresi aktivasyonunu ve çoğalmasını tetikleyebilir. Bağlama üzerine, hücre içi sinyal kaskadları hücre göçü ve çoğalması bu kurşun aktive edilir. Fizyolojik durumda, bu daha fazla aktive edilmiş hücreler tarafından matris metaloproteinaz salgılanması tarafından desteklenmektedir. Ancak, sistem içinde, ürokinaz seyreltilir ve yavaş yavaş zararlı etkiler göstermeden genişleme kültüründe üzerine çıkarılır. Yine de, izole edilmiş bir MSC amaçlanan kullanımı ile ilgili olarak, trombolitik ilaçlar herhangi uygunluğu ayrı ayrı tespit edilmesi gerekmektedir.
Genel olarak, hızlı ve tam bir pıhtı sindirmek için yüksek dozajlar dö önerilmektedirpıhtı işlem sırasında istenmeyen noktası durumuna küçült. Dikkate değer, birçok önceki çalışmalarda kan ve kemik iliği pıhtıları 13,14 sindirerek bakteriyel streptokinaz kullanılır. Bununla birlikte, bu ilaç istenmeyen aktivasyonu ve hastalara hücrelerinin uygulanması amaçlanmıştır, özellikle önemli bir dezavantaj olabilir bağışıklık sisteminin tepki uyarabilir.
Bu nedenle bizim protokol sadece zaman kazanmak ve maliyetleri azaltmak için araştırmacılar ve tıp uzmanları yardımcı olmuyor inanıyoruz. Urokinez kullanma - onaylanmış enzimatik ilaç bilinen antijenite olmadan - hatta MSC hazırlıkları terapötik kullanımı amaçlayan birçok öteleme araştırma laboratuarları için değerli bir araç sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
