Introduction
I 2006 blev en ny tilgang, der er beskrevet til at omprogrammere somatiske celler i en pluripotent tilstand. Efter præ-screening af en vifte af potentielle omprogrammering faktorer musefibroblaster kan med held omdannes til såkaldte inducerede pluripotente stamceller (IPS) efter retroviral transduktion og overekspression af fire transkriptionsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Efterfølgende denne teknik har effektivt blevet reproduceret brug af somatiske celler fra forskellige pattedyrarter, herunder mennesker 2, aber 3, rotter 4, hunde 5, får 6 og grise 7. Desuden ændrede protokoller udelade eller udskiftning af potentielt onkogene transkriptionsfaktor c-myc er blevet offentliggjort 8, 9.
Uanset den indledende omprogrammering nærmer sande pluripotens af voksende kolonier skal bekræftes, en møjsommelig og tidskrævende opgave. En væsentlig ulempeaf de fleste af disse analyser er, at de ikke kan udføres på levende celler. Etablerede pluripotens faktorer såsom OCT4, SOX2, NANOG eller REX1 repræsenterer transkriptionsfaktorer placeret i kernen og deres påvisning kræver fiksering af cellerne forud for immunhistokemi eller cellelyse til RT-PCR-analyse 10 -. 12 Derefter disse celler tabt for fremtiden eksperimenter kræver gentagne kulturer af hver koloni.
Således er en teknologi til at analysere pluripotens på levende celler er meget ønskeligt. Adskillige fremgangsmåder kan faktisk udføres direkte på levende celler under anvendelse af antistoffer rettet mod membran-baserede antigener (f.eks. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluorescerende farvestoffer rapporteret at detektere alkalisk phosphatase 13 eller små molekyler, som specifikt navngive embryostam (ES) og iPS celler 14. Dog kan antistofferne imidlertid påvirke cellerne og hver method er begrænset til en enkelt pluripotency markør. Endelig fluorescerende molekylære beacons, dual-antisense-oligonukleotider med hårnålestrukturer, der tillader levende farvning af celler, er blevet beskrevet 15. Selv om denne fremgangsmåde kan anvendes til mange gener, teknikken kræver nucleofection af en enkelt cellesuspension, hvilket ikke gælder for voksende iPS kolonier.
Et par år siden gen-specifikke nanopartikler er blevet beskrevet til at analysere survivin udtryk i humane SKBR3 brystkræftceller 16. Dette manuskript beskriver en roman innovativ tilgang til at opdage pluripotens markører i levende ES og iPS celler ved brug af guld nanopartikel konjugater. Disse nanopartikler består af en central guldpartikler med en koblet capture streng bærer den komplementære RNA-sekvens og en Cy3-mærket reporter streng. Det fluorescerende signal af reporter-strengen standses ved centrale guldpartikler. Derudover passendenanopartikler tjene som negative og positive kontroller, henholdsvis (figur 1). For et program nanopartiklerne er simpelthen tilsættes til dyrkningsmediet (figur 2) og ind i cellerne via endocytose (figur 3). Hvis målet RNA udtrykkes det forskyder reporter streng, som derefter udsender et fluorescerende signal. Denne metode kræver ikke manipulation af målcellen og ekspressionen af målgenet kan overvåges optisk under et fluorescensmikroskop direkte i levende celler. Endvidere kan teknologien anvendes til enhver ønsket målgen på tværs af arter i tilfælde af iPS-celler og således kan anvendes i mange forskellige forskningsområder. Endelig flowcytometrisk analyser muliggøre identifikation og berigelse af Cy3 positive celler.
Protocol
1. Fremstilling af, reagenser og celledyrkningsbetingelser
- Human HEK 293 embryoniske nyreceller
- Kultur HEK 293-celler (CRL-1573, ATCC) i DMEM / Hams F-12-medium suppleret med 5% FCS, L-glutamin (2 mM) og penicillin (100 U / ml) / streptomycin (100 ug / ml).
- Passage cellerne vaskes cellerne én gang med PBS, tilsættes 0,05% trypsin / EDTA og inkuberes i 3 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Overfør celler i en 15 ml rør, centrifugeres i 5 minutter ved 1.200 rpm (300 x g) og overføre ca. 5x10 5 celler i et frisk T25 dyrkningskolbe.
- Murine embryonale fibroblaster (MEF)
- Tilsæt 1 ml af en 0,1% gelatineopløsning til individuelle 6 brønde og inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 1 time. Aspirer væske og opbevares ved stuetemperatur indtil brug.
- Kultur MEF i DMEM suppleret med 10% FCS, L-glutamin (2 mM), L-glucose (4,5 g / l), natriumpyruvat (1 mM) og penicillin (100 U /ml) / streptomycin (100 ug / ml) på gelatine-coatede plader med 6 brønde.
- Fordel MEF'er til 6-brønds plader og lad dem vokse, indtil konfluens. Tilføj mitomycin (5 ug / ml) i 2,5 timer at arrestere celler. Aspirer medium, vask celler to gange med komplet MEF medium og tilsæt 3 ml MEF medium til hver 6-brønd. Disse celler tjener som feeder-lag til murine og porcine iPS celler.
- Kultur af murine ES og iPS celler
- Til fremstilling af muse ES dyrkningsmedium, supplere DMEM medium med 15% FCS, L-glutamin (2 mM), L-glucose (4,5 g / l), MEM ikke-essentielle aminosyrer (1x), β-mercaptoethanol (0,1 mM) og leukæmi inhibitorisk faktor (1,000 U / ml).
- Skyl 6-brønde med vækststandsede MEF'er gang med serum-frit DMEM, tilsættes 2 ml mus ES medium og murine iPS celler (20% af cellerne i en sammenflydende parabol). Hver dag vask celler én gang med serumfrit DMEM og tilsæt 2 ml frisk mus ES medium.
- Passage cellerne vaskes hver brønd gang med serumfrit DMEM, tilsættes 0.25% Trypsin / EDTA og inkuberes i 3 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Overfør celler i en 15 ml rør, centrifugeres i 5 minutter ved 1.200 rpm (300 x g), Resuspender cellerne i 500 pi muse ES-medium, og 100 pi af suspensionen til 2 ml muse ES-medium i en frisk med 6 brønde med en MEF feeder-lag.
- Kultur af gris ips celler
- Til fremstilling af svin iPS medium supplere DMEM / Hams F-12-medium med 20% knockout serum, L-glutamin (2 mM), MEM ikke-essentielle aminosyrer (1x), β-mercaptoethanol (0,1 mM), og penicillin (100 U / ml) / streptomycin (100 ug / ml). Der filtreres gennem et 0,22 um filter og opbevares ved 4 ° C i 2 til 3 uger. Ved første brug, tilsæt bFGF (10 ng / ml slutkoncentration).
- Skyl 6-brønde med vækststandsede MEF'er gang med serumfrit DMEM / Ham F-12, og der tilsættes 1,5 ml svin iPS mellem- og svin iPS celler (10% af cellerne i en konfluent skål). Hver dag vaske celler gang med serum-frit DMEM / Hams F-12 og tilføje 1,5 ml frisk gris iPS medium.
- Til fremstilling dissocieringsbuffer tilføje 2,5% trypsin, collagenase IV (10 mg / ml), knockout serum (20%) og CaCl2 (1 mM) til Ca2 + -fri PBS. Vask cellerne to gange med PBS og inkuberes med dissocieringsbuffer i 5 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Overfør celler i en 15 ml rør, centrifugeres i 5 minutter ved 1.200 rpm (300 x g).
- Resuspendér svin iPS-celler i 500 pi frisk gris iPS medium og tilsæt 50 ul af suspensionen til 1,5 ml gris iPS medium i en frisk 6-godt med en MEF feeder-lag. Hver dag vask celler gang med serum-frit DMEM / Ham F-12 og tilføje 1,5 ml frisk gris iPS medium.
- Feeder-fri dyrkning af humane iPS-celler
- Optø den oprindelige hætteglas indeholdende præparatet basalmembranen ved 4 ° C og fortyndes med iskold serumfri DMEM / Hams F-12 til 8 mg / ml, alikvot og opbevares ved -20 ° C indtil yderligere anvendelse.
- Tø en portion af bundenling membranpræparat ved 4 ° C og fortyndes med iskold serumfri DMEM / Hams F12 (90 ug / ml). Pipetter 1 ml af denne opløsning i 3 cm dyrkningsskåle og bland forsigtigt for at sikre, at hele overfladen er dækket. Seal retter med parafilm og opbevares ved 4 ° C i op til en uge. Før anvendelse til celledyrkning inkuberes retter til 30 minutter ved 37 ° C eller 3 timer ved stuetemperatur for at tillade polymerisering af præparatet basalmembranen.
- Aspirer medium fra retter overtrukket med forberedelse basalmembranen og vaskes to gange med serumfrit DMEM / Ham F-12. Tilføj 1,5 ml E8 medium til dyrkningsskålen og humane iPS-celler (10% af cellerne i en konfluent skål). Hver dag vask celler gang med serum-frit DMEM / Hams F-12, og der tilsættes 1,5 ml frisk E8 medium.
- Passage af cellerne, skylles retter to gange med PBS, og der tilsættes 1 ml PBS / 0,5 mM EDTA. Inkubér skålene i 5 minutter ved stuetemperatur. Overvåg cellerne under et mikroskop. Bemærk: Når kolonierne begynder at runde op og appear at have huller de er klar til overførsel.
- Aspirer væsken, tilsættes 1,5 ml E8 medium og tag celler ved forsigtigt at pipettere op og ned. Overfør celler til en 15 ml rør, centrifugeres i 5 minutter ved 1.200 rpm (300 x g), resuspender i 500 pi E8 medium og der tilsættes 50 pi af suspensionen til 1,5 ml E8 medium i en frisk dyrkningsskål overtrukket med forberedelse basalmembranen .
2. Design af Target-sekvenser på tværs af arter Grænser
- Vælg en reference human, murine og porcine cDNA-sekvenser af målgener (GAPDH, NANOG, GDF3) og udføre en CLUSTAL multi-sekvenssammenligningsanalyse.
Bemærk: Dette vil indikere sekvenserne homologe på tværs af arter.- Brug følgende indstillinger til multipel alignment: hul straf (fast) 10, hul straf (varierende) 5, overgang vægtning 0, hul adskillelse straf interval 8,% identitet for forsinkelse 40, at maksimalt antal iterationer udføre 3.
- Indsend ønskede målsekvenser til producenten (se tabel of Materials) til sonde design og produktion.
Bemærk: Producenten vil derefter bekræfte kompatibilitet ønskede sekvens med teknologien. Hvis det ønskes sekvens ikke er forenelig, vil producenten foreslå alternative sekvenser.- Sikre, at homologe regioner, der kan anvendes som potentielle capture streng sekvenser har en længde på 27 bp.
Bemærk: Det er tilrådeligt at bestille flere nanopartikler med forskellige capture tråde for en valgt target gen som kun den reelle cellulære eksperiment vil give en konkret bevis for funktionaliteten af en individuel sekvens. Derfor blev to forskellige sekvenser for GAPDH og GDF3 evalueret mens tre forskellige nanopartikler blev testet for at vurdere NANOG ekspression. Deres placering og de præcise sekvenser er blevet offentliggjort andre steder 17. Producenten kommercielt fremstiller nanopartikler med ønskede sekvenser og giver dem i lyofiliseret form.
- Sikre, at homologe regioner, der kan anvendes som potentielle capture streng sekvenser har en længde på 27 bp.
3. Rekonstituering af Nanopartikler og Tilføjelse til Cell Cultures
- Opbevar frysetørrede nanopartikler ved modtagelsen ved 4 ° C i mørke.
- Rekonstruere nanopartikler ved tilsætning af 50 pi dobbelt destilleret vand, som giver en slutkoncentration på 100 nM. Når rekonstitueret butik nanopartikler ved RT i mørke. Bemærk: Under denne betingelse, at de er stabile i mindst et år. Opbevaring af rekonstituerede prøver ved 4 ° C kan påvirke deres stabilitet.
- Pre-fortyndet nanopartikel stamopløsning blandes med PBS til en koncentration på 2 (HEK 293-celler) eller 8 nM (IPS og ES-celler) på dagen for anvendelse. Bemærk: Denne koncentration er 20 gange højere end den endelige koncentration i dyrkningsskålen. I ES-celler og IP-celler, 400 pM af nanopartikler inducerede en fluorescerende signal let kan påvises under mikroskop. For HEK 293-celler, aconcentration af 100 pM er tilstrækkelig.
- Pipette 12.5 pi forfortyndet nanopartikler til en 24-brønd indeholdende 237,5 ul komplet celledyrkningsmedium. For brønde i forskellige størrelser, justere volumen i overensstemmelse hermed. Swirl pladen omhyggeligt for at sikre en ligelig fordeling af nanopartikler. Inkuber cellerne natten over (O / N) ved 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig atmosfære.
- Den næste dag analysere cellekulturer til genspecifikke Cy3 fluorescens med en excitationsbølgelængde på 546 nm (emission 575 - 640 nm) under et fluorescensmikroskop. Bemærk: Det tidsrum, der kræves for at opnå en tilstrækkelig stærk fluorescens kan afhænge af celletypen og målgenet. I disse eksperimenter var dette ses mellem 16 og 20 timer efter anvendelse af sonden.
4. Identifikation af Cy3 Positive Cell Populationer ved flowcytometri
- Grow HEK 293 eller murine ES-celler ved hjælp af betingelserne i afsnit 1.1 eller 1.3, respectively. En dag forud for FACS-analyse tilføje GAPDH-specifikke nanopartikler ved forskellige koncentrationer til HEK 293 celler (se figur 6A) og ved 400 pM for murine ES-celler. Inkubér cellerne O / N ved 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig atmosfære.
- Analyser cellekulturer til genspecifikke Cy3-induceret fluorescens under et fluorescensmikroskop.
- Frigør HEK 293 celler, som angivet under punkt 1.1.2. Centrifuge, overføres til et 1,5 ml rør og resuspender i 200 pi iskold PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA (FACS buffer). Hold celler mørke på is indtil flowcytometrisk analyse.
- Frigør murine ES-celler, som angivet under punkt 1.3.3. Centrifuge, overføres til et 1,5 ml rør og resuspender i 200 pi iskold PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA. Hold celler mørke på is indtil flowcytometrisk analyse.
- Tryk cellerne gennem en 30 um filter for at forhindre celleaggregering og tilføj propidiumiodid (2 ug / ml slutkoncentration) 2 minforud for FACS-analyse for at udelukke døde celler.
- For at analysere Cy3-positive celler først sat hierarkiske porte på FSC-A / SSC-A delmængde, FSC-H / FSC-W-delmængde og SSC-H / SSC-W delmængde. Brug fremad og sidespredning at udelukke cellerester, og celler, der ikke er spredt. Udelukker døde celler ved deres propidiumiodidfarvning visning PE mod PE-Texas Red. Foretage den afsluttende sortering gate på Cy3-PE-positive celler (figur 4).
Representative Results
I et første forsøg på at undersøge og fastslå den intracellulære påvisning af specifik genekspression i levende celler ved hjælp af nanopartikler besluttede vi at gennemføre pilotforsøg ved hjælp af et konstitutivt udtrykt hus-holder gen (GAPDH) i human HEK 293 celler. Koncentrationen af nanopartikler, der anvendes i disse eksperimenter blev valgt i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Tilføjelsen af en GAPDH-specifik probe til dyrkningsmediet ved en 100 pM slutkoncentration inducerede en klar Cy3-fluorescens i disse celler, som var synlige under et fluorescensmikroskop efter O / N inkubation (figur 5A). To kontroller blev inkluderet i disse forsøg for at underbygge resultatet. En kontrol består af en såkaldt "scramble" nanopartikel, hvor reporter-strengen ikke har et matchende sekvens i mammale eller eukaryote celler. Den "scramble" nanopartikel bestemmer uspecifik baggrund fluorescence på grund af mulig probenedbrydning eller ufuldstændig quenching af fluorescens. Tilsætningen af scramble probe fremstillet en marginal fluorescerende signal, som er ubetydelig (figur 5B). En permanent fluorescerende "optagelse" kontrol med til at bestemme cellernes evne til at optage nanopartikler ved endocytose, som kan variere mellem forskellige celletyper. Disse positive kontrol partikler produceret en lys fluorescerende signal i HEK 293-celler (figur 5C). Således blev gennemførligheden af teknologien for at optage en bestemt fluorescerende signal af en intracellulær gen med en ubetydelig baggrundssignal bekræftet. Det skal nævnes, at forskellen mellem baggrundssignalet og specifik fluorescens falder med tiden. Baggrunden, øges på grund af sonde nedbrydning eller ufuldstændig quenching, mens den specifikke fluorescens svinder gradvist (figur 5D). De samme GAPDH -specifikke nanopartikler harblevet testet i primære fibroblastkulturer af murine, svin og får oprindelse 17. Disse celler producerer en meget højere baggrundssignal end HEK 293 celler, mens den målspecifikke fluorescens er temmelig svag, muligvis på grund af den relativt lave proliferative kapacitet i disse kulturer.
Disse pilotforsøg fik os til at bruge denne teknologi til påvisning af pluripotens genekspression i iPS afledt af forskellige arter. Til dette formål NANOG og GDF3 blev analyseret, som begge er kendt for at blive udtrykt i pluripotente celler 18. Ved første iPS celler afledt af hale-spids fibroblaster af en Nkx2.5 cardiac enhancer transgene mus linie 19 blev undersøgt. For begge gener et stærkt fluorescenssignal blev opnået (figur 6A) og en ubetydelig Cy3-fluorescens af scramble kontrollen (data ikke vist). Lignende resultater blev opnået på de menneskelige og svin iPS-celler (figur 6B og C). Det er vigtigt, blev fluorescenssignalet begrænset til IPS kolonier og ikke mærke de fibroblaster, der anvendes som et fødelag for mus og svin BPS (se pile i figur 6A og C). Analysen af NANOG genekspression afslørede også, at ikke alle sekvens forudsagt i silico at være "god" til sidst er funktionel. En af tre udformninger af en NANOG-specifikke nanopartikler inducerede næsten ingen fluorescerende signal sammenlignes med den scramble kontrol trods en 100% sekvensidentitet match i murine celler iPS (figur 6D). Et lignende resultat blev opnået på iPS celler af human og porcin oprindelse med denne probe (data ikke vist). Således kan nanopartikler anvendes til at påvise pluripotens genekspression tværs af arter grænser, mens funktionaliteten af hver eneste designet probe skal vurderes på forhånd.
De lovende resultater af in situmærkning af levende celler i cellekultur retter fik os til at analysere genekspression kvantitativt ved flowcytometri. Med henblik herpå GAPDH-specifikke nanopartikler blev tilsat ved graduerede koncentrationer for at HEK 293 monolag med henblik på at sammenligne mærkningen effektivitet inden målcellepopulationen. Som vurderet ved fluorescensmikroskopi en forbedret Cy3-induceret fluorescens blev set med den laveste koncentration sammenlignet med celler, som ikke modtager nanopartiklerne. Stigende koncentrationer af nanopartikler inducerede en koncentrationsafhængig klart fluorescens af HEK 293-celler in situ (figur 7A). Underkaste disse celler til en flowcytometrisk analyse bekræftede koncentrationsafhængig mærkningseffekt. Hyppigheden af Cy3-positive celler steg betydeligt (mere end syv gange), når den højeste koncentration af nanopartikler blev anvendt (figur 7B). I yderligere eksperimenter ES-celler fra Nkx2.5 cardiacenhancer transgene mus linie 19 blev anvendt til at analysere ekspressionen af gener pluripotens ved flowcytometri. Pilotforsøg med 400 pM af den positive optagelse kontrol gav klart Cy3 positive levende ES kolonier under mikroskop og flowcytometri opdaget næsten 40% af Cy3 positive celler (Figur 7C). I modsætning hertil kan sammenlignes med ubehandlede celler ca. 0,1% af cellerne behandlet med scramble farvet positive (data ikke vist). Tilsvarende tilsætning af nanopartikler specifikke for GAPDH, Nanog og GDF3 inducerede en tydelig fluorescenssignal i individuelle kolonier i celledyrkningsskål. Hyppigheden af Cy3-positive celler for GAPDH som bestemt ved flowcytometri var sammenlignelig med den set for både pluripotens gener (figur 7C). Dette resultat er expectable som Nanog og GDF3 også menes at være udtrykt konstitutivt i pluripotente ES-celler. Således er disse data klart indiCate, at celler, der udtrykker et bestemt gen kan identificeres ved flowcytometrisk analyse, kvalitativt og ved deres relative mængde.
Figur 1: Skematisk repræsentation af strukturen af nanopartikler. (A) Struktur af et gen-specifik nanopartikel. (B) scramble nanopartikel (negativ kontrol). (C) Optagelse nanopartikel (positiv kontrol). Tilpasset fra Lahm et al. 17, genoptrykt med tilladelse fra Wiley.
Figur 2: Anvendelse af nanopartikler til at cellekulturer En korrekt fortyndet opløsning af nanopartikler pipetteres blot i dyrkningsmediet.. Efter O / N inkubation genspecifikke fluorescerende celler er synlige under AF luorescent mikroskop.
Figur 3:. Aktiv Optagelse af Nanopartikler af celler via Endocytose (A) Celler aktivt opsluge nanopartiklerne ved endocytose (B) Target mRNA binder til fange streng og fortrænger fluorescerende reporter..
Figur 4: Gating strategi for flowcytometri. (A) Strategi for HEK 293 celler. (B) Strategi for murine ES-celler. Data blev erhvervet ved hjælp af anordning 1 til HEK 293 celler eller enhed 2 for murine ES-celler og blev efterfølgende analyseret ved et software-værktøj (se tabel Materialer).
/53268fig5.jpg "/>
Figur 5:. Analyse af GAPDH -expression i HEK 293-celler En GAPDH -specifik nanopartikel blev tilsat til cellerne ved 100 pM (slutkoncentration) og fluorescens blev registreret efter O / N inkubation (A) GAPDH -specifik nanopartikel (B.. ) Scramble (negativ kontrol). (C) Optagelse (positiv kontrol). (D) Kinetik af scramble og optagelse kontrol. Fluorescens blev bestemt ved de angivne tidspunkter efter tilsætning af GAPDH-specifikke nanopartikler. Skalapanelerne repræsenterer 50 uM.
Figur 6:. Analyse af pluripotens genekspression i iPS Celler af forskellige arter Nanopartikler specifikt for NANOG eller GDF3 blev tilsat til cellerne ved 400 pM (endelig concentration) og fluorescens blev indspillet efter O / N inkubation. (A) Murine iPS-celler. (B) Menneskelig iPS-celler. (C) Svin iPS-celler. Pile i (A) og (C) udpeger umærket fibroblastfødelag-lagceller. (D) Fluorescens i murine celler iPS efter tilsætning af NANOG design SF3 nanopartikel. Skalapanelerne repræsenterer 50 uM.
Figur 7: Nanopartikel Labeled levende celler kan identificeres ved flowcytometri. (A) Mikroskopisk visning af Cy3 positive HEK 293-celler efter tilsætning af forskellige koncentrationer af nanopartikler. (B) Hyppigheden af Cy3-positive celler bestemmes ved flowcytometri. (C) Levende farvning af murine ES-cellekolonier og bestemmelse af hyppigheden af Cy3 positive celler. Nanopartikler blev tilsatved en slutkoncentration på 400 pM. Skalapanelerne repræsenterer 50 uM.
Discussion
Den foreliggende arbejde beskriver anvendelsen af fluorescensmærkede nanopartikler, der tillader pålidelig vurdering af intracellulær genekspression direkte i levende celler fra forskellige pattedyrarter med forskellige histogenetic oprindelse under et fluorescensmikroskop. Denne fremgangsmåde har et par fordele i forhold til andre offentliggjorte fremgangsmåder. Først og fremmest forskeren er ikke begrænset med hensyn til enten målgenet eller celletype. Alle antistof baserede detektionsmetoder er begrænset til en enkelt epitop. Selv fluorescerende molekylære beacons også kan være konstrueret til et bredt spektrum af gener, kræver denne fremgangsmåde dissociation af cellerne og efterfølgende nucleofection 15. Derimod har anvendelsen af gen-specifikke nanopartikler ikke nogen manipulation af target celle, som opsluger nanopartiklerne aktivt ved endocytose. Under den efterfølgende passage guldpartiklerne gradvist forlader cellerne og kulturen kan anvendes i downstream eksperimenter.
Alligevel teknologien også stadig har nogle begrænsninger. Nogle markører er naturligvis ikke påvises på grund af deres kulhydrat natur såsom SSEA-1 eller TRA-1-81 20. På nuværende tidspunkt, en bred vifte af nanopartikler er kommercielt tilgængelig. Disse partikler er blevet håndstestet for deres funktionalitet i cellulære eksperimenter. Formålet med det foreliggende arbejde var at designe tilpassede prober, der kan anvendes på tværs af arter grænser. Når du følger en sådan tilgang, eller når designe en sonde til et nyt target gen skal man være opmærksom på, at funktionaliteten af en i silico forudsagt sonden skal evalueres grundigt in vitro. Den NANOG-SF3 probe, som viste en 100% homologi til sekvenshomologien virkede ikke på alle, mens NANOG-SF1 med én uoverensstemmende base i murine og svin sekvens produceret en dejlig fluorescenssignal. Et andet spørgsmål refererer til effektiv optagelse af nanopartiklerne. De partikler indcellerne ved endocytose, en proces, der er påvirket af størrelsen af nanopartiklerne 21, at celletypen og differentieringsstatus 22 og det cellulære kapacitet udføre phago- og macropinocytosis 23. Den optimale koncentration for at opnå en tilfredsstillende fluorescenssignal skal testes for hver enkelt ansøgning eller cellelinie. Med henblik herpå bør det første eksperiment altid være anvendelsen af optagelsen kontrol for at vurdere foreneligheden af sonderne inden for de celletyper og dyrkningsbetingelser før man går videre til at målrette-specifik påvisning af genekspression.
Et kritisk punkt for at opnå pålidelige resultater ved anvendelsen af denne protokol til en roman cellelinje eller cellepopulation er inddragelsen af ordentlig kontrol. Den stadigt fluorescerende optagelse kontrol vil give et hint, som koncentrationer af nanopartikler vil fremkalde en tilstrækkelig fluorescerende signal i målcellepopulationen. Fluorescensen skal vurdered næste dag som signalet vil falme med tiden 17. Samtidig kapløbet kontrol uden en modpart i den eukaryote genom anvendes på en identisk koncentration skal fremkalde en ubetydelig baggrundssignal. Som et tredje kontrol er det tilrådeligt at bruge en nanopartikel specifik for en husholdning gen (f.eks GAPDH, β-Actin). Disse nanopartikler tjener som en positiv kontrol, at den fremgangsmåde kan anvendes til at påvise specifik genekspression i den valgte målcellepopulationen. Hvis disse kontroller viser sig tilfredsstillende, man kan forvente at opnå pålidelige specifikke fluorescerende signaler ved hjælp af nanopartikler er specifikke for andre målgener. Koncentrationen af de anvendte nanopartikler kan også være kritisk, da de har vist sig at nedregulere målsekvensen 24. Denne effekt kræver imidlertid meget højere koncentrationer (5 nM) end koncentrationerne anvendt i eksperimenterne præsenteret her (400 pM). Ved denne koncentration af nanoflares påvirker ikke målgen mRNA eller proteinniveauer og koncentrationer så høje som 2 nM ikke forringer spredning af HEK293 og murine ES-celler 17. Desuden har en hel genom udtryk analysen ikke afsløre nogen væsentlige ændringer i genekspression 25. Derfor ved koncentrationer op til 1 nM de nanoflares bør ikke udvise nogen vigtige bivirkninger.
En meget lovende anvendelse af denne teknologi er det muligt at mærke en given cellepopulation, der er præget af et specifikt gen. For nylig har genspecifikke nanopartikler med succes blevet anvendt til selektivt at plette levende ventrikelmyocytter 26, subpopulationer af melanomceller 27, monocytter 28 og cerebellar cellekulturer 29. Sådanne fluorescens-mærket cellepopulationer kan sorteres og renses ved flowcytometri som levende celler. Inden for onkologi er det tænkeligt at isolere levende metastatiske tumorceller i dyremodellerbaseret på deres udtryk af CEA, mest værdifulde for søgningen af potentielle metastaser fremme gener eller target strukturer. Vi har for nylig vist, at virkelig omprogrammeres murine iPS kolonier kan identificeres in situ med NANOG-specifikke nanopartikler baseret på den detekterede fluorescensintensitet 17. Derfor kunne identificere virkelig omprogrammerede iPS kolonier udføres på højt throughput platforme, som bruger robot fluorescenspåvisning og plukke enheder til at identificere de mest lovende kolonier. Denne teknologi synes at være egnet i mange forskningsområder for at vælge specifikke cellulære subpopulationer og det synes muligt at anvende nanopartikler i høje gennemløb platforme. Afslutningsvis denne protokol udgør en ny tilgang ved hjælp af fluorescens mærkede nanopartikler, som muliggør påvisning af intracellulær genekspression direkte i levende celler. Denne teknologi kan være et værdifuldt værktøj til at rense, udvide og yderligere karakterize sjældne cellulære subpopulationer i mange forskningsområder.
Disclosures
HL har modtaget nanopartiklerne fra EMD Millipore Corporation gratis. Alle andre forfattere har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
| Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
| Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
| DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
| Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
| MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
| 0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
| Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
| Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
| E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
| EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
| SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
| HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
| Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
| Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
| BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
| Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
| FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).
- Liao, J., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).
- Luo, J., et al. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).
- Bao, L., et al. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).
- Esteban, M. A., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig. J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).
- Maekawa, M., et al. Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1. Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).
- Marti, M., et al.
- Wada, N., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts. J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).
- Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
- Singh, U., et al. Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).
- Kang, N. -Y., et al. Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1. Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).
- Ban, K. B., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).
- Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells. J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).
- Lahm, H., et al. Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species. Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).
- Clark, A. T., et al. NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).
- Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Yue, T., Zhang, X. Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles. ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).
- Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells. Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J.
- Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. Nano-flares for mRNA regulation and detection. ACS Nano. 3 (8), (2009).
- Weldon, D., Williams, Y., Ko, A. Cell sorting based on RNA detection in living cells using SmartFlareTM RNA detection reagents.. , EMD Millipore Application Note. Available from: http://www.emdmillipore.com/ (2013).
- Mehta, A., et al. Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes. Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).
- Seftor, E. A., et al. Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal. Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).
- Khare, S., et al. The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus. Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).
- Kratz, A., et al. Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons. Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).
