Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Metoder för att inhibera bakteriell Pyomelanin Produktion och Bestäm motsvarande ökning i känslighet för oxidativ stress

Published: August 31, 2015 doi: 10.3791/53105
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Wisconsin Milwaukee

Protocol

1. Framställning av odlingsmedier, Antibiotika, och 2- [2-nitro-4- (trifluormetyl) bensoyl] -1,3-cyklohexandion (NTBC)

  1. Gör LB-buljong (1% trypton, 0,5% jästextrakt, 0,25% NaCl i H2O) och delprov i lämpliga volymer. Sterilisera i autoklav. Förvaras vid rumstemperatur.
  2. Gör 100 ml LB-agar (1% trypton, 0,5% jästextrakt, 0,25% NaCl, 1,5% agar i H2O) i 250 ml kolvar. Sterilisera i autoklav och förvara vid rumstemperatur. Se till att agar smälts innan du häller i plattor.
    OBS: Kolvar innehållande 100 ml av LB-agar kommer att ge 4-plattor. Mängden LB-agar kan ändras för att motsvara antalet plattor som behövs för analysen.
  3. Gör PBS (137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Sterilisera genom autoklav eller filtrering och förvara vid rumstemperatur.
  4. Bered antibiotiska stamlösningar för gentamicin, kanamycin, end tobramycin.
    1. Utarbeta lämpliga antibiotiska aktiekoncentrationer för P. aeruginosa stammar innehållande 100 mg / ml gentamicin, 30 mg / ml kanamycin och 10 mg / ml tobramycin. Lös antibiotika i vatten, filtrera sterilisera (0,2 pm), och förvara vid 4 ° C. Ändra antibiotika och koncentrationer beroende på bakterien studeras.
  5. Bered NTBC stamlösningar. Lös 10 mg NTBC i 400 | il DMSO. Detta ger en koncentration av 75,9 mM NTBC. Store NTBC stamlösningar vid -20 ° C. Tina lösningar vid rumstemperatur efter behov.
    OBS: Olika källor NTBC har skillnader i löslighet. Bestäm lämplig fordonet för att lösa upp NTBC baserat på tillverkarens rekommendationer och justera steg 1,5 därefter.

2. NTBC Titreringar bakteriestammar

  1. Ställ upp nattgamla kulturer av stammarna som skulle testas. Tillsätt 2 ml LB-buljong till 16 x 150 mm provrörs (en per stam) och inokulera med en isolerad koloni från varje stam. Inkubera över natten vid 37 ° C med luftning på en vävnadsodlings rotator i en luftinkubator.
  2. Följande dag, förbereda titreringar av NTBC i LB-buljong. Använd en initial intervallet 0-900 iM NTBC eftersom olika stammar har skillnader i känslighet för NTBC.
    1. Tillsätt 1 ml LB-buljong till fyra till fem provrör (16 x 150 mm) per stam.
    2. Till NTBC stamlösningen (75,9 mM) för provrören (16 x 150 mm) i ett område av koncentrationer. Se Tabell 1 för NTBC koncentrationer och motsvarande lagervolymer för att lägga till en ml LB-buljong.
  3. Mät OD 600 av de nattgamla kulturer. Tvätta kulturer innan OD 600 avläsningar att eliminera pyomelanin närvarande i medierna.
    1. Tvätta kulturerna genom centrifugering 1 ml kultur i en mikrocentrifug vid 16 tusen xg under 2 minuter. Avlägsna supernatanten och eventuella löst pelleterade celler meden mikropipett och resuspendera fasta cellpelleten i 1 ml LB.
  4. Inokulera titrering rören vid OD 600 0,05. Beräkna mängden tvättat kultur som krävs för att ympa rören.
    OBS: Använd tvättade kulturerna för vaccinationer eftersom pyomelanin bör inte förekomma.
  5. Inkubera titreringen rör för cirka 24 h vid 37 ° C med luftning med användning av en vävnadsodlings rotator i en luftinkubator.
  6. Fotografera titreringen rören och jämför pigmentproduktion inom och mellan stammar för att bestämma mängden av NTBC att använda för MIC och oxidativ stress analyser. Använd OD 600 avläsningar för att bestämma mängden av pyomelanin i cellfri kultursupernatant och för att bestämma celldensitet.
    OBS: OD 600-förhållande av pyomelanin i kultursupernatant till celler kan beräknas för att kvantifiera skillnader i pyomelanin produktion efter behandling med NTBC.

3. Antibiotikum Minsta Inhibirium koncentrationen (MIC) Analys i 96-brunnsplattor

  1. Ställ upp nattgamla kulturer av stammarna som skulle testas i LB med och utan NTBC.
    OBS: Detta protokoll beskrivs med representativ 300 iM NTBC. Lämplig nivå på NTBC som skall användas bestäms i steg 2,6.
    1. Tillsätt 300 iM NTBC till 2 ml LB. Lägg till en ekvivalent volym av vehikel (DMSO) till 2 ml LB för någon NTBC skick.
    2. Med hjälp av sterila tandpetare, ympa rören med en isolerad koloni av bakterier. Det kommer att finnas en kultur med NTBC och en kultur utan NTBC för varje stam. Inkubera över natten vid 37 ° C med luftning med användning av en vävnadsodlings rotator i en luftinkubator.
  2. Följande dag, gör LB + NTBC och LB + DMSO huvudlösningar för att ställa in MIC analysen. Lägg NTBC vid en koncentration av 600 | iM, eftersom detta kommer att spädas två gånger när inokulum tillsätts, vilket ger en slutlig koncentration av 300 | iM.
    1. För att testa en antibiöron för en stam, tillsätt 600 iM NTBC till 2 ml LB och blanda för att göra NTBC huvudlösningen. Lägg till en ekvivalent volym av vehikel (DMSO) till 2 ml LB och blanda för att göra någon NTBC huvud lösning. Använd dessa lösningar för att skapa antibiotikastamlösningar samt för att ställa upp spädningsserie i 96-brunnsplattor.
      OBS: Befälhavaren lösningsformuleringar kommer att ge extra lösning för att redogöra för pipetteringsfel. Master lösningar kan skalas upp eller ner efter behov beroende på antalet av antibiotika och testade stammar.
  3. Förbered antibiotika lösningar i LB + NTBC eller LB + DMSO mästare lösningar.
    OBS: Den antibiotiska koncentrationen i dessa lösningar skall vara dubbelt den slutliga önskade koncentrationen. Tillräckligt lösning bör göras för att överföra 100 fil till fyra brunnar i en 96-brunnsplatta.
    1. Förbered gentamicin +/- NTBC stamlösning på 64 | j, g / ml. För att göra denna lösning, tillsätt 0,288 pl av gentamicin lager (100 mg / ml) till 450xl LB + NTBC eller LB + DMSO huvudlösning.
      OBS: Den maximala koncentrationen av gentamicin för P. aeruginosa PAO1 är 32 mikrogram / ​​ml.
    2. Gör kanamycin +/- NTBC stamlösning med 256 | ig / ml. För att göra denna lösning, tillsätt 3,84 | il kanamycin lager (30 mg / ml) till 450 ^ il LB + NTBC eller LB + DMSO mästare lösningar.
      OBS: Den maximala koncentrationen av kanamycin för P. aeruginosa PAO1 är 128 mikrogram / ​​ml.
    3. Förbered tobramycin +/- NTBC stamlösning med 8 | ig / ml. För att göra denna lösning, tillsätt 0,36 pl av tobramycin lager (10 mg / ml) till 450 ^ il LB + NTBC eller LB + DMSO mästare lösningar.
      OBS: För P. aeruginosa PAO1, den högsta koncentration av tobramycin är 4 mikrogram / ​​ml.
      OBS: antibiotika och koncentrationer kan justeras för bakterierna som skall testas.
  4. Tillsätt 100 | il av varje 2x antibiotikalösning till fyra brunnar i en 96-brunnsplatta. Placera dessa lösningar i rad A. För example, bör gentamicin placeras i A1 till A4, bör kanamycin placeras i A5 till A8, och tobramycin bör placeras i A9 genom A12. Se figur 1A för ett diagram över en 96-brunnars platta inrättas.
    OBS: Flera antibiotika kan testas på en platta, men endast en stam bör testas per platta för att eliminera risken för korskontaminering från andra stammar.
  5. Tillsätt 50 pl av LB + NTBC eller LB + DMSO huvudlösning till raderna B-H i 96-brunnar. Se till att en platta är LB + NTBC och en platta är LB + DMSO. Se figur 1A.
    1. Använd LB + NTBC för antibiotika i LB + NTBC. Använd LB + DMSO för antibiotika i LB + DMSO.
  6. Med hjälp av en mikropipett utföra två gånger serieutspädningar av antibiotika genom att överföra 50 ul av lösningen från rad A till rad B. Blanda lösningen, ändra pipettspetsar, och överföra 50 ul av lösningen från rad B till rad C. Upprepa för den remaining rader. Efter utspädning rad G, ta bort 50 | il av lösningen från den raden och kasta. Använd rad H som ingen antibiotika kontroll för bakterietillväxt. Se figur 1B.
    OBS: Varje brunn i rader A till G innehåller nu 50 il antibiotika i LB + NTBC eller LB + DMSO på 2X den slutliga önskade koncentrationen. Rad H innehåller LB + NTBC eller LB + DMSO utan antibiotika.
  7. Mät OD 600 av de nattgamla kulturer. Tvätta alla kulturer innan OD 600 avläsningar att eliminera pyomelanin närvarande i medierna.
    1. Tvätta kulturerna genom centrifugering 1 ml kultur i en mikrocentrifug vid 16 tusen xg under 2 minuter. Avlägsna supernatanten med en mikropipett och resuspendera cellpelleten i 1 ml LB.
  8. Späd övernattskulturer till 2.75x10 5 CFU / ml i LB.
    OBS: Antag att en OD 600 enhet motsvarar 1x10 9 CFU / ml för P. aeruginosa. OD till CFU / ml omvandlingar kan vara different i andra bakterier.
  9. Tillsätt 50 pl av den utspädda bakteriekultur till lämplig brunn.
    OBS: Kulturer odlade i NTBC bör läggas till brunnarna innehållande NTBC och kulturer odlas i DMSO bör tillsättas till brunnarna innehållande DMSO. Se figur 1B.
    1. Lägg bakterier till tre brunnar för varje stam och antibiotikakoncentrationen. Tillsätt 50 pl av LB till den fjärde väl för att verka som en kontroll för bakteriell kontamination. Se figur 1B.
    2. Använd en flerkanalig mikropipett för att ympa brunnarna. Se till att pipett tips är nära botten av brunnarna när du lägger inokulum för att förhindra kontaminering av angränsande brunnar.
      OBS: Lägga bakteriekultur till brunnarna kommer att späda ut antibiotika och NTBC koncentrationer två gånger.
  10. Täck 96-brunnars plattor med parafilm och inkubera ca 24 h vid 37 ° C. Inkubera 96 ​​brunnar statiskt, i en luftinkubator.
  11. Undersökplattorna för bakteriell tillväxt i brunnarna. MIC är den lägsta koncentrationen av antibiotikum i vilket ingen bakterietillväxt ses för alla tre replikat av varje stam.
    1. Undersöka visuellt plattan för tillväxt eller läsa med hjälp av en plattläsare inställd på OD 600.

4. Ställe plattanalys för oxidativ stress Response

  1. Ställ upp nattgamla kulturer av stammarna som skulle testas i LB med och utan NTBC såsom beskrivs i steg 3,1.
  2. Nästa dag, förbereda LB-agarplattor innehållande H2O 2 som en oxidativ stressfaktor. Ett urval av H 2 O 2 koncentrationer från 0 till 1 mM är en bra utgångspunkt.
    1. Smält LB-agar-kolvar. Cool medier till cirka 50 ° C vid rumstemperatur.
    2. Lägg H2O 2 direkt till den kylda media vid de önskade koncentrationerna. Swirl kolvar att blanda. Se tabell 2 för koncentrationer av H2O 2och volymer koncentrerad H 2 O 2 för att lägga till. Dessa värden är baserade på 100 ml LB-agar.
    3. Häll plattor omedelbart efter tillsats av H2O 2 och flamma ytan för att avlägsna bubblor. Utbytet är 4 plattor per 100 ml LB-agar. Märk plattorna med H2O 2 koncentration.
    4. Placera plattorna utan lock i ett biologiskt flöde huva med fläkten körs under 30 min för att avlägsna överskott av fukt från plattorna.
      OBS: Använd plattorna samma dag de är beredda. Underlåtenhet att göra detta kan resultera i inkonsekventa data.
      OBS: Oxidativa stress såsom paraquat kan ersätta H2O 2 i denna analys. De koncentrationer som används för andra oxidativa stressfaktorerna kan vara annorlunda än de som används för H 2 O 2.
  3. Tvätta och mäta OD 600 av de nattgamla kulturer som beskrivs i steg 3,7.
  4. Normalisera OD 600 av alla natten cultures till det lägsta värdet för uppsättningen av stammar testas. P. aeruginosa har i allmänhet en OD 600 på cirka 2,5 när den odlas över natten i LB + NTBC eller LB + DMSO.
    1. Bestäm volym odlings behövs för att späda ut kulturen till den lägsta OD 600 i en total volym av 1 ml. Till exempel, om en kultur har en OD 600 av 3 och den lägsta OD 600 för uppsättningen av stammar är 2,5, utföra följande beräkning: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml av kultur kommer att placeras i ett mikrofugrör.
    2. Beräkna mängden LB + NTBC (300 pM) eller LB + DMSO behövs för att odlingsvolymen till 1 ml. För exemplet i steg 4.4.1, mängden LB + NTBC eller LB + DMSO sattes till kulturen skulle vara 0,167 ml (1 ml total volym - 0,833 ml kultur). Gör förrådslösningar av LB + NTBC och LB + DMSO att använda för dessa späd baserat på den volym som krävs för att späda alla stammar.
    3. Blanda kultur och LB + NTBC eller LB + DMSO genom att vortexa.
  5. För att bibehålla kulturer i en konstant koncentration av NTBC eller DMSO, utför tio faldiga serieutspädningar av de normaliserade nattgamla kulturer i PBS + NTBC eller PBS + DMSO.
    1. Gör förrådslösningar av PBS + NTBC och PBS + DMSO. För en uppsättning utspädningar för en stam, blanda 300 ^ iM NTBC eller en ekvivalent volym av DMSO med PBS för att ge en total volym av 720 | il. Skala dessa bestånd upp eller ner beroende på hur många stammar testas.
    2. Etikett mikrofugrör för 10 -1 till 10 -7 serieutspädningar. Lägg 90 pl PBS + NTBC eller PBS + DMSO till lämpliga rör. Använd PBS + NTBC för stammar som odlas i LB + NTBC och använda PBS + DMSO för stammar som odlas i LB + DMSO.
    3. Tillsätt 10 pl av kultur till lämpliga 10 -1 späd rör. Blanda genom att vortexa och överföra 10 ìl av 10 -1 utspädning till 10 -2 utspädnings rör. Upprepa tills alla utspädningar har varit performed. Ändra pipettspetsar mellan utspädningar.
  6. Spot 5 ul av 10 -3 genom 10 -7 utspädningar på LB + H 2 O 2 plattor i duplikat för varje stam. Använd en pipett tips om fläckar stryks från de flesta späd till minst utspädd (10 -7 till 10 -3). Tippa inte eller luta plattan tills vätskan har torkat i plattan.
  7. Inkubera plattorna under 24-48 timmar vid 37 ° C (luft-inkubator), beroende på stammen.
    OBS: P. aeruginosa PAO1 kommer att ha väl tilltagna kolonier på LB efter 24 h inkubation. Inkubera stammar tills de har kolonier ungefär samma storlek som PAO1.
  8. Fotografera plattorna med hjälp av en CCD-kamera ovanför en transluminator. Eventuellt redigera foton för kontrast och gröda till samma storlek. Räkna antalet kolonier i varje plats för att bestämma förändringar i känslighet för oxidativ stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NTBC titreringar

De NTBC titreringar användes för att bestämma om NTBC kunde minska pyomelanin produktionen i P. aeruginosa, och även identifiera koncentrationen av NTBC som eliminerar eller reducerar pyomelanin produktion för användning i ytterligare analyser. Det kan finnas variationer i nivåerna av pyomelanin produceras i olika replikat, men allmänna trender förblir konstanta. Den NTBC titrering analys skulle också kunna modifieras för att testa andra föreningar som kan påverka pigmentproduktion i andra bakterier. Detta fungerar bara, men om det finns en fenotypisk förändring som kan visuellt bestämmas eller kvantifieras.

Behandling av pyomelanin producerande stammar av P. aeruginosa med NTBC resulterade i en dosberoende minskning av pigmentproduktion 12 Fig. 2 visar att olika stammar av P. aeruginosa har skillnader i känslighet för NTBC, såsom indikeras av halterna av Pyomelaninproduktionen. Högre koncentrationer av NTBC krävdes för att reducera pyomelanin produktion i kliniskt isolat PA1111 17 (erhållen från Dara Frank) jämfört med laboratoriestammen HMGA :: tn 18 (University of Washington PAO1 transposon mutanta bibliotek). Stammar som inte producerar pyomelanin [PAO1 (erhållen från Carrie Harwood) och HPD :: tn 18 (University of Washington PAO1 transposon mutant bibliotek)] visar ingen förändring av pigmentering med NTBC behandling. Vi beslutade att använda 300 iM NTBC för våra analyser eftersom pyomelanin produktionen minskat kraftigt i laboratoriestammen HMGA :: tn använder den koncentration (jämför 300 iM till 0 iM NTBC). Alla stammar som användes i denna studie lagrades vid -80 ° C i 15% glycerol.

Antibiotiska MIC

Antibiotika MIC kan testas med hjälp av flera olika metoder. Mikrotiterplattan metod som beskrivs här kommer att tillåta användningr att testa en rad antibiotiska koncentrationer och använda ett minimum av resurser. Resultaten lätt kopieras och analysen kan modifieras för att ge utrymme för skillnader i antibiotisk känslighet av organismen som skall testas. Viss variation kan ses mellan oberoende försök, men trender är ganska konsekvent. Tekniska replikat bör uppvisa samma MIC.

Tabell 3 visar resultaten för olika P. aeruginosa stammar behandlade med och utan NTBC och olika aminoglykosidantibiotika. Tre oberoende kolonier testades i tre exemplar enligt metoden beskriven. MIC registrerades som den lägsta koncentration av antibiotikum som inhiberade bakterietillväxt i alla tre tekniska replikat. NTBC behandling hade ingen effekt på aminoglykosid MIC för testade stammar.

Oxidativ stress plats plattanalys

Spotplattanalys för att testa oxidativ stress ger reproducible resultat med användning av lägre nivåer av H2O 2 än de som används i andra analyser. Plattan utan H2O 2 är en styrplåt för att bestämma noggrannheten hos utspädningsserie för varje stam, samt bestämma kolonistorlek och antalet kolonier i varje fläck utan att utsätta cellerna för oxidativ stress. I en riktig spädningsserie, bör den sista plats har mycket få kolonier, medan den första platsen kommer att ha ett oräkneligt antal kolonier på H 2 O 2 fria medier. Det bör finnas en tio-faldig skillnad i antalet kolonier i varje plats inom en spädningsserie. För alla testade stammar, bör liknande antal kolonier ses i samma utspädning i H 2 O 2 fria kontrollplatta.

Eftersom olika bakteriestammar kan ha olika känslighet för oxidativ stress, en rad H 2 O 2 koncentrationer bör testas. Ökande koncentrationer av H2O H2O 2 inducerad oxidativ stress. Tillväxtegenskaperna hos olika bakteriestammar kan jämföras för att bestämma känsligheten för oxidativ stress enligt ett visst H2O 2 koncentration. Analysen kan modifieras för att bestämma effekterna av en speciell förening eller reagens, såsom NTBC, på en enda bakteriestam när bakterierna utsätts för oxidativ stress. Kolonier kan också räknas för att bestämma minskningen av bakteriekolonibildande enheter mellan olika experimentella förhållanden procent.

Figur 3 visar en fläck plattanalys av pyomelanin och icke-pyomelanin producerande stammar av P. aeruginosa behandlades med och utan NTBC och exponeras för H2O 2 inducerad oxidativ stress. Det finns en tydlig differeiou i känslighet för oxidativ stress när pyomelanin producerande bakterier behandlas med NTBC, och också mellan bakterier som inte producerar pyomelanin jämfört med dem som inte producerar pigment. Stammar som inte producerar pyomelanin, antingen naturligt eller på grund av NTBC behandling, var mer känsliga för oxidativ stress än stammar som producerade pyomelanin.

Figur 1
Figur 1:. Schematisk av antibiotikum MIC-analys 96-brunnars platta inrättas (A) 100 pl av 2x antibiotika av högsta startkoncentrationen är i rad A. raderna B-H är fyllda med 50 ul av antingen LB + NTBC eller LB + DMSO utan antibiotika. (B) Två-faldiga seriespädningar utförs i raderna A till G, vilket resulterade i 50 ul av utspätt antibiotikum i varje brunn vid 2x den slutliga önskade koncentrationen. Rad H är en kontrollbrunn för bacterial tillväxt utan antibiotika. 50 il LB eller inokulat tillsätts till lämpliga brunnar, späda ut antibiotika två gånger till den slutliga koncentrationen. LB fungerar som en kontroll för bakteriell förorening antibiotika. Gm, gentamicin; Km, kanamycin; Tob, tobramycin.

Figur 2
Figur 2: NTBC titreringar av pyomelanin producenter och icke-producenter av P. aeruginosa. NTBC minskade pyomelanin produktionen på ett dosberoende sätt laboratorie- och kliniska pyomelanin producenter, men hade ingen effekt på pigmentproduktion i stammar som inte producerar pyomelanin. Modifierad från 12 referens.

Figur 3
Figur 3: Spot plattanalys för oxidativ stress Bakteriestammar var utspädd.d till samma OD 600, seriell späddes 10-faldigt, och fläckades på LB-plattor innehållande olika koncentrationer av H2O 2. De 0 mm H 2 O 2 platt Resultaten visade att alla stammarna späddes korrekt, vilket indikeras av ett liknande antal kolonier i var och en av platserna för samma utspädning för olika stammar. Plattorna innehållande H2O 2 visar att stammarna var mer känsliga för oxidativ stress som den koncentration av H2O 2 ökas. Detta indikeras av minskade koloniräkningar i fläckarna jämfört med ingen H2O två tillstånd, såväl som en minskning av kolonistorlek. Modifierad från 12 referens.

Slutlig koncentration av NTBC (pM) Volym av NTBC (75,9 mM) för att lägga till (il)
0 0
50 </ td> 0,659
100 1,318
200 2,64
300 3,95
600 7,91
900 11,86

Tabell 1: NTBC koncentrationer för att inrätta titreringar i LB. Denna tabell ger olika NTBC koncentrationer och motsvarande mängd NTBC lager för att lägga till en ml LB.

Slutlig koncentration av H2O 2 (mM) Mängd 9,79 MH 2 O 2 (30% vikt) för att lägga (il)
0 0
0,2 2,04
0,4 4,09
0,6 6,13
0,8 8,17
1 10,21

Tabell 2:. Halterna av H 2 O 2 för att lägga till LB agar för oxidativ stress plats plattanalys Denna tabell ger olika H 2 O 2 koncentrationer och motsvarande mängd koncentrerad H2O 2 lager för att lägga till 100 ml LB-agar.

L65 "> PA1111 + NTBC
PAO1 - NTBC PAO1 + NTBC HMGA :: tn - NTBC HMGA :: tn + NTBC HPD :: tn - NTBC HPD :: tn + NTBC PA1111 - NTBC
Gentamicin 1 0,5 2 2 1 1 0,5 0,5
Kanamycin 16 8 32 32 32 32 16 16
Tobramycin 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,25 0,5 0,5

Tabell 3: antibiotika MIC resultat Tre oberoende kolonier testades i tre exemplar för varje stra.i. Re-tryckt med tillstånd från 12 referens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) Sigma-Aldrich SML0269-50mg Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2 Sigma-Aldrich 216763-100ML 30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin Gold Bio G-400-100 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG Soluble in H2O.  Filter sterilize.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092 (2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

Tags

Immunology Utgåva 102 mikrobiologi, NTBC oxidativ stress minsta hämmande koncentration
Metoder för att inhibera bakteriell Pyomelanin Produktion och Bestäm motsvarande ökning i känslighet för oxidativ stress
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L.… More

Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (102), e53105, doi:10.3791/53105 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter