Protocol
1. Préparation des milieux de culture, des antibiotiques, et 2- [2-nitro-4- (trifluorométhyl) benzoyl] -1,3-cyclohexanedione (NTBC)
- Ajouter du bouillon LB (1% de tryptone, 0,5% d'extrait de levure, 0,25% de NaCl dans H 2 O) et aliquote dans des volumes appropriés. Stériliser par autoclave. Magasin à la température ambiante.
- Ajouter 100 ml de gélose LB (1% de tryptone, 0,5% d'extrait de levure, 0,25% de NaCl, 1,5% de gélose dans H 2 O) dans des flacons de 250 ml. Stériliser par autoclave et conserver à la température ambiante. Assurez-vous que l'agar-agar est fondu avant de verser dans des assiettes.
REMARQUE: Les flacons contenant 100 ml de gélose LB donnera 4 assiettes. La quantité de gélose LB peut être modifiée pour correspondre au nombre de plaques nécessaires pour le dosage. - Assurez-PBS (137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Stériliser par autoclave ou par filtration et stocker à température ambiante.
- Préparer les solutions d'achat d'actions aux antibiotiques pour la gentamicine, la kanamycine, und tobramycine.
- Préparer les concentrations de stocks d'antibiotiques appropriés pour P. aeruginosa souches contenant 100 mg / ml de gentamicine, 30 mg / ml de kanamycine et 10 mg / ml de tobramycine. Dissoudre les antibiotiques dans l'eau, stériliser par filtration (0,2 um), et conserver à 4 ° C. Modifier les antibiotiques et les concentrations en fonction de la bactérie étudiée.
- Préparer les solutions mères NTBC. Dissolvez 10 mg de NTBC dans 400 pi de DMSO. Cela donne une concentration de 75,9 mM NTBC. Magasin NTBC solutions stock à -20 ° C. Solutions décongeler à la température ambiante, au besoin.
Remarque: Les différentes sources de NTBC ont des différences de solubilité. Déterminer le véhicule approprié pour dissoudre le NTBC basée sur les recommandations du fabricant et ajuster l'étape 1.5 en conséquence.
2. NTBC titrages de souches bactériennes
- Mettre en place des cultures de la nuit des souches à tester. Ajouter 2 ml de LB tube à essai bouillon à 16 x 150 mms (un par souche) et ensemencer avec 1 colonie isolée de chaque souche. Incuber pendant une nuit à 37 ° C avec aération sur un rotateur de culture de tissu dans un incubateur à air.
- Le lendemain, préparer titrages de NTBC dans un bouillon LB. Utilisez une gamme initiale de 0 à 900 uM NTBC depuis différentes souches ont des différences de sensibilité à NTBC.
- Ajouter 1 ml de bouillon LB à 4 à 5 tubes à essai (16 x 150 mm) par souche.
- Ajouter le bouillon solution NTBC (75,9 mM) pour les tubes à essai (16 x 150 mm) dans une gamme de concentrations. Voir le tableau 1 pour les concentrations NTBC et les volumes d'achat d'actions correspondantes à ajouter à 1 ml de bouillon LB.
- Mesurer la DO 600 des cultures de la nuit. Laver les cultures avant de prendre OD 600 lectures pour éliminer pyomelanin présente dans les médias.
- Laver les cultures par centrifugation 1 ml de la culture dans une microcentrifugeuse à 16 000 g pendant 2 min. Retirer le surnageant et des cellules faiblement granulés avecune micropipette et remettre en suspension le culot cellulaire solide dans 1 ml LB.
- Ensemencer les tubes de titrage à DO 600 0,05. Calculez le montant de la culture lavé nécessaire pour inoculer les tubes.
REMARQUE: Utilisez les cultures lavées pour inoculations depuis pyomelanin ne devraient pas être présents. - Incuber les tubes de titrage pour environ 24 heures à 37 ° C avec aération à l'aide d'un rotateur de culture tissulaire dans un incubateur à air.
- Photographier les tubes de titrage et de comparer la production de pigments à l'intérieur et entre les souches afin de déterminer la quantité de NTBC à utiliser pour MIC et le stress oxydatif dosages. Utilisez OD 600 lectures pour déterminer le montant de pyomelanin dans la cellule libre surnageant de culture et pour déterminer la densité cellulaire.
Remarque: Le ratio DO 600 de pyomelanin dans le surnageant de culture de cellules peut être calculée à quantifier les différences de production pyomelanin après le traitement avec NTBC.
3. antibiotiques INHIBI minimumConcentration Tory (MIC) Dosage des plaques à 96 puits
- Mettre en place des cultures de la nuit des souches à tester dans du LB avec et sans NTBC.
NOTE: Ce protocole est décrit en utilisant le niveau représentatif de 300 um NTBC. Le niveau de NTBC approprié pour être utilisé dans l'étape est déterminé 2.6.- Ajouter 300 um NTBC à 2 ml LB. Ajouter un volume équivalent de véhicule (DMSO) à 2 ml de LB pour la condition de ne NTBC.
- Utiliser des cure-dents stériles, ensemencer des tubes avec une colonie isolée de bactéries. Il y aura une culture avec NTBC et une culture sans NTBC pour chaque souche. Incuber pendant une nuit à 37 ° C avec aération à l'aide d'un rotateur de culture tissulaire dans un incubateur à air.
- Le lendemain, faire LB + NTBC et des solutions de maître LB + DMSO pour la mise en place du test MIC. Ajouter NTBC à une concentration de 600 uM que ce sera diluée deux fois lorsque l'inoculum est ajouté, donnant une concentration finale de 300 um.
- Pour tester un Antibiotique pour une souche, ajouter 600 um NTBC à 2 ml de LB et mélanger pour rendre la solution maître NTBC. Ajouter un volume équivalent de véhicule (DMSO) à 2 ml de LB et mélanger pour faire le pas de solution de maître NTBC. Utiliser ces solutions pour créer des solutions mères d'antibiotiques, ainsi que pour mettre en place la série de dilutions dans des plaques à 96 puits.
NOTE: Les formulations de solutions de maître seront obtenir une solution supplémentaire pour tenir compte des erreurs de pipetage. Les solutions de base peuvent être mises à l'échelle supérieure ou inférieure selon les besoins en fonction du nombre des antibiotiques et des souches testées.
- Pour tester un Antibiotique pour une souche, ajouter 600 um NTBC à 2 ml de LB et mélanger pour rendre la solution maître NTBC. Ajouter un volume équivalent de véhicule (DMSO) à 2 ml de LB et mélanger pour faire le pas de solution de maître NTBC. Utiliser ces solutions pour créer des solutions mères d'antibiotiques, ainsi que pour mettre en place la série de dilutions dans des plaques à 96 puits.
- Préparer les solutions d'antibiotiques dans les solutions de maître LB + NTBC ou LB + DMSO.
NOTE: La concentration de l'antibiotique dans ces solutions devrait être le double de la concentration souhaitée finale. Assez solution doit être fait pour transférer 100 pi de quatre puits dans une plaque de 96 puits.- Préparer la gentamicine +/- solution stock NTBC à 64 pg / ml. Pour rendre cette solution, ajouter 0,288 ul d'actions gentamicine (100 mg / ml) à 450ul LB + NTBC ou une solution de maître LB + DMSO.
NOTE: La concentration maximale de gentamicine pendant P. aeruginosa est PAO1 32 ug / ml. - Faire de la kanamycine +/- solution stock NTBC à 256 pg / ml. Pour rendre cette solution, ajouter 3,84 pi de kanamycine de stock (30 mg / ml) à des solutions de maître LB + NTBC ou LB + DMSO 450 pi.
NOTE: La concentration maximale de kanamycine pour P. aeruginosa est PAO1 128 ug / ml. - Préparer tobramycine +/- solution stock NTBC à 8 pg / ml. Pour rendre cette solution, ajouter 0,36 pi de tobramycine de stock (10 mg / ml) à des solutions de maître LB + NTBC ou LB + DMSO 450 pi.
NOTE: Pour P. PAO1 aeruginosa, la concentration maximale de tobramycine est de 4 ug / ml.
REMARQUE: Les antibiotiques et les concentrations peuvent être ajustés pour les bactéries à tester.
- Préparer la gentamicine +/- solution stock NTBC à 64 pg / ml. Pour rendre cette solution, ajouter 0,288 ul d'actions gentamicine (100 mg / ml) à 450ul LB + NTBC ou une solution de maître LB + DMSO.
- Ajouter 100 ul de chaque solution antibiotique 2x à quatre puits dans une plaque à 96 puits. Placez ces solutions dans la ligne A. Pour example, la gentamicine doit être placé dans A1 à A4, kanamycine doit être placé dans A5 à A8, et la tobramycine doit être placé dans A9 travers A12. Voir Figure 1A pour un schéma d'une plaque de 96 puits mis en place.
NOTE: Plusieurs antibiotiques peuvent être testés dans une plaque, mais une seule souche doivent être testés par plaque pour éliminer le risque de contamination croisée à partir d'autres souches. - Ajouter 50 pi de la solution de maître LB + NTBC ou LB + DMSO aux rangées B à H de la plaque de 96 puits. Veiller à ce que une plaque est LB + NTBC et une plaque est LB + DMSO. Voir Figure 1A.
- Utilisez LB + NTBC pour les antibiotiques dans LB + NTBC. Utilisation LB + DMSO pour les antibiotiques dans LB + DMSO.
- Aide d'un micro effectuer deux dilutions en série pliage des antibiotiques en transférant 50 pi de la solution de la ligne A à la ligne B. Mélangez la solution, changer les embouts de pipette et transférer 50 pi de la solution de la ligne B à ramer C. Répétez l'opération pour l'remainirangées Ng. Après dilution rangée G, retirez 50 pi de la solution de cette ligne et de défausse. Utilisez la rangée H comme aucun contrôle antibiotique pour la croissance bactérienne. Voir Figure 1B.
REMARQUE: Chaque puits dans les rangées A à G contient maintenant 50 pi d'antibiotiques dans LB + NTBC ou LB + DMSO à 2X la concentration souhaitée finale. Rangée H contient NTBC LB + LB + DMSO ou sans antibiotiques. - Mesurer la DO 600 des cultures de la nuit. Lavez toutes les cultures avant de prendre OD 600 lectures pour éliminer pyomelanin présente dans les médias.
- Laver les cultures par centrifugation 1 ml de la culture dans une microcentrifugeuse à 16 000 g pendant 2 min. Retirer le surnageant avec une micropipette et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de LB.
- Diluer les cultures d'une nuit à 2.75x10 5 UFC / ml en LB.
REMARQUE: On suppose qu'une unité OD 600 est l'équivalent de 1x10 9 UFC / ml de P. aeruginosa. OD UFC / ml conversions peut être DDIFFÉRENTES dans d'autres bactéries. - Ajouter 50 ul de la culture bactérienne diluée au puits approprié.
REMARQUE: Les cultures cultivées dans NTBC doivent être ajoutés dans les puits contenant NTBC et cultures cultivées dans du DMSO doit être ajouté dans les puits contenant le DMSO. Voir Figure 1B.- Ajouter bactéries trois puits pour chaque souche et la concentration antibiotique. Ajouter 50 pi de LB pour la quatrième et à agir en tant que témoin de la contamination bactérienne. Voir Figure 1B.
- Utilisez une micropipette multi-canal pour inoculer les puits. Veiller à ce que la pipette conseils sont près du fond des puits lors de l'ajout inoculum pour prévenir la contamination des puits voisins.
REMARQUE: Ajout de culture bactérienne dans les puits va diluer les concentrations d'antibiotiques et NTBC double.
- Couvrir les plaques à 96 puits avec du parafilm et incuber environ 24 heures à 37 ° C. Incuber les plaques à 96 puits de façon statique, dans un incubateur à air.
- Examinerles plaques pour la croissance bactérienne dans les puits. La CIM est la concentration la plus faible de l'antibiotique à laquelle aucune croissance bactérienne est observée pour les trois répétitions de chaque souche.
- Examiner la plaque de croissance ou de lire en utilisant un lecteur de plaque d'ensemble DO 600.
4. Coin plaque de dosage pour réponse au stress oxydatif
- Mettre en place des cultures de la nuit des souches à tester dans du LB avec et sans NTBC comme décrit dans l'étape 3.1.
- Le jour suivant, la préparation des plaques de gélose LB contenant H 2 O 2 comme un facteur de stress oxydatif. Une gamme de H 2 O 2 concentrations de 0 à 1 mm est un bon point de départ.
- Faire fondre les flacons de gélose LB. Refroidir les médias à environ 50 ° C à la température ambiante.
- Ajouter H 2 O 2 directement aux médias refroidis aux concentrations désirées. Flacons Agiter pour mélanger. Voir le tableau 2 pour les concentrations de H 2 O 2et les volumes de H 2 O 2 concentré à ajouter. Ces valeurs sont basées sur 100 ml de LB agar.
- Verser plaques immédiatement après l'addition de H 2 O 2 et de la flamme de la surface pour éliminer les bulles. Le rendement est de 4 plaques par 100 ml de gélose LB. Marquer les plaques avec la concentration de H 2 O 2.
- Placez les plaques découverts dans une hotte à flux biologique avec le ventilateur en marche pendant 30 min pour éliminer l'excès d'humidité des plaques.
REMARQUE: Utilisez les plaques de la même journée, ils sont préparés. Ne pas le faire peut conduire à des données incohérentes.
NOTE: les facteurs de stress oxydatif tels que le paraquat peut être remplacé par H 2 O 2 dans cet essai. Les concentrations utilisées pour les facteurs de stress oxydatif d'autres peuvent être différents de ceux utilisés pour H 2 O 2.
- Lavez et mesurer l'OD 600 des cultures de la nuit tel que décrit dans l'étape 3.7.
- Normaliser l'OD 600 de toute la nuit cultures à la plus faible valeur pour l'ensemble des souches testées. P. aeruginosa présente généralement une DO600 d'environ 2,5 lorsqu'il est cultivé pendant la nuit dans LB + NTBC ou LB + DMSO.
- Déterminer le volume de culture nécessaire pour diluer la culture à la densité optique la plus basse 600 dans un volume total de 1 ml. Par exemple, si une culture a une DO 600 de 3 et le plus bas OD 600 pour l'ensemble des souches est de 2,5, effectuer le calcul suivant: (2.5) (1 ml) = (3) (x). x = 0.833 ml. 0.833 ml de culture seront placés dans un tube de micro.
- Calculer la quantité de LB + NTBC (300 uM) ou de LB + DMSO nécessaire pour porter le volume de culture de 1 ml. Pour l'exemple à l'étape 4.4.1, la quantité de LB + NTBC ou LB + DMSO ajouté à la culture serait 0,167 ml (1 ml de volume total - 0,833 ml de culture). Faire des solutions mères de LB + NTBC et LB + DMSO à utiliser pour ces dilutions basé sur le volume nécessaire pour diluer toutes les souches.
- Mélanger la culture et LB + NTBC ou LB + DMSO au vortex.
- Afin de maintenir les cultures à une concentration constante de NTBC ou le DMSO, des dilutions en série de dix effectuer pliage des cultures d'une nuit dans du PBS + normalisées NTBC ou PBS + DMSO.
- Faire des solutions d'achat d'actions de PBS + NTBC et PBS + DMSO. Pour un ensemble de dilutions pour une souche, mélanger 300 um NTBC ou un volume équivalent de DMSO avec du PBS pour obtenir un volume total de 720 ul. Échelle ces stocks haut ou le bas selon le nombre de souches sont testées.
- Étiquette tubes de microcentrifugation à 10 -1 à -7 10 dilutions en série. Ajouter 90 pl de PBS ou du PBS + NTBC + DMSO dans les tubes appropriés. Utilisation du PBS + NTBC pour les souches cultivées dans du milieu LB + NTBC et en utilisant du PBS + DMSO pour les souches cultivées dans du milieu LB + DMSO.
- Ajouter 10 ul de la culture à la 10 -1 tube de dilution appropriée. Mélanger par tourbillonnement et transférer 10 pi de la dilution 10 -1 à 10 -2 tube de dilution. Répétez jusqu'à ce que toutes les dilutions ont été performée. Changer conseils pipette entre dilutions.
- Spot 5 pi de la 10 -3 à travers 10 -7 dilutions sur LB + H 2 O 2 plaques en double pour chaque souche. Utilisez une pipette si des points sont étalées de plus dilué à moins diluée (10 -7 à 10 -3). Ne pas basculer ou incliner la plaque jusqu'à ce que le liquide a séché dans la plaque.
- Incuber les plaques pendant 24-48 h à 37 ° C (incubateur à air), en fonction de la souche.
REMARQUE: P. aeruginosa PAO1 aura de bonnes colonies de taille sur LB après 24 heures d'incubation. Incuber les souches jusqu'à ce qu'ils aient colonies environ la même taille que PAO1. - Photographier les plaques à l'aide d'une caméra CCD-dessus d'une transluminator. Eventuellement, modifier les photos pour le contraste et la culture à la même taille. Comptez le nombre de colonies dans chaque endroit pour déterminer les changements dans la sensibilité au stress oxydatif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Titrages NTBC
Les titrages NTBC ont été utilisés pour déterminer si NTBC était en mesure de réduire la production de pyomelanin dans P. aeruginosa, et également d'identifier la concentration de NTBC qui élimine ou réduit pyomelanin production pour utilisation dans des essais supplémentaires. Il peut y avoir des variations dans les niveaux de pyomelanin produite dans différentes répétitions, mais les tendances générales restent constants. L'essai de titrage NTBC pourrait également être modifié pour tester d'autres composés qui sont susceptibles d'affecter la production de pigments dans d'autres bactéries. Cela ne fonctionne, cependant, si il ya un changement phénotypique qui peut être déterminée visuellement ou quantifiée.
Traitement des souches de P. produire pyomelanin aeruginosa avec NTBC traduit par une diminution dose-dépendante de la production de pigment 12. La figure 2 montre que différentes souches de P. aeruginosa ont des différences de sensibilité à NTBC, comme indiqué par les niveaux de pyola production de mélanine. Des concentrations plus élevées de NTBC ont été nécessaires pour réduire pyomelanin production dans l'isolât clinique PA1111 17 (obtenu auprès de Dara Frank) par rapport à la souche de laboratoire HMGA :: tn 18 (University of Washington PAO1 banque de mutants de transposon). Les souches qui ne produisent pas pyomelanin [PAO1 (obtenu auprès de Carrie Harwood) et hpd :: tn 18 (University of Washington PAO1 transposon banque de mutants)] ont montré aucun changement dans la pigmentation de traitement NTBC. Nous avons décidé d'utiliser 300 um NTBC pour nos tests parce pyomelanin production a été sensiblement réduite dans la souche de laboratoire HMGA :: tn utilisant cette concentration (comparer 300 um à 0 uM NTBC). Toutes les souches utilisées dans cette étude ont été stockés à -80 ° C dans 15% de glycérol.
CMI antibiotiques
CMI antibiotiques peuvent être testées en utilisant plusieurs méthodes différentes. La méthode de microplaques décrit ici permettra l'utilisationr pour tester une gamme de concentrations d'antibiotiques et d'utiliser un minimum de ressources. Les résultats sont facilement reproduits et le dosage peuvent être modifiés pour tenir compte des différences de sensibilité aux antibiotiques de l'organisme à tester. Une certaine variation peut être observée entre les expériences indépendantes, mais les tendances sont assez cohérents. Répétitions techniques doivent présenter la même MIC.
Le tableau 3 montre les résultats pour les différentes P. aeruginosa souches traitées avec et sans NTBC et divers aminosides. Trois colonies indépendantes ont été testées en trois exemplaires selon le procédé décrit. Les CMI ont été enregistrés comme la plus faible concentration d'antibiotique qui inhibe la croissance bactérienne dans les trois répétitions techniques. NTBC traitement n'a eu aucun effet sur les pays à revenu intermédiaire de la famille des aminoglycosides pour les souches testées.
Le stress oxydatif essai sur plaque spot
Le dosage de la plaque de place pour le stress test oxydatif donne reproduciblRésultats de e en utilisant des niveaux inférieurs de H 2 O 2 que ceux utilisés dans d'autres dosages. La plaque sans H 2 O 2 est une plaque de contrôle pour déterminer la précision de la série de dilution pour chaque souche, ainsi que de déterminer la taille des colonies et le nombre de colonies dans chaque spot sans soumettre les cellules à un stress oxydatif. Dans une série de dilution appropriée, la dernière place devrait avoir très peu de colonies, tandis que la première place aura un nombre incalculable de colonies sur H 2 O 2 de médias libres. Il devrait y avoir une différence de dix fois dans le nombre de colonies dans chaque endroit dans une série de dilution. Pour toutes les souches testées, le même nombre de colonies doivent être considérés dans la même dilution sur la 2 O 2 plaque de commande libre H.
Comme les différentes souches de bactéries peuvent avoir des sensibilités différentes aux stress oxydatif, une gamme de H 2 O 2 concentrations devraient être testés. Des concentrations croissantes de H 2 O
La figure 3 montre un essai de plaque spot de souches de pyomelanin et non pyomelanin production de P. aeruginosa traité avec et sans NTBC et exposé au H 2 O 2 de stress oxydatif induit. Il ya une différe clairnce de la sensibilité au stress oxydatif lorsque pyomelanin bactéries productrices sont traités avec NTBC, et aussi entre les bactéries qui ne produisent pas pyomelanin par rapport à celles qui ne produisent pigment. Les souches qui ne produisent pas pyomelanin, soit naturellement, soit due à un traitement NTBC, étaient plus sensibles au stress oxydatif que les souches qui produisent pyomelanin.
Figure 1:. Schéma d'antibiotique test de MIC plaque de 96 puits mis en place (A) 100 pi d'antibiotiques 2x de la concentration de départ les plus élevés sont dans la ligne A. rangées B à H sont remplis avec 50 ul de LB + NTBC ou LB + DMSO sans antibiotiques. (B) deux dilutions en série sont effectuées dans pliage rangées A à G, résultant dans 50 pi de chaque antibiotique dilué dans 2x à la concentration désirée et finale. Ligne H est un contrôle bien pour bla croissance acterial sans antibiotiques. 50 ul de LB ou inoculum est ajouté dans les puits appropriés, diluer les antibiotiques deux fois à la concentration finale. LB sert de contrôle de la contamination bactérienne dans les antibiotiques. Gm, la gentamicine; Km, la kanamycine; Tob, tobramycine.
Figure 2: titrages NTBC des producteurs de pyomelanin et non-producteurs de P. aeruginosa. NTBC pyomelanin production réduite d'une manière dépendant de la dose en laboratoire et les producteurs de pyomelanin cliniques, mais n'a eu aucun effet sur la production de pigments dans des souches qui ne produisent pas pyomelanin. Modifié à partir de la référence 12.
Figure 3: spot essai sur plaque de réponse au stress oxydatif souches bactériennes ont été diluée.d pour le même diamètre extérieur 600, série dilué 10 fois, et repéré sur des plaques LB contenant différentes concentrations de H 2 O 2. Les résultats 0 mm H 2 O 2 de plaques ont montré que toutes les souches ont été diluées correctement, comme indiqué par un nombre similaire de colonies dans chacun des points pour la même dilution pour différentes souches. Les plaques contenant H 2 O 2 montrent que les souches étaient plus sensibles au stress oxydatif comme la concentration de H 2 O 2 a augmenté. Ceci est indiqué par le nombre de colonies a diminué dans les spots par rapport au pas de H 2 O 2 état, ainsi que d'une réduction de la taille des colonies. Modifié à partir de la référence 12.
| Concentration finale de NTBC (MM) | Volume des NTBC (75,9 mM) à ajouter (ul) |
| 0 | 0 |
| 50 </ td> | 0,659 |
| 100 | 1.318 |
| 200 | 2.64 |
| 300 | 3,95 |
| 600 | 7,91 |
| 900 | 11,86 |
Tableau 1: concentrations NTBC pour la mise en place titrages en LB. Ce tableau donne diverses concentrations NTBC et la quantité correspondante de NTBC stock Pour ajouter 1 ml LB.
| Concentration finale de H 2 O 2 (mM) | Montant de 9,79 MH 2 O 2 (30% en poids) pour ajouter (ul) |
| 0 | 0 |
| 0,2 | 2.04 |
| 0,4 | 4.09 |
| 0,6 | 6.13 |
| 0,8 | 8.17 |
| 1 | 10.21 |
Tableau 2:. Les concentrations de H 2 O 2 à ajouter à la gélose LB pour le dosage de plaque de spot de stress oxydatif Ce tableau donne diverses H 2 O 2 concentrations et la quantité correspondante de H concentré 2 O 2 stock Pour ajouter 100 ml de LB agar.
| PAO1 - NTBC | PAO1 + NTBC | HMGA :: tn - NTBC | HMGA :: tn + NTBC | hpd de tn - NTBC | hpd :: tn + NTBC | PA1111 - NTBC | L65 "> PA1111 + NTBC||
| Gentamicine | 1 | 0,5 | 2 | 2 | 1 | 1 | 0,5 | 0,5 |
| Kanamycine | 16 | 8 | 32 | 32 | 32 | 32 | 16 | 16 |
| Tobramycine | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,25 | 0,25 | 0,5 | 0,5 |
Tableau 3: résultats de CMI d'antibiotiques Trois colonies indépendantes ont été testées en triple pour chaque stra.en. réimprimé avec la permission de référence 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Sigma-Aldrich | SML0269-50mg | Also called nitisinone. Soluble in DMSO. |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | 216763-100ML | 30 wt. % in H2O. Stabilized. |
| Gentamicin | Gold Bio | G-400-100 | Soluble in H2O. Filter sterilize. |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Soluble in H2O. Filter sterilize. |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | Soluble in H2O. Filter sterilize. |
References
- Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
- Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
- Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
- Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E.
- Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
- Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
- Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
- Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
- Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
- Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
- Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
- Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
- Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
- Andrews, J. M.
- Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
- Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
- Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
- Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092 (2011).
- Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).
