Introduction
Breathing er en kompleks og viktig aktivitet styres av hjernen, slik at dioksygen (O 2) opptak og karbondioksid (CO 2) eliminering. Den sentrale respirasjonen er generert av et komplekst nettverk som ligger i hjernestammen i begge pattedyr 1, amfibier 2, reptiler 3, fugler 4 og fisker 5. Selv om undersøkelse av puste kan behandles in vivo, nøyaktige mekanistiske undersøkelser krever direkte adgang for luftkontrollnettverk. For å oppnå dette, Adrian og Buytendijk utviklet en redusert gullfisk forberedelse, der elektroder plassert på hjernestammen overflaten posten den genererte rytme forbundet med gjelle ventilasjon 5. Denne tilnærmingen ble deretter tilpasset ved Suzue i 1984 6 for bruk i nyfødte rotter. Ankomsten av dette preparatet har ført til betydelige fremskritt innen luftnevrobiologi. Siden det er relativt enkelt, den teknikk som presenteres here er mottagelig for et bredt spekter av grunnleggende undersøkelser av rytmiske motoriske atferd og deres opprinnelse i nyfødte gnagere.
Det overordnede målet med denne metoden er å spille inn den nevrale korrelerer av inspirasjons aktivitet, kalt en luftveislignende rytme fiktiv puste, produsert av luftnettet. Denne metoden kan brukes i et bredt spekter av forskningsmålene, målretting inspiratoriske svar på respiratoriske variasjoner eller farmakologi både villtype 7 og transgen 8 dyr. Gitt at forsøk utføres ved en lav temperatur, uten sensoriske afferenter, og under betingelser hvor konsentrasjonen av glukose og O 2 innenfor aCSF er høy, blitt reist spørsmål angående den fysiologiske betydningen av den innspilte signal. Mens det er klare forskjeller mellom in vivo og in vitro forhold (f.eks., Hyppigheten av inspiratoriske bursts) gjenstår det faktum at tilstedeværelsen avkjerneelementene i luftnettet 6 gjør det mulig å studere en robust rytme knyttet til en vital homeostatic funksjon 9,10.
Begrunnelsen for utviklingen og bruken av denne teknikk er å legge til rette for direkte tilgang til hjernestammen elementer i luftnettet, som er neppe tilgjengelig in vivo, spesielt hos nyfødte. Hjernestammen er plassert under strengt kontrollerte forhold: den innspilte rytme er ikke modulert av perifere afferente innspill fra lungene eller carotis organer, slik at studien til å fokusere på den sentrale luft stasjonen selv 11. Dermed er denne tilgangen utnyttes til å anvende stimuli og registrere utgangssignalet. I motsetning til pletysmografi opptak, er det respiratoriske rytme modulert av alle komponentene i hele kroppen (f.eks., Lunge distensjon, perifere chemosensors), noe som gjør det vanskelig å anvende nøyaktige stimuli.
I enewborn rotte, består protokollen for opptak av den fjerde ventrale roten signal på en isolert hjernestammen og en avkortet ryggmarg, opprettholdt i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF). Rytmen generert av hjernestammen-ryggmargs preparater er sammensatt av enkelt langsomme bursts som er knyttet til inspirasjons signal 9. Isolerte hjernestammen-ryggmargs preparater er lett skrivbar hos rotter fra post-natal dag 0 til 4 (P0 - P4) 7. Denne fremgangsmåten er ofte brukt til å evaluere hypoksisk respons i luftnettet, og også reaksjonen på hyperkapni, acidose eller narkotika. En akutt hypoksi protokollen er presentert her. Denne stimulering oppnås ved tilbaketrekking av O 2 i aCSF; denne tilnærmingen er ofte brukt for å vurdere toleranse og respons til hypoksiske fornærmelser. Protokollen induserer en rytme depresjon fra det første minutt inntil slutten av hypoksi eksponering (figur 1) 12. Dette depresjon reverseresunder post-hypoksisk utvinning 12. Når det gjelder eksperimentell design, er det viktig å legge merke til at pons, som ligger ved rostralt del av hjernestammen, har en hemmende virkning på rytme generator 8. Dermed preparater av komplett hjernestammen og rostralt ryggmarg vise en lavere rytme. Inkludering av pons i den isolerte utvalget for opptaket fastsettes i henhold til målet med eksperimentet 13; studiet av pontin innflytelse på forlengede marg nettverket vil kreve opptak med og uten pons å sammenligne resultatene 14. Videre er en av fordelene med denne teknikk er muligheten for å utvide den rostrale del av blandingen for å inkludere mesencefalisk og / eller diencephalic regioner 15,16, noe som gjør det mulig å vurdere effekten av disse regionene på ponto-medullær luftnett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne metoden kreves bruk av forsøksdyr, tillates av Laval-universitetet Animal etiske komité (protokoll # 2012-170).
1. Oppsett og klargjøring
- Løsninger
- Forbered aCSF lagerløsninger i henhold til følgende oppskrifter 7,17. Andre oppskrifter med konsentrasjonsvariasjoner er tilgjengelige i litteraturen. Oppbevares stamløsninger ved 4 ° C i opptil en måned.
- Salt løsning: legg 75,39 g NaCl (129 mM endelig); 2,5 g KCl (3,35 mM endelig); 0,81 g NaH2PO4 (0,58 mM endelig); 2,33 g av MgCl2 (1,15 mM endelig); 1,85 g av CaCl2 (1,26 mM). Løs opp i 800 ml destillert vann og fyll til en L med destillert vann.
- Bikarbonatoppløsning: legg 17,65 g NaHCO3 (21 mm final). Løs opp i 900 ml destillert vann og fyll opp til en L med destillert vann. Variasjoner av bikarbonatkonsentrasjonen vil resultere i pH-variasjoner.
- Glukoseoppløsning: legg 54.06g glukose (30 mM endelig). Løs opp i 400 ml destillert vann og deretter fylle til 500 ml med destillert vann.
- Forbered aCSF ved å fortynne 100 ml saltoppløsning, 100 ml bikarbonatoppløsning og 50 ml glukoseoppløsning i en liter destillert vann. Oppbevar ved 4 ° C inntil bruk.
- Forbered en glasselektrode ved oppvarming og stretching et glassrør før den bryter. Sand ned spissen før bruk. Elektroden kan gjenbrukes mange ganger så lenge som det holder seg ren.
- Forbered aCSF lagerløsninger i henhold til følgende oppskrifter 7,17. Andre oppskrifter med konsentrasjonsvariasjoner er tilgjengelige i litteraturen. Oppbevares stamløsninger ved 4 ° C i opptil en måned.
- Eksperimentell Setup
Merk: Oppsettet detaljer er vist i figur 2.- Slå på forsterkeren, flytting gjenomsnittet, datainnsamling system, temperaturregulator og pumpe. Kontroller signal forsterkning (gain = 10 000), filtrering (lav terskel, 10 Hz, høy terskel, 5 kHz), og samplingshastigheten for analog til digital omforming av den rå signal (2,5 kHz).
- Fyll en flaske med aCSF og boble det med carbogen (95% O 2 5% CO2). Indusere en bubbled- og varmet aCSF strømning i opptakskammeret (volum 5 ml) ved 4 ml / min. Hold temperaturen i opptakskammeret ved 26 (± 1) ° C. pH bør være 7,4 i disse standardbetingelser.
- Hold 50 ml RT og carbogen-boblet aCSF i en 50 ml sprøyte nær disseksjon kammeret.
- Slå på datamaskinen og start innspillingen programvare.
2. Dissection
- Vei og visuelt bestemme kjønn på dyret (hanner har en lengre ano-genital avstand, mens kvinner har en kort ano-genital avstand; hanner kjønnsorganene er ofte mørkt mens kvinnelige kjønnsorganer er rosa).
- Bedøve den nyfødte gnagere ved ett av følgende alternativer: cryoanesthesia (helt fordype dyret i isen i 4 - 5 min 18), injeksjon (equitensine på 4 ml / kg) 19 eller innånding av flyktige anestetika (isofluran 20 eller eter 21). Konfirm en tilstrekkelig plan av anestesi ved fravær av en potetilbaketrekning refleks.
- Plasser dyret på benken, ventral ansiktet ned. Seksjon den rostrale del av hodet coronally med en skalpell ved bregma nivå (synlig gjennom huden og skalle). Utføre dette trinnet umiddelbart etter at dyret er bedøvet.
- Seksjon kroppen coronally med en skalpell under de fremre medlemmer.
- Fjern hud, muskler, fettvev og viscus med kirurgiske og tynne saks og tang. Siden bein er myke i denne alderen, være forsiktige for å ikke skade nervesystemet. Utfør dette trinnet på benken.
- Plasser forberedelse i disseksjon kammeret. Bruk aCSF lagret i sprøyten oksygenering av preparatet. Fra dette punkt til slutten av opptaket, bruke et mikroskop.
- På den dorsale overflate av preparatet, kuttet skallen og vertebras fra rostral til caudal del langs aksen medium med kirurgiske og tynne sakser og tenger. Åpne cut skallenog vertebras for å avdekke nervevev. Bruk aCSF strored i sprøyten oksygenering av forberedelse.
- Med tang, fjerne araknoid membranen, et tynt vev som dekker overflaten av nervevev. Behold pia mater og blodkar mot nervevev. Bruk aCSF lagret i sprøyten oksygenering av preparatet.
- Plasser forberedelse med rygg med ansiktet ned, og nøye få ned hjernestammen og ryggmargen ved å kutte nerver og bindevev med saksen mens du holder forberedelse på plass. En dorsal tilnærming er også mulig. Hold røttene og nerver så lenge som mulig. Fjern bein å isolere hjernestammen og ryggmargen. Bruk aCSF lagret i sprøyten oksygenering av preparatet.
- Fjern lillehjernen og rester rostral strukturer ved seksjonering dem med skalpell. Bruk aCSF lagret i nålen oksygenering av preparatet.
- Eventuelt avhengig experimental design, fjerne pons med skalpell av en koronale delen anterior til dårligere lillehjernen arterie 22. Legg merke til at det å holde hele pons vil avta rytmen i rotter og fullt hemme den i mus. Preparater som inneholder bare den caudale delen av pons viser en luft-lignende aktivitet med en stabil frekvens på C4 roten.
3. Opptak
- Plasser forberedelse i innspillingen kammer, ventral ansiktet opp. Fest forberedelse med pinner i den nederste delen av ryggmargen og rostrokaudale meste av hjernestammen.
- Ved hjelp av en sprøyte koblet til elektroden ved sin nål, indusere en depresjon i elektroden (diameter glass tip: 150 - 225 um) ved å trekke i sprøytestempelet, for å delvis fylle elektroden med aCSF.
- Ved hjelp av en mikromanipulator, omhyggelig plassere elektroden i nærheten av en av den fjerde ventrale røttene. Andre ventrale røttene kunne også presentere en luftveislignende aktivitet (e.g., XII hjernenerve, C1 ventral root).
- Indusere en depresjon i elektroden tank via sprøyten ved å trekke ut stempelet for å forsiktig aspirer nerve rootlet. Deretter forsiktig bevege elektroden for å bruke det mot ryggmargen.
Merk: Ideelt størrelsen på rootlet overens med størrelsen av elektrodeåpningen og således skaper en tetning mellom de indre og ytre seksjoner av elektroden. Siden differensialforsterkere blir ofte brukt for slike opptak, noen åpning mellom innsiden av elektroden og opptakskammeret reduserer kvaliteten på signalet og gjør det vanskelig å eliminere bakgrunnsstøy. - Starte innspillingen.
- Ta opp den rytme som produseres av preparatet i henhold til normoksisk betingelser (dvs. boblet med karbogen aCSF: 95% O 2 og 5% CO2) i minst 20 minutter for å bestemme utgangsverdier i preparatet.
- Slå perfusjon fra carbogen-boblet aCSF tilstimulus aCSF (dvs. boblet med 95% N2 og 5% CO 2 for hypoksi stimulus) i 15 min. Endre eksponering varighet avhengig av den eksperimentelle protokollen. Spill eksponeringen varigheten på opptaket og dyr dataark. Bruk av rustfritt stål rør mellom aCSF flasken og kammeret når det er mulig å unngå gassdiffusjon til utsiden av røret.
- Slå perfusjon tilbake til standard carbogen-boblet aCSF i minst 15 min for en utvinning opptak. Markere dette på opptak og dyr dataark.
- Avslutte innspillingen.
4. Statistisk analyse
- Fra det integrerte signal, beregne den frekvens som antall støt per minutt (uttrykt i skurer / min), amplituden som forskjellen mellom grunnlinjen og toppen av skuren (uttrykt i mV), burst varighet som varigheten av begynnelsen til slutten av skuren (uttrykt i e), burst område som arealet under curve av sprekker på det integrerte signal (uttrykt i mV * s) (figur 3).
- Beregne frekvens, amplitude, brast varighet og brast området under normoksiske (baseline), hypoksisk (stimulus) og post-hypoksiske (post-stimulus) innvinningsbetingelser som gjennomsnittet av de siste 5 min av opptakene for hver tilstand. Ikke analysere den første del av hver betingelse, fordi det er en forsinkelse mellom svitsje perfusjon og aCSF homogenisering i opptakskammeret.
- Uttrykk så stimulus (dvs. hypoksi) og post-stimulus (dvs. etter hypoksisk) gjenvinning av verdier som en prosentandel av utgangsverdiene for tilsvarende opptaket. Uttrykke resultatene som betyr ± SD
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som nevnt i innledningen, er en av de viktigste fordelene med denne teknikken den direkte adgang til hjernestammen å anvende ulike stimuli. Som et eksempel, ble hypoksi anvendt her. Figur 1. AB viser en fullstendig protokoll opptak, med både normoksisk og hypoksiske betingelser. Figur 1.CE viser rytmen registreres i normoksisk forhold (dvs., gjennomboblet med 95% O2 og 5% aCSF CO 2 ved 26 ° C). Som tidligere vist i denne eksakte preparatet 11, er den frekvens på omtrent åtte skurer / min, og amplituden er omtrent 0,800 mV. Merk at amplituden er bare veiledende grunn av sine viktige inter-forberedelse variasjoner. Den øvre spor representerer integrerte signal mens den nedre spor representerer råsignal. Figur 1.DF viser rytmen registrert i hypoksiske forhold (ie., Boblet med 95% N 2 og 5% CO aCSF <sub> 2 ved 26 ° C). Som tidligere preget 23, frekvensen dramatisk redusert under hypoksi. Figur 1.GH viser en enkelt serie som viser typiske mønstre i normoksisk og hypoksiske forhold.
Figur 1. Eksempler på Recordings innhentet fra hjernestammen-ryggmarg preparater. Åndedretts utgang registrert fra C4 ventral roten av preparater fra P4 rottene under normoksiske, hypoksisk og post-hypoksiske innvinningsbetingelser ((A) integrert signal- og (B) råsignal) . For hver tilstand, forstørrede opptak ((C) integrert normoksiske signal, (D) integrert hypoksisk signal; (E) rå normoksiske signal, (F) rå hypoksisk signal) og én buffer ((G) normoksiske burstog (H) hypoksisk burst) vises. Som nevnt i teksten, vær oppmerksom på at amplitude må tolkes med forsiktighet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Recapitulative Schema av Setup. Det boblet aCSF blir varmet og sendt av en pumpe i innspillingen kammeret. aCSF overskudd i opptakskammeret suges av en pumpe og avhendes. Opptakskammeret er knyttet til bakken og temperaturregulatoren. Elektroden utgang er direkte videreformidlet til forsterkeren, og deretter til den bevegelige gjenomsnittet, og at datainnsamlingssystemet, og til slutt datamaskinen. Trykk her to se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Analysert Sprengings Parametere. Frekvensen blir beregnet som antall støt per minutt (uttrykt i skurer / min), amplituden som forskjellen mellom grunnlinjen og toppen av skuren (uttrykt i mV), skuren varighet som varigheten fra begynnelsen til slutten av burst (uttrykt i r), burst området som området under kurven av burst på integrert signal (uttrykt i mV · s). Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nøyaktig kvantifisering av respiratorisk aktivitet kan være utfordrende. Faktisk pust er en funksjon som kan være både automatisk og frivillig, og som moduleres i henhold til miljøet, kroppens behov, emosjonell tilstand og atferd. Fordelen med denne teknikken er isolering av nerveelementene som er ansvarlige for produksjonen av respiratoriske kommandoen. Dermed elektrofysiologiske opptak av hjernestammen-ryggmargs forberedelser og plethysmography er komplementære teknikker for å studere hele nevronale luftnett in vitro og in vivo, henholdsvis. Patch-klemme opptak i hjernestammen-ryggmargen forberedelse (f.eks., Nærmer fra baksiden) er også tenkelig og la studiet av en bestemt nevron i et fredet luftnett 24.
Denne protokollen innbefatter noen kritiske trinn, hovedsakelig i disseksjon. For å unngå skade på nervevev,alle disseksjon trinnene bør utføres raskt og presist. Den nervevev skal ikke være skadet, og være nøye bevart ved konstant neddykking i aCSF. Som nevnt tidligere, er kvaliteten av forbindelsen mellom nerven rootlet og elektroden et andre kritisk trinn. Aspirasjon av rootlet kan bringe elektroden nærmere forberedelse. Mens kontakten mellom elektroden og hjernestammen kan forbedre kvaliteten av tetningen, må man unngå å lage en depresjon eller fysisk skade på preparatet.
Det integrerte signal bør alltid benyttes for analyse, men rå signaler kan være nyttig for å skille mellom riktig skurer fra bakgrunnsstøy. Videre kan en høyttaler legges til oppsett for å lytte til rytmen og bestemme signalkvalitet og bakgrunnsstøy til stede ved audition. Faktisk kan noen variasjoner i bakgrunnen baseline være til stede på grunn av elektrisk interferens og føre til en ustabil baseline. Slike interfranser bør forebygges ved å sjekke kabeltilkoblinger og rot utsuging av elektroden. Dessuten, fordi spreng amplitude er avhengig av både bakgrunnsstøy, og forbindelsen mellom roten og elektroden, er frekvensen av en mye en pålitelig parameter. Derfor bør burst amplitude alltid uttrykkes som prosentandeler av baseline-verdier for å unngå inter-individuelle variasjoner på grunn av oppsettet.
Begrensninger av teknikken bestemmes av alder på dyret som preparatet kan realiseres. Dette gir en nøyaktig studie av opprettelsen av det sentrale respirasjonen ved fødselen, noe som er veldig interessant og klinisk relevant, men det fokuserer på disse tidlige aldre og kan ikke utvides til senere tider. Eldre tider kan anvendes i arterielt perfuserte arbeids hjerte-hjernepreparater 25, men med betydelige protokoll modifikasjoner (se nedenfor). En isolert hjernestammen-ryggmarg forberedelse fra voksne marsvin har vært å utvikleed med 26 Morin-Surun et al., der hjernestammen er perfusert via basilaris arterie og rytmen er registrert i XII hjernenerve. En annen begrensning er varigheten av forsøket. Preparatet kan ikke oppbevares i mer enn 7 timer i de tidligere omtalte forholdene 6. Derfor er denne metode ikke er egnet for langvarige forsøk, selv om preparater fra rumpetroll (se nedenfor) har blitt holdt 24 timer i laboratoriet.
Forskjellige modifikasjoner kan brukes på denne teknikken. Her har hypoksisk utfordring blitt utført, men andre gass variasjoner er også tenkelig (f.eks., Hyperkapni 27 så vel som pH-variasjoner 28). På samme måte kan preparatet bli perfusert med aCSF i hvilket stoffer er oppløst og påført på hjernestammen som en forbehandling 29 eller i løpet av 30 opptaket. I dette tilfellet kan den rytme påskyndes 29 eller bremset down 30 i henhold til den eksperimentelle stoffet. Dessuten, med en compartmented opptakskammeret, forskjellig aCSF kan påføres på utvalgte deler av fremstillings 6 og temperaturvariasjoner 9 kan anvendes. Dette compartmentalization gjør studiet av implikasjonen av utvalgte hjernestammen deler i stimulans-induserte effekter. Selv om den teknikk som presenteres bruker nyfødte rotter, er den også anvendelig på andre dyremodeller. Ved hjelp av en protokoll som ligner den som er anvendt for rotter, mus kan brukes fra svangerskaps dag 16 (E16) inntil 12 P4. Den største forskjellen er behovet for å varme og carbogen-boble den aCSF under disseksjon. Skilpadder kan rumpetroll og voksne frosker også brukes; Men disse artene krever forskjellige disseksjon teknikker, så vel som justering av sammensetningen av aCSF.
Denne teknikken kan også bli kombinert med patch-clamp-opptakene på den rostrale forsiden av preparatet 31, slik atsamtidig visualisering av nettverket utgangssignal, og aktiviteten av en bestemt celle i dette nettverket. Spenningsfølsom fargestoff avbildning kan også anvendes i nyfødt rotte hjernestammen-ryggmarg preparater for å lokalisere de aktiverte områdene på den ventrale overflate av hjernestammen 32. c-fos-analyse i preparatene kan også realiseres for å identifisere de som er involvert i nervepopulasjoner bestemte luftveisresponser. Til slutt kan preparatet bli modifisert til å holde andre organer, slik som hjertet 25, ribber 6, eller fysiologisk arterie perfusjon med andre fysiologiske 33 rytmer. Imidlertid vil disse svært viktige modifikasjoner kreve andre disseksjon protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Sigma Aldrich | 761036-5EA | Use under hood |
| NaCl | Bioshop | SOD002 | |
| KCl | Bioshop | POC888 | |
| CaCl2 | Bioshop | CCL444 | |
| MgCl2 | Bioshop | MAG510 | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| NaH2PO4 | Bioshop | SPM306 | |
| D-glucose | Bioshop | GLU501 | |
| Carbogen | Linde | 343-02-0006 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Suction electrode | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 573000 | |
| Differential AC amplifier | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 1700 | |
| Moving averager | CWE, Ardmore, PA, USA | model MA-821 | |
| Data acquisition system | Dataq Instruments, Akron, OH, USA | model DI-720 | |
| LabChart software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | ||
| Prism sofware | Graphpad, La Jolla, CA, USA | ||
| Dissection chamber | Plastic box (e.g. petri box) will do | ||
| Recording chamber | Home made | ||
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA | KITE-R | |
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | MINIPULS 3 | |
| Faraday Cage | Home made | ||
| Computer |
References
- Feldman, J. L., Del Negro,, A, C., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).
- Taylor, A. C., Kollros, J. J. Stages in the normal development of Rana pipiens larvae. Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).
- Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle. Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).
- Bouverot, P. Control of breathing in birds compared with mammals. Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).
- Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish. J Physiol. 71, 121-135 (1931).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Fournier, S., et al. Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat. J Neurosci. 33, 563-573 (2013).
- Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain. Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).
- Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation. Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).
- Onimaru, H. Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations. Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).
- Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats. Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).
- Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies. Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).
- Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation. Prog Brain Res. , 165-201 (2007).
- Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents. Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).
- Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat. Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
- Danneman, P. J., Mandrell, T. D. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. J App Physiol. 116, 47-53 (2014).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).
- Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem. J Physiol. 584, 489-508 (2007).
- Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. 5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).
- Onimaru, H., Homma, I. Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).
- Paton, J. F. Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice. J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).
- Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation. J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).
- Otsuka, H. Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat. Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).
- Gestreau, C., et al. Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity. PNAS. 107, 2325-2330 (2010).
- Caravagna, C., Soliz, J. PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command. Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).
- Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice. Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).
- Arata, A. Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro. Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).
- Onimaru, H., Homma, I. A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla. J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).
- St-John, W. M., Paton, J. F. Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation. Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).
