Summary
Målet med denne protokollen er å presentere en standard metode for å utføre intravenøs glukose toleranse tester (IVGTTs) for å vurdere glykemisk kontroll hos ikke-menneskelige primater og vurdere deres metabolske status fra sunt å dysmetabolic.
Abstract
Intravenøs glukose toleranse test (IVGTT) spiller en sentral rolle i karakterisering av glukose homeostase. Når det tas sammen med serum biokjemiske profiler, inklusive blodsukkernivået i både matet og fastende tilstand, HbA1c, insulin nivåer, klinisk historie av kostholdet, kroppssammensetning, og kroppsvekt status, vurdering av normale og unormale glykemisk kontroll kan gjøres . Tolkning av en IVGTT skjer ved måling av forandringer i glukose og insulinnivåer over tid i forhold til den dekstrose utfordring. Kritiske komponenter som skal vurderes er: topp glukose og insulinnivåer nådd i forhold til T0 (slutten av glukoseinfusjon), glukose-eliminasjonshastighet K utledes fra helningen av hurtig glukose klaring i den første 20 min (T1 til T20), tids for å gå tilbake til grunnlinjen glukose, og arealet under kurven (AUC). Disse tiltakene IVGTT viser karakteristiske forandringer som glukosehomeostase beveger seg fra en frisk toa sykelig metabolske tilstand fem. Heri vil vi beskrive den karakteriseringen av ikke-humane primater (Rhesus og Cynomolgus-aper), som er det mest relevante dyremodell av type II diabetes (T2D) hos mennesker og IVGTT og kliniske profiler av disse dyrene fra en mager frisk, for å overvektige dysmetabolic, og T2D tilstand 8, 10, 11.
Introduction
Den IVGTT er en enkel funksjonell analyse som blir rutinemessig brukt for å bestemme den β-cellefunksjon hos mennesker ved forskjellige metabolske tilstander 5, 7. I dyremodeller av T2D, er vel anerkjent som et verktøy for å karakterisere dyr som viser metabolske sykdomsprogresjon fra en sunn til en dysmetabolic hyperglykemisk tilstand 8, 9. Den nærmeste dyremodell av T2D er vist i ikke-humane primater (NHPs), hvorav rhesus og cynomolgus-aper er gode eksempler. Disse dyrene utvikler naturligvis T2D med de samme risikofaktorer for alder og fedme bidra til dens forekomst som hos mennesker 10. Videre er det en lignende sykdomsprogresjon og pankreatisk patologi som viser amyloidavsetninger som dysmetabolic sykdommen utvikler seg 11.
Her rapporterer vi på vår standard metode for å utføre en IVGTT i NHPs som en del av vår koloni karakterisering av metabolske status i disse dyrene. Denne metoden erlett å utføre i forhold til andre, mer tidkrevende og kostbare teknikker 2. Den IVGTT er nyttig for karakterisering av en stor koloni av dyrene hurtig og ofte. Når tatt i betraktning med nivået av glykosylert hemoglobin (HbA1C), dyrets kosthold og matinntak historie, samt deres prosent lean mass og kroppen fett, er det IVGTT normalt tilstrekkelig for å karakterisere et dyr metabolske status og progresjon mot åpenbar diabetes 6 8.
HbA1C representerer den gjennomsnittlige glykemisk nivå over livet til en rød blodceller, noe som gir et pålitelig mål på glukosenivåer i løpet av de siste seks uker til tre måneder. Målt fra fastende baseline blodprøve av IVGTT, gir denne verdien et vindu inn glykemisk kontroll i løpet av månedene mellom prosedyrer. Hvis dyret har gått fra dysmetabolic til diabetiker siden sist IVGTT, ville en HbA1C verdi mye høyere enn deres forrige verdien indikererat overgangen begynte snart etter deres siste IVGTT, mens en HbA1C verdi nærmere sin tidligere verdi skulle tilsi at de har bare nylig overført. Generelt, i rhesusape, verdier HbA1c større enn 6% anses som unormal, og indikerer dårlig glykemisk kontroll 10, 23.
Glykemisk nivåer bør tolkes innenfor rammen av atferd og generelle helsen til dyr som helhet. Diabetiker makaker - som mennesker - utstillings hyperphagia, polydipsi og polyuri. Gruppe bolig av dyr gir betydelige utfordringer for måling av disse indikatorene og den enkelte vare som kreves for dysmetabolic og diabetiske aper. Vi anbefaler enkeltvis boliger dyrene slik at mer personlig omsorg kan gis, og atferdsmessige markører for helsen til ape lettere overvåkes 8. I tillegg vil diabetiske makaker vise vekttap, samt en forhøyet lipidprofil (øktkolesterol, hypertriglyseridemi) og forstyrret mineralmetabolismen i serumkjemi. Det er viktig å måle markører for lever- og nyrefunksjon i serumkjemi, som skade på disse organene er ofte komplikasjoner av fremrykkende metabolsk forstyrrelse / diabetes, og kan være co-determinanter av glykemisk, lipid og mineral ubalanse 9, 11, 18, 24 .
Når du bruker denne metoden, de historiske verdiene som genereres fra flere, hyppige characterizations over livet til en ape er av særlig verdi. Hvis andre prosedyrer, for eksempel en glukose clamp eller gradert glukose infusjonsvæske (GGI), er nødvendig for å fullt ut vurdere et dyrs helse, er det ofte ved første karakterisering når deres historie er utilgjengelig. Men når en baseline har blitt etablert, gjentatte IVGTTs av en frekvens på hver tredje måned er normalt tilstrekkelig for å spore et dyr fremgang. Dette er spesielt viktig når dyrene er registrert i flere studier gjennom etkalenderår basert på deres metabolske status. Mens deres helse kan holde seg relativt stabile i år av gangen, når den metabolske status av et dyr forverres, kan en dramatisk økning i insulinresistens og glukoseintoleranse skje svært raskt. HbA1c-verdier tillate noen interpolering av nedgangen eller forbedring av helsetilstanden til dyret mellom prosedyrer planlagte tre måneders mellomrom. Av denne grunn er denne metoden ideell for å karakterisere dyr som brukes i flere, langsgående studier i løpet av deres naturlige levetid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble godkjent av David H. Murdock Research Institute IACUC ligger på North Carolina Forskning Campus (NCRC) under protokollen 14-017, til karakterisering av et ikke-menneskelig primat modell av diabetes og prediabetes / insulinresistens og effekt av legemiddel bedre insulinfølsomhet og metabolsk funksjon.
1. Animal Utvalg og Study Forberedelse
- Velg kosthold og vekt stabile dyr basert på månedlige matinntak og kroppsvekt poster.
MERK: Dyr som har utstilt en nylig nedgang i appetitt bør ikke være preget inntil deres matinntak har stabilisert seg.- For eldre dyr (> 5-6 år), ikke velg dyr hvis kroppen vekter mellom sammenhengende måneder avviker med mer enn 10% uten først å undersøke ape og utelukker andre enn å endre metabolske status for den dramatiske endringen i vekt årsaker.
- For glukose, insulin og c-peptide analytter, forberede K 2 EDTA sample samling rør med proteasehemmer (aprotinin og DPP4I).
MERK: DPP4I + Aprotinin cocktail gir et bredt spekter av protease hemming bør dette være nødvendig for ytterligere analytter (glukagon, GLP-1). I det tilfelle at flere analytter ikke er samlet, bør blod rørene fremstilles på samme måte for å opprettholde konsistens i prøvesamling. Prøver for analyser ikke validert for denne metoden skal brukes, samles separat, i henhold til produsentens anbefalinger.- Klargjør proteasehemmer cocktail ved å blande 100 mg frysetørket Aprotinin med 10 ml DPP4I. Tilsett 10 pl av den Aprotinin + DPP4I blanding til hvert rør for blod hver milliliter blod oppsamlet.
- Legg ytterligere 10 mL av proteasehemmer cocktail til hvert rør for mulig samling overskudd. Oppbevar behandlet blod-rør ved -20 ° C inntil bruk. Hold rørene på våt is under procedure og sentrifugering ved 4 ° C.
- Bruke et serum separator rør for å samle inn en blodprøve ved utgangspunktet for standard serumkjemi analyse. For Komplett blodceller (CBC), bruker en standard K 2 EDTA uten proteasehemmere. Bruk cryovials til delmengde plasma og serum etter blodprøvene er spunnet ned.
- Merk blod rør og cryovials hensiktsmessig med dyret identifikasjon, dato, prosedyre, endepunktet, og prøvevolum. Label cryovials med analytten (e) i plasma for passende assay.
- Klargjør heparinisert saltvann flush ved å injisere 0,15 ml 1000 USP enheter per ml heparin i en 250 ml pose med vanlig saltvann. Skaff en løsning på 0,06 mg heparin / ml. Tegn 40 - 60 ml av denne oppløsning inn i en saltløsning lås for spyling mellom prøver. Trekke en ytterligere 1 ml og 5 ml i separate sprøyter for spyling av dekstrose infusjon port før og etter infusjon, respektivt.
2.Animal Sedasjon og klargjøring
- Fjerne mat fra dyrets bur ikke mindre enn 14 timer før prosedyren, og ikke mer enn 18 timer.
MERK: Det er viktig at dyrene fastet for prosedyren for å unngå enhver postprandial variasjon i glykemisk verdier. Det er også en forholdsregel for å unngå oppstøt og aspirasjon av mageinnhold mens bedøvet. - Sedate dyr for varigheten av IVGTT prosedyre med ketamin gitt intramuskulært som en generell bedøvelse, ved 10 mg / kg. Administrere ytterligere ketamin (5 - 10 mg / kg) i intervaller på 20 - 30 minutter, eller etter behov, under prosedyren.
- Vei bedøvet dyret. Plasserer dyret i en sideveis liggende posisjon på et oppvarmet bord prosedyre.
- Overvåk kliniske parametre hver 15 til 20 min for å sikre at dyret er i en stabil plan av anestesi. Måle hjertefrekvensen (100-200 bpm) og SPO 2 (> 92%) med et pulsoksymeter. Mål respirasjonsfrekvens (20 - 50 pust / min) w ed en stoppeklokke, telle respirations visuelt eller for hånd over femten sekunder og multiplisere med fire. Mål temperatur (> 97 ° C) rektalt. Overvåk fargen på slimhinnen rundt tannkjøtt og lepper (fuktig, rosa).
- Forbered to kanyle nettsteder. Bruk hårklippere å trimme håret fra området av interesse hvor kateteret settes inn, og sterilisere hele regionen med vekslende skrubb av klorheksidin og 70% alkohol.
- Plasser en kateter i regionen på venstre eller høyre cephalic eller saphenous årer og feste den til en heparin saltvann flush (0,06 mg heparin / ml) med en treveis stoppekran. Dette er samplingsblodprøvetaking området.
- Plasser den andre kateter i et annet ben eller arm i området ved cephalica eller saphenous årer og legge ved en port. Bruk dette området for druesukker infusjon. Bruke en liten, 1 ml skylling med heparinisert saltoppløsning for å holde kanylen patent før dekstrose infusjon.
MERK: IVGTT prosedyren består av 8 blod uavgjort prøvetakingstidspunktene (tabell 1).
- Ta baseline prøve og bruke en håndholdt glukosemåler for å måle fastende blodsukker nivå. Oppnå en serumprøve for standard kjemi analyse, så vel som en hel blodprøve for en CBC for å vurdere den generelle helsen til dyret. Samle plasmaprøver for å analysere glukose og insulin nivåer fra grunnlinjen prøven ved hjelp av et kit godkjent for bruk med aper som per produsentens instruksjoner 8, 9.
MERK: Det er viktig å ha en pre-trekning av 0,5 ml tatt fra kanylen før du tar noen prøve for blodprøvetaking for å fjerne rester av blod eller heparin i dead-space av kanylen. - Etter oppnåelse av grunnlinje prøve, tilføre doser på 50% dekstrose (250 mg / kg) i løpet av 30 sekunder inn i den dekstrose infusjons port.
MERK: høyere dose modeller (500 mg / kg) kan brukes,men dosen bør være fast over prosedyrer for å lage langsgående sammenligninger.- Skyll infusjon port med 5 ml heparinisert saltvann for å sørge for at det ikke er druesukker igjen i porten. Slutten av infusjon er T0. Har teknikeren erstatte hansker, som rest druesukker fra infusjons kan forurense påfølgende blodprøver.
- Den første post-infusjon prøve tidspunkt er ved T3 min, fra slutten av dekstrose infusjon, etterfulgt av T5 min, T7 min, T10 min, T15 min, T20 min, og den siste prøven tidspunkt er ved T30 min. Samle plasma fra hver endepunktet til analyse glukose og insulin nivåer med baseline prøven (se trinn 3.1).
- På T3 min tidspunkt, kan du bruke håndholdt glukosemåler å igjen sjekke blodsukkernivået.
MERK: glukosemåler avlesninger ved baseline og T3 er bare å bekrefte infusjon av druesukker. Den blodglukosenivå ved T3 min tidspunkt bør være ~ 100 mg / dl høyere compared til fastende baseline plasma glukosenivå.
- På T3 min tidspunkt, kan du bruke håndholdt glukosemåler å igjen sjekke blodsukkernivået.
4. Animal Recovery og prøvebehandling
- Fjern kanyler og legg press på kateter- iseres nettsteder for hemostase etter T30 min tid-punkt. Overvåk dyret før den har kommet til bevissthet og sitter opp. Tilbudet fôr når dyret er helt frisk.
- Umiddelbart plassere hver hel blodprøve i K 2 EDTA-rør på is. Sentrifuger ved 3000 rpm ved en temperatur på 4 ° C i løpet av 10 min fra samlingen. Delmengde plasmaprøver i cryovials, fryse og oppbevar ved -80 ° C inntil analyse.
- Tillate blod inn i serum røret for standard serumkjemi analyse for å sitte ved værelsetemperatur i ikke mindre enn 20 minutter og ikke mer enn 30 minutter før sentrifugering ved 3000 rpm ved romtemperatur. Fryse serumprøver før analyseres innen 48 timer fra samlingen.
MERK: Kjøle hele blodprøver tatt for CBC analyse før somSayed innen 24 timer fra samlingen.
- Tillate blod inn i serum røret for standard serumkjemi analyse for å sitte ved værelsetemperatur i ikke mindre enn 20 minutter og ikke mer enn 30 minutter før sentrifugering ved 3000 rpm ved romtemperatur. Fryse serumprøver før analyseres innen 48 timer fra samlingen.
5. data Treatment
- Etter fastsettelse av plasma-insulin og glukose kurver, bestemme glukoseeliminasjonshastighet K fra helningen av den naturlige logaritme av glukose verdier over grunnlinjen 16, 17.
MERK: En frisk NHP kan forventes å ha en glukose clearance K godt over 1, ofte større enn to eller mer, som en sunn dyr vil ofte tilbake til sine utgangsglukoseverdiene i løpet av 30 min. Som insulinproduksjonen avtar, vil glukose clearance K slippe mer dramatisk, faller under en. - Beregne AUC som en helhet, som summen av totaler i området av trapeser som representerer arealet under kurven for hvert linjesegment mellom tidspunkter, gjennom T30 16, 17.
MERK: Tradisjonelt er AUC av de første ti minuttene av prosedyren regnes som den spisse insulinrespons overfor glukose (AIR), mens AUC fra den siste 20 minutter av prosedyren anses sen insulinresponsen (LIR). Som dyret blir mer dysmetabolic, vil insulin AUC øker, noe som reflekterer kompensasjon for økt insulin insensitivitet. Som dyret overganger til åpenbar diabetes, vil imidlertid den AUC avta, ofte først i den akutte fasen insulin, fanges opp av luften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene er vist i figur 1 er demonstrative av typiske glukose og insulin kurver fra modne, friske og diabetiske cynomolgus makaker i løpet av en 30 min IVGTT. Data fra friske og avanserte diabetiske aper er vist for å kontrast åpenbare forskjeller mellom dyrene fra begge ytterendene av omfanget av metabolske karakterisering. Dette IVGTT protokollen har blitt brukt med hell av forfatterne i rhesusape med lignende resultater.
Fastende, baseline glukoseverdiene av en sunn makaker (rhesus og cynomolgus) kan være så lav som 50 til 60 mg / dl 8. Som illustrert i figuren, den første glukose utflukt - målt ved T3 - kan for en sunn NHP ikke stige så høyt som en typisk utgangsglukoseverdi for en diabetiker dyr, som ofte er i overskudd av 200 mg / dl. I løpet av de følgende trettiminutt, glukosenivåene hos en frisk dyr ofte tilbake til sine utgangsverdier, mens dysmetabolic og diabetiske dyr ikke gjør det (figur 1; heltrukne linjer). Den medfølgende insulin kurve for en sunn dyr oppviser to topper (figur 1; stiplet blå linje), som tilsvarer den første, raske nedgangen i blodglukose (fase 1) mediert i større-enn-normal del av perifere virkninger av insulin på glukose transport og opptak 3, 4. Betydningen av disse perifere virkninger, selv under den første fase av insulin respons, ikke er lik bidraget fra leveren til glukose senking, som i løpet av mindre, men mer vedvarende andre insulin-toppen (fase 2 ), har størst innvirkning på glykemisk nivåer via undertrykkelse av endogen glukoseproduksjon 1.
Som et dyr utvikler seg fra sunt å dysmetabolic, er det vanligvis en reduksjon av the første fase av insulin som svar på glukose bolus, noe som kan gjenspeile seg i en redusert AIR. Imidlertid kan AUC forbli uendret, så vil det oftere være en generell økning i insulin produksjon, noe som gir for stor grad uendret glycemic nivåer i løpet av prosedyren som økt insulinproduksjon kompenserer for nedgangen i følsomhet. Når et dyr har blitt åpenlyst diabetiker, synker dramatisk insulinproduksjon som respons på dekstrose bolus (figur 1; stiplet rød linje). Glykemiske nivåer vil være forhøyet i løpet av prosedyren, som hva glukose klaring skjer nå mediert nesten utelukkende av ikke-insulin-avhengige mekanismer (figur 1).
Figur 1: IVGTT Glukose Lagersalg og insulin produksjon Kurver for diabetiker og Healthy Kontroll Dyr. Vist her er glukose (heltrukket linje) og insulin (stiplet linje) kurver for sunn (blå linje) og diabetikere (rød linje) dyr. Disse verdiene er gjennomsnitt av faktiske data samlet inn under IVGTTs utført på cynomolgus makaker (diabetiker glukose: n = 27; sunn glukose: n = 21, diabetiker insulin: n = 23; sunn insulin: n = 20; standard feilfelt vist). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Clock Tid | Tidspunkter (min) | real Time | Blood Sample mengden (ml) | Prøveanalyse | Glukose Meter Reading (mg / dl) | |
| baseline | 5 ml | 1,5 ml SST - kjemi 0,5 ml K 2 EDTA - CBC, HbA1c 3 ml K 2 EDTA + 50 ul prot -. Glukose, insulin, C-Pep | ||||
| 0 | Dekstrose infusjon 250 mg / kg IV, gitt i løpet av 30 sekunder, etterfulgt av 5 ml Heparin saltvannsspyle | |||||
| 3 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 mL Prot .: Glukose, Ins, C-Pep | ||||
| 5 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 mL Prot .: Glukose, Ins, C-Pep | ||||
| 7 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 mL Prot .: Glukose, Ins, C-Pep | ||||
| 10 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 mL Prot .: Glukose, Ins, C-Pep | ||||
| 15 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 mL Prot .: Glukose, Ins, C-Pep | ||||
| 20 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 mL Prot .: Glukose, Ins, C-Pep | ||||
| 30 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 mL Prot .: Glukose, Ins, C-Pep | ||||
Tabell 1:. IVGTT Prosedyre Tabell Vist her er en standard prosedyre rapport for en IVGTT, detaljering all relevant informasjon fanget under prosedyren. Klokke ganger for prøve trekker etter druesukkerinfusjon skal beregnes fra slutten av infusjonen. Faktiske ganger bør registreres for hver trekning. Klikk her for å laste ned denne tabellen som en Microsoft Word-dokument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den IVGTT vurderer kapasiteten til glukosestimulert insulinfrigjøring ved en enkelt dekstrose infusjon basert på kroppsvekt 5, 12, 13. Fra analysen, er det fastende blodglukose og insulin-nivå oppnådd, og det tillater en vurdering av dyrets kapasitet til å frigjøre insulin og returnere forhøyet glukosenivå mot baseline. Dette gir brukeren informasjon å karakterisere dyret som en normal glukose og insulin nivå sunn kontroll, en hyperinsulinemiske dysmetabolic dyr med normoglycemien, eller en hyperglycemic insulinresistente diabetiske dyr.
Det er viktig at blodprøver, spesielt fra de tidlige tidspunkter, etter infusjon av dekstrose, trekkes og behandles på en rask og konsekvent måte. Dette vil redusere variasjonen innen og mellom fag, og redusere mulighetene for feil i timelige rekkefølgen av dataene. Tidspunktet for T3 er av avgjørende betydning fordi utflukt of plasmaglukose fra basislinje til tre minutter etter infusjon av dekstrose er en av endepunktene som brukes til å karakterisere den metabolske status av dyrene. Det er en nedgang i glukose klaring i første 7-10 min etter druesukker infusjon, som kan gå glipp av hvis de blod trekker er ikke tatt i tide. Det er arealet under denne del av både glukose og insulin kurver som brukes som et endepunkt, understreker viktigheten av disse tidlige tidspunkter. Hvis en blodprøvetaking når T3 er tatt sen, kan prosedyren fortsette, men den faktiske tiden av trekningen skal rapporteres for å opprettholde den virkelige formen av kurven så mye som mulig. Det er særlig viktig at avvik på mer enn ett minutt bli fanget og rapporteres. Etter de første ti minutter, har en tendens til glukose klaring til å bli mer gradvis, og kan ikke vende tilbake til basislinjen i løpet av 30 min (figur 1). Fremgangsmåten kan utvides ved å ta prøver hvert 10. minutt etter at T30 tilfange hvor lang tid det tar dyret til å gå tilbake til baseline.
IVGTTs er begrenset av deres evne til å direkte måle insulinfølsomhet. Det er først og fremst nyttig som en metode for å vurdere insulinproduksjon og glukose klaring. Men nedsatt insulin utvinning fra portalen blodtilførselen kompromisser målinger av "insulinsekresjon" fra den systemiske blodtilførsel. Dette kan delvis overvinnes, men ved måling av C-peptid, som skilles ut i ekvimolare mengder fra bukspyttkjertelen, men blir ikke fjernet av leveren før de går inn i den generelle blodtilførsel. Dette gir et klarere syn på insulin produksjonen for å vurdere β-cellefunksjon 16 bedre. Også, IVGTTs ikke skille mellom insulinavhengige mekanismer for glukose klaring og ikke-insulin avhengige mekanismer 1, 6. Mens insulinfølsomhet kan bestemmes indirekte ved minimal modellering av data fra et IVGTT, kan mer pålitelig mål oppnås gjennom the bruk av prosedyrer som for eksempel gradert glukoseinfusjon (GGI), som gir en β-celle dose-responskurve 14, 15.
Imidlertid er insulinfølsomheten fortsatt vurderes bare indirekte med GGI. kan gis en standard insulindose til dyret i løpet av IVGTT for å forbedre beregningen av insulinfølsomhet, men som vil maskere endogen insulinproduksjon, noe som påvirker vurdering av β-cellefunksjon. Det hyperglykemiske og hyperinsulinemiske brakett teknikker måle direkte glukoseregulering via kontrollert insulin eksponering. Ulempen med både GGI og klemmen teknikker er at de er kostbare å utføre og krever flere personell og tid for å fullføre (noen ganger så lenge som seks til åtte timer, avhengig av utformingen av prosedyrene) 16. Den IVGTT, på den annen side, kan utføres under en time og med minimal arbeidskraft.
Generelt vil en sunn dyr avhende glukose meget hurtigly, ofte tilbake til sine utgangsverdier innen 30 min, og deres insulin kurve vil stille ut to tydelige topper for akutte og sene insulin svar. Som et dyr blir mer dysmetabolic, deres fastet glukose og deres glukose utflukt i de første tre minuttene etter infusjon kan øke. Imidlertid kan disse verdiene varierer mye mellom friske dyr, og er mest informative for sykdomsprogresjon når sammenlignet med historiske verdier fra det samme dyr. Samlet, men glukose clearance av en dysmetabolic dyr kan ikke være svært forskjellig fra da de var friske. De første tegn på sykdomsprogresjon kommer til å være mest tydelig i insulin kurve. Mens fastende insulinnivå kan bare være mildt forhøyet, vil insulin AUC typisk øke dramatisk i dysmetabolic dyr, noe som reflekterer kompensasjon for å utvikle insulin ufølsomhet. Som β-cellefunksjon avtar, selv om en mildning av den akutte fasen insulinrespons kan sees. Thans vil bli reflektert i en redusert AIR, som, når normalisert til baseline, kan nærme seg 0 i en diabetiker ape. Dette etterfølges av en generell nedgang i insulinproduksjonen og en dramatisk reduksjon i glukose klaring 8, 9, 10, 11.
Den metabolske status av et dyr kan være vanskelig å fastslå med en enkelt IVGTT. Dette kan være tilfelle ved forsøk på å skille et dyr som enten tidlig dysmetabolic eller pre-diabetisk. Når blir stadig mer dysmetabolic, til insulin produksjonen øker opprett euglycemia. Mens fastende glukoseverdiene kan bli litt forhøyet, betyr svekket glukose disposisjon ikke blir veldig tydelig til β-celle funksjon har blitt kompromittert og insulinproduksjonen begynner å avta 18, 20. For en periode, før åpenbar diabetes har satt inn, insulinverdier kan ligne kurven av en tidlig dysmetabolic dyr i hvem har blitt kompromittert første fase respons, men noen insulin er still blir produsert over fastende, baseline-verdier. På grunn av dette, kan AUC for insulinkurven for en tidlig dysmetabolic og prediabetic dyr være svært like. I denne situasjon, en forhøyet glukose-kurven, som er påvirket av både insulinavhengig og ikke-insulinavhengige mekanismer, er ikke tilstrekkelig til å skille de dyr som enten tidlig dysmetabolic eller pre-diabetisk. Denne forskjell kan gjøres ved å utføre et hyperinsulinemiske / euglykemiske klemme, som direkte viser insulinsensitivitet 19. Alternativt kan dette gjøres forskjell på å utføre en annen IVGTT på dyret etter flere måneder. I det sistnevnte tilfelle, hvis AUC for de insulinkurven øker, kan dyret bli ansett å ha vært tidlig dysmetabolic ved tidspunktet for den første fremgangsmåte. Dersom AUC avtar imidlertid dyrets dysmetabolic status kan bli ansett å ha blitt avansert / prediabetic ved tidspunktet for den første karakterisering. En prediabetic tilstand kan også accompanIED av vekttap og økt væskeinntak i løpet av tiden gripe de to IVGTT prosedyrer. Disse forholdene illustrerer hvorfor IVGTT er et spesielt nyttig verktøy når det vurderes i lys av tidligere slike prosedyrer i motsetning til å bli brukt som et øyeblikksbilde av et dyrs helse.
Bruken av stol-tilbakeholdenhet med bevisste dyr har vist seg å gi en betydelig økning i blodglukosenivået under glukosetoleransetest 25. Av denne grunn, er dyr bedøvet for denne prosedyren. Imidlertid må det utvises forsiktighet ved valg av bedøvelse. Det har blitt rapportert at anvendelse ofα2-adrenoceptor agonister som xylazin og dexmedetomidin til sedering i betydelig grad kan øke blodglukosenivåer i ikke-humane primater 17, 21. Den metode som er rapportert her bare bruker ketamin for sedering, som ikke forårsaker blodsukkernivået å stige 22. Noen ganger kan et dyr viseslik stivhet og tensing at teknikeren kan føle et middel er nødvendig. I slike tilfeller har Diazepam og Telazol vist seg å ha en mye mindre dyp effekt på insulinproduksjon og glukosemetabolisme deretter α2-adrenoceptoragonister 21. Derfor er det viktig å vurdere anestesiregimet i metabolske tester, som for eksempel IVGTT. Oppsummert er det IVGTT en enkel metabolsk funksjon test som er rutinemessig utført i NHPs, men det kan gi verdifull informasjon for å kategorisere dyr innenfor en koloni i ulike metabolske tilstander, dermed informere sine dyr omsorg og helse, samt deres potensielle nytte i modeller av metabolsk sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er tilknyttet en kontrakt forskningsorganisasjon (Crown Biovitenskap) aktiv innen metabolsk sykdom.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke den sterke støtten fra den DHMRI CLAS dyr omsorg personale, facility manager Mr. Daniel Peralta og behandlende veterinær, Dr. Glicerio Ignacio, DVM MRCVS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-15R Centrifuge | plasma: 4 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Sorvall ST16R Centrifuge | serum: 22 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Thermo Scientific -86 °C Freezer, Forma 88000 Series | Model: 88500A | ||
| Dextrose 50% (D50) | Webster | 07-8008986 | I.V. glucose infusate |
| 3 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | serial blood draws | |
| 5 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | heparinized saline flush | |
| 10 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | delivery of I.V. D50 | |
| Gauze sponges 2 x 2 | Midwest Veterinary Suppy | 366.23000.4 | Used Dry, w/ 70% Alcohol, and 2% Chlorohex Solution |
| 4 ml serum separator tubes | Midwest Veterinary Supply | 366.45000.4 | blood collection tube for superchem panel |
| K2EDTA, 2 ml | VWR | 95057-239 | blood collection tubes |
| Aprotinin, 100 mg | Sigma | A1153-100MG | blood collection tube protease additive |
| 22 G x 1" Catheters | Midwest Veterinary Suppy | 193.75250.2 | I.V. catheter |
| Injection Plug W/ Cap | Midwest Veterinary Suppy | 001.11500.2 | %50 dextrose infusion port |
| Porus Tape, 1/2" x 10 yd | Midwest Veterinary Suppy | 001.85000.2 | maintain adherance of catheters and hep. Locks |
| Chlorhexidine Solution 2% | Midwest Veterinary Suppy | 193.08855.3 | prep catheter site |
| 70% Ethanol | VWR | 71001-654 | prep catheter site |
| tourniquet | Webster | 07-8003432 | |
| 3-way stopcock | Midwest Veterinary Supply | 366.28510.4 | hep. lock |
| 37" extension set | Webster | 07-8454200 | hep. lock |
| Exel 50-60cc LL Syringes | Midwest Veterinary Suppy | 001.12250.2 | Heparinized saline flush |
| 250 ml bag 0.9% saline | Webster | 07-8365593 | flush |
| 1,000 U Heparin, 10 ml | Webster | 07-883-4916 | |
| Ketamine (Ketaset) 100 mg/ml | Fort Dodge | (AV ordered) | |
| Precision Xtra glucose test strips 50/bx | Abbott (American Diabetes Wholesale) | 9381599728K7 | test baseline/T3 blood glucose levels |
| Masimo Rad 57 | DRE | 6052057V | pulse-oximeter |
| Pavia rectal thermometer | Patterson | 07-8391335 | |
| Precision Xtra Glucometer | Abbott | 9381599728K7 | Handheld glucometer |
References
- Bergman, R., Phillips, L., Cobelli, C. Physiologic evaluation of factors controlling glucose tolerance in man. J. Clin. Invest. 68, 1456-1457 (1981).
- Bergman, R., Prager, R., Volund, A., Olefsky, J. M. Equivalence of the insulin sensitivity index in man derived by the minimal model and the euglycemic glucose clamp. J. Clin. Invest. 79, 790-800 (1987).
- Hovorka, R., et al. Partitioning glucose distribution/transport, disposal, and endogenous production during IVGTT. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 282, E992-E1007 (2002).
- Salinari, S., Guidone, C., Bertuzzi, A., Manco, M., Asnaghi, S., Mingrone, G. First-phase insulin secretion restoration and differential response to glucose load depending on the route of administration in type 2 diabetic subjects after beriatric surgery. Diabetes Care. 32 (3), 375-380 (2009).
- Clinical Diabetes Research: Methods and Techniques. Roden, M. , John Wiley & Sons. (2007).
- Cobelli, C., Pacini, G. Insulin secretion and hepatic extraction in humans by minimal modeling of c-peptide and insulin kinetics. Diabetes. 37, 223-231 (1988).
- Lorenzo, C., et al. Disposition index, glucose effectiveness, and conversion to type 2 diabetes: the insulin resistance atherosclerosis study. Diabetes Care. 33, 2098-2103 (2010).
- Hansen, B. C. Investigation and treatment of type 2 diabetes in nonhuman primates. Methods Mol Biol. 933, 177-185 (2012).
- Hansen, B. C., Bodkin, N. L. Standardization of IVGTT. Importance of method used to calculate glucose disappearance. Diabetes Care. 16 (5), 847 (1993).
- Hardwood, J. H., Listrani, P., Wagner, J. D. Nonhuman primates and other animal models in diabetes research. J Diabetes Sci Tech. 3, 503-514 (2012).
- De Koning, E. J., Bodkin, N. L., Hansen, B. C., Clark, A. Diabetes mellitus in Macaca mulatta monkeys is characterized by islet amyloidosis and reduction in beta-cell population. Diabetologia. 36, 378-384 (1993).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Insulin secretion, clearance and action before and after gastroplasty in severely obese subjects. Int J Obes Relat Metab Disord. 18, 295-300 (1994).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Postgastroplasty recovery of ideal body weight normalizes glucose and insulin metabolism in obese women. J Clin Endocrinol Metab. 80, 364-369 (1995).
- Kim, S. H., Abbasi, F., Chu, J. W., McLaughlin, T. L., Lamendola, C., Polonsky, K. S., Reaven, G. M. Rosiglitazone reduces glucose-stimulated insulin secretion rate and increases insulin clearance in nondiabetic, insulin-resistant individuals. Diabetes. 54, 2447-2452 (2005).
- Toffolo, G., Breda, E., Cavaghan, M. K., Ehrmann, D. A., Polonsky, K. S., Cobelli, C. Quantitative indexes of beta-cell function during graded up and down glucose infusion from C-peptide minimal models. Am J Physiol Endocrinol Metab. 280, E2-E10 (2001).
- Wang, X., et al. Quantification of beta-cell insulin secretory function using a graded glucose-infusion with C-peptide deconvolution in dysmetabolic, and diabetic cynomolgus monkeys. Diabetology and Metabolic Syn. 5, 40 (2013).
- Xiao, Y. F., Wang, B., Wang, X., Du, F., Benzinou, M., Wang, Y. X. Xylazine-induced reduction of tissue sensitivity to insulin leads to acute hyperglycemia in diabetic and normoglycemic monkeys. Anesthesiology. 13 (33), (2013).
- Porte, D., Kahn, S. β-cell dysfunction and failure in type 2 diabetes potential mechanisms. Diabetes. 50, Suppl 1. S160-S163 (2001).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), G214-G223 (1979).
- Ferrannini, E., Gastaldelli, A., Miyazaki, Y., Matsuda, M., Mari, A., DeFronzo, R. A. β-cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J Clin Endocrinol Metab. 90 (1), 493-500 (2005).
- Vaughan, K. L., Szarowicz, M. D., Herbert, R. L., Mattison, J. A. Comparison of anesthesia protocols for intravenous glucose tolerance testing in rhesus monkeys. J Med Primatol. 43, 162-168 (2014).
- Kemnitz, J. W., Kraemer, G. W. Assessment of glucoregulation in rhesus monkeys sedated with ketamine. American Journal of Primatology. 3, 201-210 (1982).
- Dutton, C. J., Parvin, C. A., Gronowski, A. M. Measurement of glycated hemoglobin percentages for use in the diagnosis and monitoring of diabetes mellitus in nonhuman primates. Am J Vet Res. 64, 562-568 (2003).
- Rai, V., Iyer, U., Mani, I., Mani, U. V. Serum biochemical changes in insulin dependent and non-insulin dependent diabetes mellitus and their role in the development of secondary complications. Int J Diab Dev Countries. 17, 33-37 (1997).
- Shirasaki, Y., Yoshioka, N., Kanazawa, K., Maekawa, T., Horikawa, T., Hayashi, T. Effect of physical restraint on glucose tolerance in cynomolgus monkeys. J Med Primatol. 42, 165-168 (2013).
