Summary
Целью данного протокола является представить стандартный метод для выполнения внутривенных тестов на толерантность к глюкозе (IVGTTs) для оценки гликемического контроля в приматах и оценить их метаболического статуса от здоровых до дисметаболического.
Abstract
Тест на толерантность к глюкозе для внутривенного введения (ВТТГ) играет ключевую роль в характеристике гомеостаза глюкозы. Когда вместе с сывороточных биохимических профилей, включая уровень глюкозы в крови в обоих кормили и голодном состоянии, HbA1c, уровень инсулина, клинической истории диеты, состава тела и состояния массы тела, оценку нормального и аномального гликемического контроля может быть сделано , Интерпретация ВТТГ осуществляется путем измерения изменений уровня глюкозы и инсулина в течение долгого времени по отношению к декстрозы вызов. Критические компоненты , которые необходимо учитывать , являются: пиковые уровни глюкозы и инсулина достигли по отношению к Т0 (конец глюкозы инфузии), клиренс глюкозы K происходит от наклона быстрый клиренс глюкозы в первые 20 мин ( от Т1 до Т20), время вернуться к глюкозе базовой линии, а площадь под кривой (AUC). Эти меры ВТТГ покажут характерные изменения как гомеостаз глюкозы перемещается от здорового тоа больное метаболическое состояние 5. Здесь мы опишем характеристику приматах (макак и яванских макак), которые являются наиболее актуальными животной моделью диабета II типа (T2D) в организме человека и ВТТГ и клинические профили этих животных из тощий здоровым, ожирением дисметаболического, и T2D состояние 8, 10, 11.
Introduction
ВТТГ является удобным функциональный анализ , который обычно используется для определения функции β-клеток в организме человека при различных метаболических состояниях 5, 7. В экспериментах на животных моделях СД2, она хорошо известна в качестве инструмента для характеристики животных , которые показывают прогрессирование болезни обмена веществ из здоровый к дисметаболического гипергликемии 8, 9. ближайшим животная модель СД2 показана в приматах (NHPs), из которых макаки и циномолгус макаки являются яркими примерами. Эти животные естественным образом развиваются СД2 с теми же факторами риска возраста и ожирения , способствующего его падения , как у людей 10. Кроме того, существует прогрессию тем же заболеванием и панкреатический патология , показывающая отложения амилоида , как болезнь прогрессирует дисметаболического 11.
Здесь мы сообщаем о нашем стандартном способе выполнения ВТТГ в NHPs как часть нашей колонии характеристики метаболического статуса у этих животных. Этот методлегко выполнить по отношению к другим, более отнимает много времени и дорогостоящих методов 2. ВТТГ полезен для характеристики большой колонии животных быстро и часто. Когда принимается во внимание с уровнем гликированного гемоглобина (HbA1c), история диеты и потребление продуктов питания животного, а также их процент мышечной массы и жира тела, то ВТТГ обычно достаточно для характеристики метаболического статуса животного и прогрессии к откровенного диабета 6 , 8.
HbA1C представляет собой средний уровень гликемии в течение жизни красных кровяных клеток, обеспечивая надежное измерение уровня глюкозы в течение предыдущих шести недель до трех месяцев. При измерении от голодном образца базовой линии крови ВТТГ, это значение обеспечивает окно в гликемический контроль в течение месяца между процедурами. Если животное переходил от дисметаболического к диабетическим с момента их последней ВТТГ, значение HbA1C намного выше, чем их предыдущее значение будет указыватьчто переход начался вскоре после их последнего ВТТГ, в то время, значение HbA1C ближе к их предыдущему значению будет означать, что они только недавно перешли. В общем, в макак - резусов, HbA1C значения больше 6% считаются ненормальным, и указывают на бедных гликемический контроль 10, 23.
Гликемический уровни должны интерпретироваться в контексте поведения и общего состояния здоровья животного в целом. Диабетические макаки - как люди - выставочная гиперфагия, полидипсия и полиурия. Группа корпус животных обеспечивает значительные проблемы для измерения этих показателей и индивидуального ухода, необходимых для дисметаболического и диабетических обезьян. Мы рекомендуем одиночно жилье животных в целях , которые могут быть предоставлены более персонализированный уход, и поведенческие маркеры здоровья обезьяны более легко контролировать 8. Кроме того, диабетические макаки будет проявлять потерю веса, а также повышенный липидный профиль (повышениехолестерина, гипертриглицеридемия) и нарушения минерального обмена в сыворотке крови химии. Важно , чтобы измерить маркеры функции печени и почек в сыворотке крови химии, так как повреждение этих органов часто сопровождаются осложнениями опережения нарушением обмена веществ / сахарный диабет, и могут быть совместно детерминанты гликемии, липидов и минеральных дисбалансов 9, 11, 18, 24 ,
При использовании этого метода, исторические ценности, полученные от нескольких, часто характеризации над жизнью обезьяны имеют особую ценность. Если другие процедуры, такие как зажим глюкозы или градуированного инфузии глюкозы (ГГИ), которые необходимы для полной оценки здоровья животного, то обычно при первоначальной характеристике, когда их история недоступна. Однако, как только базовая линия была установлена, повторяющиеся IVGTTs от частотой каждые три месяца, как правило, достаточно, чтобы отслеживать прогресс животного. Это особенно важно, когда животные обучаются на несколько исследований по всему объемукалендарный год на основе их метаболического статуса. В то время как их здоровье может оставаться относительно стабильными в течение многих лет в то время, когда метаболический статус животного ухудшается, резкое увеличение резистентности к инсулину и нарушение толерантности к глюкозе может происходить очень быстро. Значения HbA1c позволяют некоторой интерполяции снижения или улучшения состояния здоровья животного между процедурами запланированных трех месяцев друг от друга. По этой причине этот способ идеально подходит для характеристики животных, используемых в нескольких продольных исследованиях в течение их естественной продолжительности жизни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных были одобрены Дэвид Х. Мердок научно-исследовательский институт IACUC, расположенный на North Carolina Research Campus (НКРС), по протоколу 14-017, характеристика нечеловеческого примата модели диабета и преддиабета / резистентности к инсулину и эффективности терапии для улучшения чувствительность к инсулину и метаболические функции.
1. Отбор животных и исследование Подготовка
- Выбор диеты и вес стабильных животных на основе ежемесячных потребление пищи и веса тела записей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, которые экспонируются недавнее снижение аппетита не должно быть охарактеризовано, пока их потребление пищи не стабилизируется.- Для взрослых животных (> 5 - 6 лет), не выбирайте животных, чьи тела веса между последовательными месяцев отличаться более чем на 10% без предварительного изучения обезьян и исключения других, чем изменение метаболического статуса для резкого изменения веса причин.
- Для получения глюкозы, инсулина и С-peptiде аналитов, готовят K 2 ЭДТА пробирки для взятия проб с ингибитором протеазы (апротинина и DPP4I).
Примечание: Коктейль DPP4I + Апротинин обеспечивает широкий спектр ингибирования протеазы если это требуется для дополнительных аналитов (глюкагона, GLP-1). В случае, когда дополнительные аналитов не собраны, пробирки крови должны быть подготовлены таким же образом, чтобы поддерживать согласованность сбора проб. Образцы для анализов не утвержденных для этого метода следует собирать отдельно, в соответствии с рекомендациями производителя.- Приготовьте коктейль ингибиторов протеаз путем смешивания 100 мг лиофилизованных Апротинин с 10 мл DPP4I. Добавляют 10 мкл смеси апротинина + DPP4I в каждую пробирку крови для каждого миллилитр крови, собранной.
- Добавить еще 10 мкл ингибитора протеаз в каждую пробирку для возможного великовозрастных сбора. Хранить пробирки обрабатывают кровь при -20 ° С до использования. Держите трубки на мокром льду во время процедуры, применяемыевновь и спина при 4 ° С.
- Используйте сыворотку разделительную трубку, чтобы собрать пробы крови на исходном уровне для стандартного химического анализа сыворотки. Для полного анализа клеток крови (CBC), используют стандартную K 2 EDTA без ингибиторов протеазы. Используйте криопробирки к аликвоты плазмы и сыворотки после образцов крови были откручивали.
- Пометьте пробирки крови и криопробирки надлежащим образом с идентификацией животных, даты, процедуры временной точки, и объема образца. Этикетка криопробирки с анализируемым веществом (ами) в плазме для соответствующего анализа.
- Готовят гепаринизированной соленых флеш путем введения 0,15 мл 1000 USP единиц на мл гепарина в 250 мл мешок нормального физиологического раствора с. Получают раствор 0,06 мг / мл гепарина. Draw 40 - 60 мл этого раствора в солевом замком для смыва между образцами. Draw дополнительно 1 мл и 5 мл в отдельные шприцы для промывки декстрозы для инфузии порта до и после инфузии, соответственно.
2.Седативный животных и подготовка
- Удалите пищу из клетки животного не менее 14 часов перед процедурой и не более 18 часов.
Примечание: Важно, чтобы животные быть голодали в течение процедуры, чтобы избежать каких-либо постпрандиальной вариации гликемии значений. Он также является мерой предосторожности, чтобы избежать регургитации и аспирации содержимого желудка в то время как под наркозом. - Уравновешенных животных во время процедуры ВТТГ с кетамина внутримышечно в качестве общего наркоза, в дозе 10 мг / кг. Администрировать дополнительные кетамин (5 - 10 мг / кг) с интервалом 20 - 30 мин, или по мере необходимости, во время процедуры.
- Взвесьте успокоительное животное. Поместите животное в лежачем положении в боковом направлении на процедуре стол с подогревом.
- Монитор клинических параметров каждые 15 до 20 минут, чтобы убедиться, что животное находится в стабильной плоскости анестезии. Измерьте частоту сердечных сокращений (100 - 200 уд) и SPO 2 (> 92%) с пульсоксиметр. Измерьте частоту дыхания (20 - 50 вдохов / мин) W Ith секундомером, отсчитывая дыханий визуально или вручную в течение пятнадцати секунд и умножить на четыре. Измерение температуры (> 97 ° F) ректально. Монитор цвет слизистой оболочки вокруг десен и губ (влажная, розовая).
- Приготовьте два канюли сайтов. Используйте машинки для стрижки волос, чтобы обрезать волосы из интересующей области, где будет вставлен катетер, и стерилизовать весь регион с чередующимися скрабы хлоргексидина и 70% спирта.
- Поместите один катетер в области левого или правого головное или подкожных вен и прикрепить его к гепарин соленых флеш (0,06 мг гепарина / мл) с трехходовым запорным краном. Это забор крови сайт выборки.
- Поместите второй катетер в другой ноге или руке в области головных или подкожных вен и прикрепить порт. Используйте этот сайт для декстрозы инфузии. Используйте небольшой, 1 мл вровень гепаринизированной физиологического раствора, чтобы держать патент канюли до декстрозы инфузии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура ВТТГ состоит из 8 взятия проб крови Жеребьевка моменты времени (таблица 1).
- Возьмите базовый образец и использовать ручные глюкометр для измерения уровня глюкозы в крови натощак. Получить образец сыворотки для стандартного химического анализа, а также пробы цельной крови для анализа крови для оценки общего состояния здоровья животного. Сбор образцов плазмы для анализа глюкозы и инсулина в крови от базового образца с использованием набора проверенную для использования с макак в соответствии с инструкциями изготовителя 8, 9.
Примечание: Важно иметь заранее жеребьевку 0,5 мл, взятых из канюли до принятия любого образца для сбора крови, чтобы удалить остатки крови или гепарином в мертвом пространстве канюли. - После получения базового образца, влить в дозе 50% раствора декстрозы (250 мг / кг) в течение 30 сек в декстроза инфузионной порт.
Примечание: модели с более высокой дозе (500 мг / кг) может быть использован,хотя доза должна быть исправлена через процедуры, чтобы сделать продольные сравнения.- Промыть инфузионной порт с 5 мл гепаринизированной физиологического раствора, чтобы убедиться, что не осталось в порту декстрозы. Конец инфузии является Т0. Есть техник заменить перчатки, так как остаточная декстрозы из настоя может загрязнить последующие образцы крови.
- Первый пост-инфузионный момент времени выборки в T3 мин, с конца декстрозы инфузии, а затем T5 мин, T7 мин, T10 мин, мин Т15, Т20 мин, а последний образец момент времени находится в T30 мин. Собирают плазму от каждой временной точки до уровней анализа глюкозы и инсулина с исходным образцом (см шаг 3.1).
- В T3 мин момент времени, используйте Ручной глюкометр, чтобы еще раз проверить уровень глюкозы в крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глюкометр показания на базовом и T3 только для подтверждения вливания декстрозы. Уровень глюкозы в крови в T3 мин момент времени должна быть ~ 100 мг / дл выше, COmpared до уровня глюкозы в плазме натощак базового уровня.
- В T3 мин момент времени, используйте Ручной глюкометр, чтобы еще раз проверить уровень глюкозы в крови.
4. Восстановление и обработки образцов животных
- Удалите канюль и оказать давление на катетеризированных участков для гемостаза после Т30 мин временной точке. Монитор животное, пока она не очнулась и сидит. корма Предложение, как только животное полностью выздоровел.
- Немедленно поместите каждый пробы цельной крови в K 2 EDTA пробирки на льду. Центрифуга при 3000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 10 мин после сбора. Образцы Алиготе плазмы в криопробирок, замораживании и хранят при -80 ° С до анализа.
- Дайте крови в сыворотке крови пробирку для стандартного химического анализа сыворотки постоять при комнатной температуре в течение не менее 20 мин и не более чем за 30 минут до центрифугирования при 3000 оборотов в минуту при комнатной температуре. Замораживание образцов сыворотки до проведения анализа в течение 48 часов сбора.
Примечание: хранить в холодильнике образцы цельной крови не собираемые для анализа CBC до техСайед в течение 24 часов сбора.
- Дайте крови в сыворотке крови пробирку для стандартного химического анализа сыворотки постоять при комнатной температуре в течение не менее 20 мин и не более чем за 30 минут до центрифугирования при 3000 оборотов в минуту при комнатной температуре. Замораживание образцов сыворотки до проведения анализа в течение 48 часов сбора.
5. Лечение данных
- После установления кривых инсулина в плазме и глюкозы, определяют скорость клиренса глюкозы K из наклона натуральный логарифм значений глюкозы выше базовой линии 16, 17.
Примечание: Здоровый NHP можно ожидать, имеют скорость клиренса глюкозы K значительно выше 1, часто больше , чем 2 или более, в качестве здорового животного часто возвращаются к значениям глюкозы базовой линии в течение 30 мин. Поскольку производство инсулина падает, клиренс глюкозы K будет падать более резко, упав ниже 1. - Вычислить АУК в целом, как сумма итогов площади трапеций , представляющих собой площадь под кривой каждого отрезка между временных точках, через Т30 16, 17.
ПРИМЕЧАНИЕ: Традиционно, АУК первых десяти минут процедуры считается acutе инсулиновый ответ на глюкозу (воздух), в то время как ППК от последнего 20 мин процедуры считается ответ поздно инсулина (LIR). По мере того как животное становится более дисметаболического, АУК инсулина будет увеличиваться, что отражает компенсацию за бесчувственность увеличении чувствительности к инсулину. Когда животное переходы к откровенного диабета, однако, AUC будет уменьшаться, часто сначала в острой фазе инсулина, захваченный воздух.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты , показанные на рисунке 1 , являются наглядными типичных глюкозы и инсулина кривых из зрелых, здоровых и диабетических яванских макак в течение 30 мин ВТТГ а. Данные из здоровых и продвинутых диабетических обезьян приведены для того, чтобы противопоставить очевидные различия между животными из обоих крайних концах диапазона метаболических характеристик. Этот протокол ВТТГ был успешно использован авторами в макак-резусов с аналогичными результатами.
Постился, базовые значения глюкозы здорового макак (макак и яванских) может быть ниже, чем от 50 до 60 мг / дл 8. Как показано на рисунке, начальная отклонения глюкозы - измеренная при T3 - для здорового NHP не может подняться так высоко, как типичного исходного значения глюкозы для диабетического животного, который часто превышает 200 мг / дл. В течение следующих тридцатиминут, уровни глюкозы здорового животного часто возвращаются к их исходным значениям, в то время как дисметаболического и диабетических животных не (рисунок 1, сплошные линии). Сопровождающий кривая инсулина для здорового животного показывает два пика (рис.1, пунктирная синяя линия), которые соответствуют к начальному, быстрое снижение уровня глюкозы в крови (фаза 1) , опосредованного в большем, чем обычно , частично за счет периферических эффектов инсулина на глюкозу транспорта и потребления кислорода 3, 4. величина этих периферических эффектов, даже во время первой фазы инсулинового ответа, не совпадает с вкладом печени снижение глюкозы, которое, в течение меньшего , но более продолжительного второго пика инсулина (фаза 2 ), оказывает наибольшее влияние на гликемический уровнях путем подавления эндогенной продукции глюкозы 1.
Как животное прогрессирует от здоровых к дисметаболического, там, как правило, умаление гое первая фаза инсулинового ответа на декстрозы болюса, который может быть отражено в уменьшенном AIR. Тем не менее, ППК может оставаться неизменным, поскольку будет более часто быть общее увеличение выработки инсулина, обеспечивая в основном без изменений уровней гликемии в течение процедуры , как увеличение производства инсулина компенсирует снижение чувствительности. После того, как животное становится явно диабетический, выработка инсулина резко падает в ответ на декстрозы болюса (фиг.1; пунктирная красная линия). Гликемический уровни будут оставаться повышенным в течение процедуры, как то , что клиренс глюкозы происходит в настоящее время опосредованный почти полностью не принимающих инсулин-зависимых механизмов (Рисунок 1).
Рисунок 1: ВТТГ Глюкоза Клиринг и инсулина производства Кривые для диабетиков и Healthy контрольных животных. показанные здесь глюкоза (сплошная линия) и инсулина (пунктирная линия) кривые для здорового (синяя линия) и диабетических (красная линия) животных. Эти значения являются средними фактических данных , собранных в ходе IVGTTs , выполненных на яванских макак (диабетическая глюкозы: N = 27; здоровый глюкоза: п = 21; диабетическая инсулина: п = 23; здорового инсулина: п = 20; баров стандартная ошибка показана). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Часы Время | Моменты времени (мин) | реальное время | Количество пробы крови (мл) | образец для анализа | Глюкометр Рединг (мг / дл) | |
| базовая линия | 5 мл | 1,5 мл SST - химия 0,5 мл K 2 ЭДТА - CBC, HbA1c 3 мл К 2 ЭДТА + 50 мкл Prot -. Глюкоза, инсулин, С-ПЭП | ||||
| 0 | Декстроза вливание 250 мг / кг внутривенно, учитывая в течение 30 сек, а затем 5 мл гепарин соленых флеш | |||||
| 3 | 2,0 мл | K 2 ЭДТА + 30 мкл Prot .: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 5 | 2,0 мл | K 2 ЭДТА + 30 мкл Prot .: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 7 | 2,0 мл | K 2 ЭДТА + 30 мкл Prot .: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 10 | 2,0 мл | K 2 ЭДТА + 30 мкл Prot .: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 15 | 2,0 мл | K 2 ЭДТА + 30 мкл Prot .: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 20 | 2,0 мл | K 2 ЭДТА + 30 мкл Prot .: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 30 | 2,0 мл | K 2 ЭДТА + 30 мкл Prot .: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
Таблица 1:. ВТТГ Процедура Таблица Здесь показан стандартный отчет процедура для ВТТГ, в котором подробно всю необходимую информацию о захваченных во время процедуры. Часы раз для образца розыгрышей после декстрозуинфузия должна быть рассчитана с конца инфузии. Фактическое время должны быть записаны для каждого тиража. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить эту таблицу в качестве документа Microsoft Word.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ВТТГ оценивает способность глюкозы-стимулированной секреции инсулина с помощью одной декстрозы инфузии в зависимости от веса тела 5, 12, 13. Из анализа, глюкозы в крови натощак и уровень инсулина достигается, и это позволяет оценить способности животного к освобождение инсулина и вернуть повышенный уровень глюкозы в сторону базовой линии. Это предоставляет пользователю информацию, чтобы охарактеризовать животное, как нормальный глюкозы и здорового контроля уровня инсулин, гиперинсулинемия дисметаболического животное с нормогликемии или гипергликемии инсулинорезистентностью диабетического животного.
Важно, что образцы крови, особенно из ранних моментов времени, после инфузии декстрозы, рисуются и обрабатываются своевременно и последовательно. Это позволит уменьшить изменчивость внутри и между субъектами, а также уменьшить возможности для ошибок во временном порядке данных. Выбор времени T3 имеет решающее значение, так как экскурсионный OF глюкозы в плазме от исходного уровня до трех минут после инфузии декстрозы является одной из конечных точек, которые используются для характеристики метаболического статуса животных. Существует снижение клиренса глюкозы в течение первых 7 - 10 мин после инфузии декстрозы, которые могут быть пропущены, если таковые крови ничьи не принимаются вовремя. Это область под этой части как глюкоза и кривые инсулина, который используется в качестве конечной точки, подчеркивая важность этих ранних моментов времени. Если забор крови после T3 берется поздно, процедура может продолжаться, но фактическое время жеребьевки должны быть представлены для того, чтобы сохранить истинную форму кривой, насколько это возможно. Это особенно важно, чтобы отклонения более чем за минуту быть захвачены и сообщает. После первых десяти минут, клиренс глюкозы имеет тенденцию становиться более постепенным, и не может вернуться к исходному уровню в течение 30 мин (рисунок 1). Процедура может быть продлен путем отбора проб через каждые 10 мин после Т30 дозахватить как долго это берет животное, чтобы вернуться к исходному уровню.
IVGTTs ограничены их способностью непосредственно измерить чувствительность к инсулину. Это в первую очередь полезен в качестве метода оценки производства инсулина и клиренса глюкозы. Тем не менее, печеночной экстракции инсулина из питания портал крови ставит под угрозу измерения "секреции инсулина" из системного кровоснабжения. Это может быть частично преодолены, однако, путем измерения С-пептида, который секретируется в эквимолярных количествах из поджелудочной железы, но не удаляется печенью перед поступлением в общее кровоснабжение. Это дает более четкое представление о продукции инсулина , чтобы лучше оценить функцию β-клеток 16. Кроме того , IVGTTs не различают инсулинзависимым механизмы клиренса глюкозы и инсулиннезависимый механизмы 1, 6. В то время как чувствительность к инсулину может быть оценена косвенно путем минимального моделирования данных из ВТТГ, более надежные меры могут быть достигнуты с помощью гое использование процедур , таких как градуированное Глюкоза Infusion (ГГИ), которая обеспечивает кривую β-клеток доза-реакция 14, 15.
Тем не менее, чувствительность к инсулину по-прежнему оценивается лишь косвенно с ГГИ. Стандартная доза инсулина может быть введена животному в ВТТГ для улучшения оценки чувствительности к инсулину, но что будет маскировать эндогенную продукцию инсулина, ставя под угрозу оценку функции β-клеток. Гипергликемическую и методы гиперинсулинемическими клещи измеряют непосредственно к глюкозе регулирование с помощью контролируемого воздействия инсулина. Недостатком обоих ПИГСТ и методов защелкой , что они дороги , чтобы выполнить и требуют , чтобы завершить больше персонала и времени (иногда до тех пор, от шести до восьми часов, в зависимости от конструкции процедур) 16. ВТТГ, с другой стороны, может быть выполнена менее чем за час, и с минимальной рабочей силы.
Как правило, здоровое животное будет утилизировать глюкозу очень быстрымLY, часто возвращаются к своим исходным значениям в течение 30 мин, а их кривая инсулина будет демонстрировать два различных пика для острых и поздних ответов инсулина. Как животное становится более дисметаболического, их постился глюкозу и их глюкозы экскурсии в первые три минуты после инфузии может увеличиться. Тем не менее, эти значения могут изменяться в широких пределах среди здоровых животных, и являются наиболее информативными прогрессирования заболевания по сравнению с историческими значениями из того же самого животного. В целом, однако, клиренс глюкозы из дисметаболического животного может не сильно отличаться от того, когда они были здоровыми. Первые признаки прогрессирования заболевания будут наиболее очевидны в кривой инсулина. В то время как постился уровень инсулина может быть только слегка повышенным, АУК инсулина, как правило , резко возрастет в дисметаболического животных, отражая компенсации развивающегося нечувствительности к инсулину. По мере понижения функции β-клеток, хотя, притупление ответной реакции острой фазы инсулина может быть видно. Tего будет отражено в пониженной AIR, который, когда нормализуется к исходному уровню, может приближаться к 0 в диабетической обезьяны. Это сопровождается общим снижением выработки инсулина и резкому снижению клиренса глюкозы 8, 9, 10, 11.
Метаболический статус животного может быть трудно определить с помощью одного ВТТГ. Это может быть случай, когда пытаются различать животное или как ранней дисметаболического или преддиабетическим. Когда становится все более дисметаболического, производство инсулина повышается для поддержания эугликемии. В то время как голодали значения глюкозы может слегка повышен, утилизации глюкозы нарушенная не становится весьма очевидным , пока функция β-клеток не была нарушена , и выработка инсулина начинает снижаться 18, 20. В течение периода времени, до того откровенного диабета установил в, значения инсулина может напоминать кривую раннего дисметаболического животного, у которых первая реакция фаза была нарушена, но некоторые инсулин STILL производится над постились, исходными значениями. Из-за этого, АУК кривой инсулина раннего дисметаболического и prediabetic животного могут быть очень похожи. В этой ситуации, повышенный кривой глюкозы, будучи влияние как инсулин-зависимый и не принимающих инсулин-зависимых механизмов, не является достаточным, чтобы отличить животное или как рано дисметаболического или преддиабетическим. Это различие может быть сделано путем выполнения гиперинсулинемическими / эугликемическое зажим, который будет непосредственно продемонстрировать чувствительность к инсулину 19. В качестве альтернативы, это различие может быть сделано при выполнении другой ВТТГ на животное после нескольких месяцев. В последнем случае, если ППК кривой возрастает инсулина, можно считать животное было рано дисметаболического в момент первой процедуры. Если АУК уменьшается, тем не менее, статус дисметаболического животного может рассматриваться как было выдвинуто / prediabetic во время первой характеристике. Prediabetic состояние также может быть accompanс использованием СВУ потерей массы тела и увеличение потребления жидкости в течение периода времени, прошедший две процедуры ВТТГ. Эти обстоятельства показывают, почему ВТТГ является особенно полезным инструментом при рассмотрении в свете истории таких процедур, в отличие от использования в качестве снимка здоровья животного.
Использование стула с ограничением в сознании животных было продемонстрировано , чтобы произвести значительное повышение уровня глюкозы в крови во время толерантности к глюкозе тестирования 25. По этой причине животные седатированы для этой процедуры. Тем не менее, необходимо проявлять осторожность при выборе анестетика. Сообщалось о том , что использование ofα2-адренорецепторов агонисты , такие как ксилазином и дексмедетомидина для премедикации может значительно увеличить уровень глюкозы в крови в приматах , 17, 21. Метод сообщил здесь только использует кетамин для седации, которая не вызывает уровень глюкозы в крови расти 22. В некоторых случаях, животное может проявлятьтакая жесткость и Tensing, что техник может чувствовать себя релаксант необходимо. В таких случаях, диазепам и Telazol было продемонстрировано, имеют гораздо менее глубокое воздействие на производство инсулина и метаболизм глюкозы затем α2-адренорецепторов , агонисты 21. Следовательно, важно рассмотреть обезболивающий режим в метаболических тестах, таких как ВТТГ. Таким образом, ВТТГ представляет собой простой метаболический тест функция, которая обычно выполняется в NHPs, тем не менее он может дать ценную информацию для классификации животных в колонии в различных метаболических состояниях, следовательно, информирование их ухода за животными и управления здравоохранением, а также их потенциальную полезность в моделях болезни обмена веществ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы были связаны с контрактной исследовательской организацией (Crown Bioscience), действующих в области метаболических заболеваний.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить сильную поддержку со стороны персонала по уходу за животными DHMRI CLAS, руководитель фонда г-н Даниэль Перальта и посещение ветеринара, д-р Glicerio Игнасио, DVM MRCVS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-15R Centrifuge | plasma: 4 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Sorvall ST16R Centrifuge | serum: 22 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Thermo Scientific -86 °C Freezer, Forma 88000 Series | Model: 88500A | ||
| Dextrose 50% (D50) | Webster | 07-8008986 | I.V. glucose infusate |
| 3 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | serial blood draws | |
| 5 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | heparinized saline flush | |
| 10 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | delivery of I.V. D50 | |
| Gauze sponges 2 x 2 | Midwest Veterinary Suppy | 366.23000.4 | Used Dry, w/ 70% Alcohol, and 2% Chlorohex Solution |
| 4 ml serum separator tubes | Midwest Veterinary Supply | 366.45000.4 | blood collection tube for superchem panel |
| K2EDTA, 2 ml | VWR | 95057-239 | blood collection tubes |
| Aprotinin, 100 mg | Sigma | A1153-100MG | blood collection tube protease additive |
| 22 G x 1" Catheters | Midwest Veterinary Suppy | 193.75250.2 | I.V. catheter |
| Injection Plug W/ Cap | Midwest Veterinary Suppy | 001.11500.2 | %50 dextrose infusion port |
| Porus Tape, 1/2" x 10 yd | Midwest Veterinary Suppy | 001.85000.2 | maintain adherance of catheters and hep. Locks |
| Chlorhexidine Solution 2% | Midwest Veterinary Suppy | 193.08855.3 | prep catheter site |
| 70% Ethanol | VWR | 71001-654 | prep catheter site |
| tourniquet | Webster | 07-8003432 | |
| 3-way stopcock | Midwest Veterinary Supply | 366.28510.4 | hep. lock |
| 37" extension set | Webster | 07-8454200 | hep. lock |
| Exel 50-60cc LL Syringes | Midwest Veterinary Suppy | 001.12250.2 | Heparinized saline flush |
| 250 ml bag 0.9% saline | Webster | 07-8365593 | flush |
| 1,000 U Heparin, 10 ml | Webster | 07-883-4916 | |
| Ketamine (Ketaset) 100 mg/ml | Fort Dodge | (AV ordered) | |
| Precision Xtra glucose test strips 50/bx | Abbott (American Diabetes Wholesale) | 9381599728K7 | test baseline/T3 blood glucose levels |
| Masimo Rad 57 | DRE | 6052057V | pulse-oximeter |
| Pavia rectal thermometer | Patterson | 07-8391335 | |
| Precision Xtra Glucometer | Abbott | 9381599728K7 | Handheld glucometer |
References
- Bergman, R., Phillips, L., Cobelli, C. Physiologic evaluation of factors controlling glucose tolerance in man. J. Clin. Invest. 68, 1456-1457 (1981).
- Bergman, R., Prager, R., Volund, A., Olefsky, J. M. Equivalence of the insulin sensitivity index in man derived by the minimal model and the euglycemic glucose clamp. J. Clin. Invest. 79, 790-800 (1987).
- Hovorka, R., et al. Partitioning glucose distribution/transport, disposal, and endogenous production during IVGTT. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 282, E992-E1007 (2002).
- Salinari, S., Guidone, C., Bertuzzi, A., Manco, M., Asnaghi, S., Mingrone, G. First-phase insulin secretion restoration and differential response to glucose load depending on the route of administration in type 2 diabetic subjects after beriatric surgery. Diabetes Care. 32 (3), 375-380 (2009).
- Clinical Diabetes Research: Methods and Techniques. Roden, M. , John Wiley & Sons. (2007).
- Cobelli, C., Pacini, G. Insulin secretion and hepatic extraction in humans by minimal modeling of c-peptide and insulin kinetics. Diabetes. 37, 223-231 (1988).
- Lorenzo, C., et al. Disposition index, glucose effectiveness, and conversion to type 2 diabetes: the insulin resistance atherosclerosis study. Diabetes Care. 33, 2098-2103 (2010).
- Hansen, B. C. Investigation and treatment of type 2 diabetes in nonhuman primates. Methods Mol Biol. 933, 177-185 (2012).
- Hansen, B. C., Bodkin, N. L. Standardization of IVGTT. Importance of method used to calculate glucose disappearance. Diabetes Care. 16 (5), 847 (1993).
- Hardwood, J. H., Listrani, P., Wagner, J. D. Nonhuman primates and other animal models in diabetes research. J Diabetes Sci Tech. 3, 503-514 (2012).
- De Koning, E. J., Bodkin, N. L., Hansen, B. C., Clark, A. Diabetes mellitus in Macaca mulatta monkeys is characterized by islet amyloidosis and reduction in beta-cell population. Diabetologia. 36, 378-384 (1993).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Insulin secretion, clearance and action before and after gastroplasty in severely obese subjects. Int J Obes Relat Metab Disord. 18, 295-300 (1994).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Postgastroplasty recovery of ideal body weight normalizes glucose and insulin metabolism in obese women. J Clin Endocrinol Metab. 80, 364-369 (1995).
- Kim, S. H., Abbasi, F., Chu, J. W., McLaughlin, T. L., Lamendola, C., Polonsky, K. S., Reaven, G. M. Rosiglitazone reduces glucose-stimulated insulin secretion rate and increases insulin clearance in nondiabetic, insulin-resistant individuals. Diabetes. 54, 2447-2452 (2005).
- Toffolo, G., Breda, E., Cavaghan, M. K., Ehrmann, D. A., Polonsky, K. S., Cobelli, C. Quantitative indexes of beta-cell function during graded up and down glucose infusion from C-peptide minimal models. Am J Physiol Endocrinol Metab. 280, E2-E10 (2001).
- Wang, X., et al. Quantification of beta-cell insulin secretory function using a graded glucose-infusion with C-peptide deconvolution in dysmetabolic, and diabetic cynomolgus monkeys. Diabetology and Metabolic Syn. 5, 40 (2013).
- Xiao, Y. F., Wang, B., Wang, X., Du, F., Benzinou, M., Wang, Y. X. Xylazine-induced reduction of tissue sensitivity to insulin leads to acute hyperglycemia in diabetic and normoglycemic monkeys. Anesthesiology. 13 (33), (2013).
- Porte, D., Kahn, S. β-cell dysfunction and failure in type 2 diabetes potential mechanisms. Diabetes. 50, Suppl 1. S160-S163 (2001).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), G214-G223 (1979).
- Ferrannini, E., Gastaldelli, A., Miyazaki, Y., Matsuda, M., Mari, A., DeFronzo, R. A. β-cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J Clin Endocrinol Metab. 90 (1), 493-500 (2005).
- Vaughan, K. L., Szarowicz, M. D., Herbert, R. L., Mattison, J. A. Comparison of anesthesia protocols for intravenous glucose tolerance testing in rhesus monkeys. J Med Primatol. 43, 162-168 (2014).
- Kemnitz, J. W., Kraemer, G. W. Assessment of glucoregulation in rhesus monkeys sedated with ketamine. American Journal of Primatology. 3, 201-210 (1982).
- Dutton, C. J., Parvin, C. A., Gronowski, A. M. Measurement of glycated hemoglobin percentages for use in the diagnosis and monitoring of diabetes mellitus in nonhuman primates. Am J Vet Res. 64, 562-568 (2003).
- Rai, V., Iyer, U., Mani, I., Mani, U. V. Serum biochemical changes in insulin dependent and non-insulin dependent diabetes mellitus and their role in the development of secondary complications. Int J Diab Dev Countries. 17, 33-37 (1997).
- Shirasaki, Y., Yoshioka, N., Kanazawa, K., Maekawa, T., Horikawa, T., Hayashi, T. Effect of physical restraint on glucose tolerance in cynomolgus monkeys. J Med Primatol. 42, 165-168 (2013).
