Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

طرق لمنع البكتيرية Pyomelanin الإنتاج وتحديد الزيادة المقابلة في الحساسية للإجهاد التأكسدي

Published: August 31, 2015 doi: 10.3791/53105
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Wisconsin Milwaukee

Protocol

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام، والمضادات الحيوية، و2- [2-نيترو-4- (ترايفلوروميثيل) بيروكسايد] -1،3-cyclohexanedione (NTBC)

  1. جعل LB مرق (1٪ تريبتون، و 0.5٪ مستخلص الخميرة، 0.25٪ كلوريد الصوديوم في H 2 O) وقسامة في أحجام مناسبة. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
  2. جعل 100 مل LB أجار (1٪ تريبتون، و 0.5٪ مستخلص الخميرة، 0.25٪ كلوريد الصوديوم، 1.5٪ أجار في H 2 O) في 250 مل القوارير. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. ضمان آغار ذاب قبل صب في لوحات.
    ملاحظة: قوارير تحتوي على 100 مل من LB أجار سوف تسفر عن 4 لوحات. كمية LB أجار يمكن تغييرها لتتوافق مع عدد من لوحات اللازمة للفحص.
  3. جعل PBS (137 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 2 مم KH 2 PO 4) 16. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف أو الترشيح وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  4. إعداد الحلول الأسهم المضادات الحيوية للجنتاميسين، الكاناميسين، وهود التوبراميسين.
    1. إعداد تركيزات الأسهم المضادات الحيوية المناسبة لP. سلالات الزنجارية تحتوي على 100 ​​ملغ / مل جنتاميسين، 30 ملغ / مل الكانامايسين، و 10 ملغ / مل التوبراميسين. حل المضادات الحيوية في المياه، تعقيم فلتر (0.2 ميكرون)، وتخزينها في 4 درجات مئوية. تغيير المضادات الحيوية وتركيزات اعتمادا على البكتيريا التي شملتها الدراسة.
  5. إعداد الحلول الأسهم NTBC. حل 10 ملغ من NTBC في 400 ميكرولتر من DMSO. هذه تعطي تركيز 75.9 ملي NTBC. مخزن الحلول الأسهم NTBC في -20 ° C. حلول ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة حسب الحاجة.
    ملاحظة: مصادر مختلفة NTBC خلافات في الذوبان. تحديد الوسيلة المناسبة التي بحل NTBC بناء على توصيات الشركة الصانعة وضبط الخطوة 1.5 وفقا لذلك.

2. NTBC المعايرة من السلالات البكتيرية

  1. إعداد الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات لفحصها. إضافة 2 مل مرق LB إلى 16 × 150 مم أنبوب اختبارالصورة (واحد لكل سلالة) وتطعيم مع 1 مستعمرة معزولة من كل سلالة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية مع تهوية على محور دوار زراعة الأنسجة في حاضنة الهواء.
  2. في اليوم التالي، وإعداد المعايرة من NTBC في LB مرق. استخدام مجموعة الأولي 0-900 ميكرون NTBC منذ السلالات المختلفة لديها اختلافات في الحساسية للNTBC.
    1. إضافة 1 مل مرق LB إلى 4-5 أنابيب الاختبار (16 × 150 ملم) في سلالة.
    2. إضافة محلول المخزون NTBC (75.9 ملم) للأنابيب الاختبار (16 × 150 ملم) في مجموعة من تركيزات. انظر الجدول رقم 1 لتركيزات NTBC وكميات الأسهم المقابلة لإضافة إلى 1 مل من مرق LB.
  3. قياس OD 600 من الثقافات بين عشية وضحاها. غسل الثقافات قبل اتخاذ OD 600 قراءات للقضاء على pyomelanin الحاضر في وسائل الإعلام.
    1. غسل الثقافات بواسطة الطرد المركزي 1 مل من الثقافة في microcentrifuge في 16000 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف وأي خلايا مكعبات فضفاضة معوmicropipettor و resuspend بيليه خلية الصلبة في 1 مل LB.
  4. تطعيم أنابيب المعايرة في OD 600 0.05. حساب كمية ثقافة غسلها اللازمة لتطعيم الأنابيب.
    ملاحظة: استخدم الثقافات غسلها عن التطعيمات منذ pyomelanin يجب أن لا تكون موجودة.
  5. احتضان أنابيب المعايرة لنحو 24 ساعة على 37 درجة مئوية مع تهوية باستخدام ثقافة المدورة الأنسجة في حاضنة الهواء.
  6. تصوير أنابيب المعايرة ومقارنة إنتاج الصباغ داخل وبين سلالات لتحديد مقدار NTBC لاستخدامها في هيئة التصنيع العسكري والاكسدة المقايسات. استخدام OD 600 قراءات لتحديد مقدار pyomelanin في خلية ثقافة خالية طاف وتحديد كثافة الخلية.
    ملاحظة: نسبة OD 600 من pyomelanin في ثقافة طاف للخلايا يمكن أن تحسب لتحديد الاختلافات في إنتاج pyomelanin بعد العلاج مع NTBC.

3. المضادات الحيوية الدنيا Inhibiحزب المحافظين تركيز (MIC) الفحص في لوحات 96-جيدا

  1. إعداد الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات التي سيتم اختبارها في LB مع وبدون NTBC.
    ملاحظة: يتم وصف هذا البروتوكول باستخدام مستوى تمثيلي من 300 ميكرومتر NTBC. يتم تحديد المستوى المناسب من NTBC لاستخدامها في الخطوة 2.6.
    1. إضافة 300 ميكرومتر NTBC إلى 2 مل LB. إضافة ما يعادل حجم سيارة (DMSO) إلى 2 مل LB للشرط لا NTBC.
    2. استخدام المسواك العقيمة، تلقيح الأنابيب مع واحد مستعمرة معزولة من البكتيريا. سوف تكون هناك ثقافة واحدة مع NTBC وثقافة واحدة دون NTBC لكل سلالة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية مع تهوية باستخدام ثقافة المدورة الأنسجة في حاضنة الهواء.
  2. في اليوم التالي، وجعل LB + NTBC والحلول سيد LB + DMSO لإعداد مقايسة هيئة التصنيع العسكري. إضافة NTBC بتركيز 600 ميكرومتر لأن هذا سوف تضعف اثنين أضعاف عند إضافة اللقاح، مما أسفر عن تركيز النهائي من 300 ميكرومتر.
    1. لاختبار عنتيبي واحدأمام الأذن لسلالة واحدة، إضافة 600 ميكرومتر NTBC إلى 2 مل LB وتخلط لجعل الحل الرئيسي NTBC. إضافة ما يعادل حجم سيارة (DMSO) إلى 2 مل LB وتخلط لجعل أي حل سيد NTBC. استخدام هذه الحلول لإيجاد حلول الأسهم المضادات الحيوية فضلا عن إعداد سلسلة التخفيف في لوحات 96-جيدا.
      ملاحظة: إن الصياغات حل سيد تسفر عن حل إضافي لحساب الأخطاء pipetting ل. يمكن زيادتها الحلول سيد أعلى أو لأسفل كما هو مطلوب اعتمادا على عدد من المضادات الحيوية والسلالات التي تم اختبارها.
  3. إعداد الحلول للمضادات الحيوية في LB + NTBC أو LB + DMSO حلول الرئيسي.
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز المضادات الحيوية في هذه الحلول ضعف التركيز النهائي المطلوب. ينبغي حل ما يكفي لنقل 100 ميكرولتر إلى أربع آبار في لوحة 96-جيدا.
    1. إعداد جنتاميسين +/- NTBC حل السهم عند 64 ميكروغرام / مل. لجعل هذا الحل، إضافة 0.288 ميكرولتر من الأسهم الجنتاميسين (100 ملغ / مل) إلى 450ميكرولتر LB + NTBC أو حل سيد LB + DMSO.
      ملاحظة: الحد الأقصى لتركيز الجنتاميسين لP. الزنجارية PAO1 هو 32 ميكروغرام / مل.
    2. جعل كانامايسين +/- NTBC حل السهم عند 256 ميكروغرام / مل. لجعل هذا الحل، إضافة 3.84 ميكرولتر من الأسهم كانامايسين (30 ملغ / مل) إلى 450 ميكرولتر LB + NTBC أو LB + DMSO حلول الرئيسي.
      ملاحظة: الحد الأقصى لتركيز كانامايسين لP. الزنجارية PAO1 هو 128 ميكروغرام / مل.
    3. إعداد التوبراميسين +/- NTBC حل الأوراق المالية في 8 ميكروغرام / مل. لجعل هذا الحل، إضافة 0.36 ميكرولتر من الأسهم التوبراميسين (10 ملغ / مل) إلى 450 ميكرولتر LB + NTBC أو LB + DMSO حلول الرئيسي.
      ملاحظة: للحصول على P. الزنجارية PAO1، وأقصى تركيز التوبراميسين هو 4 ميكروغرام / مل.
      ملاحظة: المضادات الحيوية وتركيزات يمكن تعديلها للبكتيريا لفحصها.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من كل حل مضاد حيوي 2X إلى أربع آبار في لوحة 96-جيدا. وضع هذه الحلول في الصف A. لالامثلهه، ينبغي أن توضع الجنتاميسين في A1 من خلال A4، ينبغي أن توضع كانامايسين في A5 من خلال A8، وينبغي أن توضع التوبراميسين في A9 من خلال A12. انظر الشكل 1A لرسم تخطيطي لوحة 96-جيدا اقامة.
    ملاحظة: يمكن اختبار مضادات حيوية متعددة في لوحة واحدة، ولكن يجب اختبار سلالة واحدة فقط لكل لوحة للقضاء على احتمال انتقال التلوث من سلالات أخرى.
  5. إضافة 50 ميكرولتر من الحل الرئيسي LB + NTBC أو LB + DMSO إلى صفوف B خلال H من لوحة 96-جيدا. تأكد من أن لوحة واحد هو LB + NTBC ولوح واحد هو LB + DMSO. انظر الشكل 1A.
    1. استخدام LB + NTBC للمضادات الحيوية في LB + NTBC. استخدام LB + DMSO للمضادات الحيوية في LB + DMSO.
  6. باستخدام micropipettor إجراء عمليتين التخفيفات المسلسل أضعاف من المضادات الحيوية عن طريق نقل 50 ميكرولتر من الحل من صف إلى صف A B. مزيج الحل، تغيير نصائح الماصة، ونقل 50 ميكرولتر من الحل من صف إلى صف B C. كرر ل وremainiالصفوف نانوغرام. بعد إضعاف الصف G، وإزالة 50 ميكرولتر من الحل من هذا الصف ونبذ. استخدام الصف H باعتباره لا سيطرة للمضادات الحيوية لنمو البكتيريا. انظر الشكل 1B.
    ملاحظة: كل بئر في الصفوف من A إلى G يحتوي الآن على 50 ميكرولتر من المضادات الحيوية في LB + NTBC أو LB + DMSO في 2X تركيز النهائي المطلوب. الصف H يحتوي LB + NTBC أو LB + DMSO مع عدم وجود المضادات الحيوية.
  7. قياس OD 600 من الثقافات بين عشية وضحاها. غسل جميع الثقافات قبل اتخاذ OD 600 قراءات للقضاء على pyomelanin الحاضر في وسائل الإعلام.
    1. غسل الثقافات بواسطة الطرد المركزي 1 مل من الثقافة في microcentrifuge في 16000 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف مع micropipettor و resuspend بيليه خلية في 1 مل LB.
  8. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها إلى 2.75x10 5 كفو / مل في LB.
    ملاحظة: افترض أن OD 600 وحدة واحدة هي ما يعادل 1X10 9 كفو / مل لP. الزنجارية. OD إلى كفو / مل التحويلات يمكن دifferent في البكتيريا الأخرى.
  9. إضافة 50 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية المخفف إلى البئر المناسب.
    ملاحظة: الثقافات التي تزرع في NTBC ينبغي أن يضاف إلى الآبار التي تحتوي ينبغي أن يضاف NTBC والثقافات التي تزرع في DMSO إلى الآبار التي تحتوي على DMSO. انظر الشكل 1B.
    1. إضافة البكتيريا إلى ثلاثة آبار لكل سلالة وتركيز المضادات الحيوية. إضافة 50 ميكرولتر من LB إلى البئر الرابع ليكون بمثابة الرقابة على التلوث الجرثومي. انظر الشكل 1B.
    2. استخدام micropipettor متعدد القنوات لتطعيم الآبار. ضمان الماصة النصائح بالقرب من قاع الآبار عند إضافة اللقاح لمنع تلوث الآبار المجاورة.
      ملاحظة: سيتم إضافة ثقافة البكتيرية إلى الآبار تمييع تركيزات المضادات الحيوية وNTBC اثنين أضعاف.
  10. تغطية لوحات 96-جيدا مع parafilm واحتضان ما يقرب من 24 ساعة على 37 درجة مئوية. احتضان لوحات 96-جيدا بشكل ثابت، في حاضنة الهواء.
  11. بحثلوحات لنمو البكتيريا في الآبار. هيئة التصنيع العسكري هو أدنى تركيز المضادات الحيوية التي لا ترى نمو البكتيريا لجميع مكررات ثلاثة من كل سلالة.
    1. بصريا فحص لوحة للنمو أو قراءة باستخدام قارئ مجموعة لوحة لOD ​​600.

4. بقعة لوحة الفحص لمؤكسد الاستجابة للضغط النفسي

  1. إعداد الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات التي سيتم اختبارها في LB مع وبدون NTBC كما هو موضح في الخطوة 3.1.
  2. في اليوم التالي، وإعداد لوحات أجار LB التي تحتوي على H 2 O 2 هو من الضغوطات الأكسدة. وهناك مجموعة من H 2 O 2 تركيزات 0-1 مم هي نقطة انطلاق جيدة.
    1. إذابة قوارير أجار LB. وسائل الإعلام باردة إلى حوالي 50 درجة مئوية في درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة H 2 O 2 مباشرة إلى وسائل الإعلام تبريد في تركيزات المطلوب. قوارير دوامة لخلط. انظر الجدول رقم 2 لتركيزات H 2 O 2ومجلدات من H 2 O 2 المركزة لإضافة. وتستند هذه القيم على 100 مل من LB أجار.
    3. صب لوحات على الفور بعد إضافة H 2 O 2 واللهب السطح لإزالة الفقاعات. العائد هو 4 لوحات لكل 100 مل من LB أجار. احتفال لوحات مع تركيز H 2 O 2.
    4. وضع لوحات في كشف غطاء تدفق البيولوجي مع مروحة تعمل لمدة 30 دقيقة لإزالة الرطوبة الزائدة من لوحات.
      ملاحظة: استخدام لوحات في اليوم نفسه انهم مستعدون. قد يؤدي عدم القيام بذلك سيؤدي في البيانات غير متناسقة.
      ملاحظة: الضغوطات الأكسدة مثل الباراكوات يمكن أن تكون بديلا عن H 2 O 2 في هذا الاختبار. التركيزات المستخدمة لالضغوطات المؤكسدة أخرى قد تختلف عن تلك المستخدمة لH 2 O 2.
  3. غسل وقياس OD 600 من الثقافات بين عشية وضحاها كما هو موضح في الخطوة 3.7.
  4. تطبيع OD 600 من كل متر مكعب بين عشية وضحاهاltures إلى أدنى قيمة لمجموعة من السلالات التي يجري اختبارها. P. الزنجارية ديه عموما OD 600 من حوالي 2.5 عندما نمت بين عشية وضحاها في LB + NTBC أو LB + DMSO.
    1. تحديد حجم الثقافة اللازمة لتمييع الثقافة إلى أدنى OD 600 في إجمالي حجم 1 مل. على سبيل المثال، إذا كان لديه ثقافة OD 600 من 3 وأدنى OD 600 لمجموعة من سلالات 2.5، إجراء العملية الحسابية التالية: (2.5) (1 مل) = (3) (خ). س = 0.833 مل. سيتم وضعها 0.833 مل من ثقافة في أنبوب microfuge.
    2. حساب كمية LB + NTBC (300 ميكرومتر) أو LB + DMSO اللازمة لتبرزي حجم الثقافة إلى 1 مل. على سبيل المثال في خطوة 4.4.1، ومقدار LB + NTBC أو LB + DMSO تضاف إلى ثقافة سيكون 0.167 مل (1 مل السعة الإجمالية - 0.833 مل الثقافة). جعل الحلول الأسهم من LB + NTBC وLB + DMSO لاستخدام هذه التخفيفات على أساس حجم اللازمة لتمييع كل السلالات.
    3. مزيج من الثقافة وLB + Nالدرن أو LB + DMSO قبل vortexing.
  5. للحفاظ على الثقافات في تركيز ثابت من NTBC أو DMSO، نفذ عشرة أضعاف التخفيفات المسلسل من الثقافات بين عشية وضحاها تطبيع في برنامج تلفزيوني + NTBC أو برنامج تلفزيوني + DMSO.
    1. جعل الحلول الأسهم من برنامج تلفزيوني + NTBC وPBS + DMSO. لمجموعة واحدة من التخفيفات لسلالة واحدة، ومزيج 300 NTBC ميكرومتر أو ما يعادل حجم DMSO مع برنامج تلفزيوني أن تسفر عن إجمالي حجم 720 ميكرولتر. توسيع نطاق هذه الأسهم صعودا أو هبوطا حسب عدد سلالات يتم اختبارها.
    2. أنابيب التسمية microfuge لمدة 10 -1 من خلال التخفيفات 10 -7 التسلسلية. إضافة 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + NTBC أو برنامج تلفزيوني + DMSO للأنابيب المناسبة. استخدام PBS + NTBC للسلالات التي تزرع في LB + NTBC واستخدام PBS + DMSO للسلالات التي تزرع في LB + DMSO.
    3. إضافة 10 ميكرولتر من ثقافة إلى مناسبة 10 -1 أنبوب التخفيف. مزيج من قبل vortexing ونقل 10 ميكرولتر من التخفيف 10 -1 إلى أنبوب التخفيف 10 -2. كرر حتى يكون كل التخفيفات PERFOrmed. تغيير نصائح الماصة بين التخفيفات.
  6. بقعة 5 ميكرولتر من 10 -3 خلال 10 -7 التخفيفات على LB + H 2 O 2 لوحات من نسختين لكل سلالة. استخدم إحدى طرف الماصة إذا مطلي البقع من معظم تمييع لأقل مخفف (10 -7 إلى 10 -3). لا تلميح أو إمالة لوحة حتى يجف السائل في لوحة.
  7. احتضان لوحات لمدة 24-48 ساعة عند 37 ° C (حاضنة الهواء)، اعتمادا على سلالة.
    ملاحظة: P. سوف الزنجارية PAO1 ديك المستعمرات جيدة الحجم على LB بعد 24 ساعة من الحضانة. احتضان سلالات حتى لديهم مستعمرات تقريبا نفس حجم PAO1.
  8. تصوير لوحات باستخدام كاميرا CCD فوق transluminator. اختياريا، تحرير الصور لوعلى النقيض من المحاصيل لنفس الحجم. حساب عدد المستعمرات في كل بقعة لتحديد التغيرات في حساسية لالاكسدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

معايرات NTBC

استخدمت المعايرة NTBC لتحديد ما إذا كان NTBC قادرة على خفض الانتاج pyomelanin في P. الزنجارية، وأيضا تحديد تركيز NTBC أن يلغي أو يقلل pyomelanin إنتاج للاستخدام في فحوصات إضافية. قد تكون هناك اختلافات في مستويات pyomelanin المنتجة في مكررات مختلفة، ولكن تبقى الاتجاهات العامة المستمر. ويمكن أيضا أن يتم تعديل المعايرة فحص NTBC لاختبار المركبات الأخرى التي قد تؤثر على إنتاج الصباغ في البكتيريا الأخرى. وهذا العمل فقط، ومع ذلك، إذا كان هناك تغيير المظهري التي يمكن تحديدها بالعين المجردة أو كميا.

علاج pyomelanin إنتاج سلالات P. أدى الزنجارية مع NTBC في انخفاض الجرعة التي تعتمد في إنتاج الصباغ (12). ويبين الشكل 2 أن سلالات مختلفة من P. الزنجارية هناك خلافات في الحساسية للNTBC، كما يتبين من مستويات بيوإنتاج الميلانين. كان مطلوبا تركيزات أعلى من NTBC للحد من pyomelanin الإنتاج في عزل PA1111 السريرية 17 (تم الحصول عليها من درعا فرانك) بالمقارنة مع سلالة المختبر hmgA :: TN 18 (جامعة واشنطن PAO1 ينقول مكتبة متحولة). السلالات التي لا تنتج pyomelanin [PAO1 (تم الحصول عليها من كاري هاروود) والمديرية :: TN 18 (جامعة واشنطن PAO1 ينقول مكتبة متحولة)] لم تظهر أي تغيير في تصبغ مع العلاج NTBC. قررنا استخدام 300 ميكرومتر NTBC لفحوصات لدينا لpyomelanin الإنتاج وانخفاض كبير في hmgA سلالة المختبر :: TN استخدام هذا التركيز (قارن 300 ميكرومتر إلى 0 ميكرومتر NTBC). تم تخزين جميع السلالات المستخدمة في هذه الدراسة في -80 ° C في 15٪ الجلسرين.

البلدان المتوسطة الدخل المضادات الحيوية

يمكن اختبارها البلدان المتوسطة الدخل المضادات الحيوية باستخدام عدة أساليب مختلفة. إن أسلوب وحة microtiter الموصوفة هنا تسمح باستخدامص لاختبار مجموعة من تركيزات المضادات الحيوية واستخدام الحد الأدنى من الموارد. يتم نسخ النتائج بسهولة ويمكن تعديل فحص للسماح للاختلافات في الحساسية للمضادات الحيوية للكائن الحي لفحصها. ويمكن اعتبار بعض الاختلاف بين تجارب مستقلة، ولكن الاتجاهات متسقة إلى حد ما. يجب أن مكررات التقنية يحمل نفس MIC.

ويبين الجدول 3 نتائج مختلفة P. سلالات الزنجارية تعامل مع وبدون NTBC ومختلف المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد. تم اختبار ثلاث مستعمرات مستقلة في ثلاث نسخ وفقا للطريقة وصفها. سجلت البلدان المتوسطة الدخل كما تحتوي على نسبة أقل من المضادات الحيوية التي تحول دون نمو البكتيريا في جميع مكررات الفنية الثلاث. كان العلاج NTBC أي تأثير على البلدان المتوسطة الدخل أمينوغليكوزيد للسلالات التي تم اختبارها.

الاكسدة لوحة بقعة فحص

مقايسة لوحة بقعة للإجهاد التأكسدي الاختبار يعطي reproduciblالنتائج البريد باستخدام مستويات أدنى من H 2 O 2 من تلك التي تستخدم في فحوصات أخرى. لوحة من دون H 2 O 2 هي لوحة التحكم لتحديد دقة من سلسلة تخفيف لكل سلالة، وكذلك تحديد حجم مستعمرة وعدد من المستعمرات في كل بقعة من دون تعريض الخلايا لالأكسدة الإجهاد. في سلسلة التخفيف المناسبة، يجب أن يكون بقعة النهائية عدد قليل جدا من المستعمرات، في حين أن المركز الأول سيكون لها عدد لا يحصى من المستعمرات على H 2 O 2 وسائل إعلام حرة. يجب أن يكون هناك اختلاف عشرة أضعاف في عدد من المستعمرات في كل بقعة ضمن سلسلة التخفيف. لجميع سلالات اختبارها، ينبغي أن ينظر إلى أعداد مماثلة من المستعمرات في نفس التخفيف على H 2 O 2 لوحة التحكم الحرة.

كما سلالات مختلفة من البكتيريا قد يكون حساسيات مختلفة لالاكسدة، مجموعة من H ينبغي اختبار 2 O 2 تركيزات. زيادة تركيزات H 2 O 2 O 2 الاكسدة التي يسببها. ويمكن مقارنة خصائص نمو السلالات البكتيرية المختلفة لتحديد حساسية لالاكسدة في إطار معين H 2 O 2 التركيز. يمكن تعديل مقايسة لتحديد الآثار المترتبة على مركب معين أو كاشف، مثل NTBC، على سلالة بكتيرية واحدة عندما تتعرض البكتيريا لالاكسدة. ويمكن أيضا أن تحسب المستعمرات لتحديد الحد في المئة في مستعمرة بكتيرية وحدة بين ظروف تجريبية مختلفة القدرات.

ويبين الشكل 3 مقايسة لوحة بقعة من pyomelanin وغير pyomelanin المنتجة للسلالات P. الزنجارية تعامل مع وبدون NTBC وتتعرض لH 2 O 2 الاكسدة التي يسببها. هناك اح واضحيتم التعامل مع الامتحانات التنافسية الوطنية في حساسية لالاكسدة عندما pyomelanin البكتيريا المنتجة مع NTBC، وأيضا بين البكتيريا التي لا تنتج pyomelanin مقارنة مع تلك التي لا تنتج الصباغ. السلالات التي لم تسفر عن pyomelanin، إما طبيعيا أو بسبب العلاج NTBC، كانت أكثر حساسية لالاكسدة من السلالات التي تنتج pyomelanin.

الشكل 1
الشكل 1: رسم تخطيطي للمضادات الحيوية MIC فحص لوحة 96-جيدا اقامة (A) 100 ميكرولتر من المضادات الحيوية 2X بأعلى تركيز انطلاق هم في الصف A. الصفوف تمتلئ B خلال H مع 50 ميكرولتر من أي LB + NTBC أو LB + DMSO دون المضادات الحيوية. يتم تنفيذ (B) اثنين من التخفيفات المسلسل أضعاف في صفوف A إلى G، مما أدى في 50 ميكرولتر من المضادات الحيوية مخففة في كل بئر في 2X تركيز النهائي المطلوب. الصف H هو السيطرة بشكل جيد لبنمو acterial دون المضادات الحيوية. يضاف 50 ميكرولتر من LB أو اللقاح إلى الآبار المناسبة مما خفف من المضادات الحيوية اثنين أضعاف إلى التركيز النهائي. يقدم LB كجهاز تحكم عن التلوث البكتيري في المضادات الحيوية. جم، جنتاميسين؛ كم، كانامايسين. طوب، التوبراميسين.

الرقم 2
الشكل 2: معايرات NTBC من المنتجين pyomelanin وغير المنتجين من P. انخفاض الزنجارية. NTBC pyomelanin الإنتاج بطريقة تعتمد على الجرعة في المختبر والمنتجين pyomelanin السريرية، ولكن لم يكن لها تأثير على إنتاج الصباغ في السلالات التي لا تنتج pyomelanin. تعديل من إشارة 12.

الشكل (3)
الرقم 3: بقعة لوحة فحص للاستجابة الاكسدة كانت السلالات البكتيرية المخففة.د لنفس OD 600، المسلسل المخفف 10 أضعاف، ورصدت على لوحات LB التي تحتوي على تركيزات مختلفة من H 2 O 2. أظهرت 0 مم H 2 O 2 النتائج وحة أن جميع سلالات كانت مخففة بشكل صحيح، كما يتبين من عدد مماثل من المستعمرات في كل من البقع لنفس التخفيف عن سلالات مختلفة. ارتفعت لوحات تحتوي على H 2 O 2 أن السلالات كانت أكثر حساسية لالاكسدة مثل تركيز H 2 O 2. ويدل على ذلك التهم مستعمرة انخفضت في المناطق بالمقارنة مع أي H 2 O 2 حالة، فضلا عن تخفيض في حجم مستعمرة. تعديل من إشارة 12.

تركيز النهائي من NTBC (ميكرومتر) حجم NTBC (75.9 ملم) لإضافة (ميكرولتر)
0 0
50 </ td> 0،659
100 1،318
200 2.64
300 3.95
600 7.91
900 11.86

الجدول 1: التركيزات NTBC لإقامة المعايرة في LB. يعطي هذا الجدول تركيزات مختلفة NTBC ومبلغ مماثل من الأسهم NTBC إضافة إلى 1 مل LB.

تركيز النهائي من H 2 O 2 (ملم) مبلغ 9.79 MH 2 O 2 (30٪ بالوزن) لإضافة (ميكرولتر)
0 0
0.2 2.04
0.4 4.09
0.6 6.13
0.8 8.17
1 10.21

. يعطي هذا الجدول تركيزات H 2 O 2 إضافة إلى LB أجار لالاكسدة لوحة بقعة فحص مختلف H 2 O 2 تركيزات والمبلغ المقابل من المركز H 2 O 2 الأسهم إضافة إلى 100 ​​مل LB أجار: الجدول 2.

L65 "> PA1111 + NTBC
PAO1 - NTBC PAO1 + NTBC hmgA :: TN - NTBC hmgA :: TN + NTBC المديرية :: TN - NTBC المديرية :: TN + NTBC PA1111 - NTBC
جنتاميسين 1 0.5 2 2 1 1 0.5 0.5
كانامايسين 16 8 32 32 32 32 16 16
التوبراميسين 0.5 0.5 0.5 0.5 0.25 0.25 0.5 0.5

الجدول 3: نتائج MIC المضادات الحيوية تم اختبار ثلاث مستعمرات مستقلة في ثلاث نسخ لكل سترا.في. المطبوعة إعادة بإذن من المرجع 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) Sigma-Aldrich SML0269-50mg Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2 Sigma-Aldrich 216763-100ML 30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin Gold Bio G-400-100 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG Soluble in H2O.  Filter sterilize.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092 (2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

Tags

علم المناعة، العدد 102، الأحياء الدقيقة،
طرق لمنع البكتيرية Pyomelanin الإنتاج وتحديد الزيادة المقابلة في الحساسية للإجهاد التأكسدي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L.… More

Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (102), e53105, doi:10.3791/53105 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter