Introduction
I 2006 ble en ny tilnærming beskrevet å omprogrammere somatiske celler i en pluripotent tilstand. Etter forhåndsscreening av en rekke potensielle omprogrammering faktorer murine fibroblaster kan bli konvertert til den såkalte induserte pluripotente stamceller (IPS) ved retroviral transduksjon og overekspresjon av fire transkripsjonsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Senere denne teknikken har effektivt blitt gjengitt ved hjelp av somatiske celler av ulike pattedyrarter, inkludert mennesker 2, aper 3, rotter 4, hunder 5, sauer 6 og griser 7. I tillegg modifiseres protokoller Utelate eller erstatte potensielt onkogene transkripsjonsfaktor c- MYC er publisert 8, 9.
Uavhengig av den opprinnelige omprogrammering nærmer sanne pluripotency av voksende kolonier må bekreftes, et møysommelig og tidkrevende oppgave. En stor ulempeav de fleste av disse analysene er at de ikke kan bli utført på levende celler. Etablerte pluripotency faktorer som OCT4, SOX2, Nanog eller REX1 representere transkripsjonsfaktorer som ligger i kjernen og deres deteksjon krever fiksering av cellene før immunhistokjemi eller cellelyse for RT-PCR-analyse 10 -. 12 Deretter blir disse cellene tapt for fremtidig eksperimenter som krever gjentatte kulturer av hver koloni.
Det er således meget ønskelig en teknologi for å analysere pluripotency på levende celler. Flere metoder kan faktisk utføres direkte på levende celler ved anvendelse av antistoffer rettet mot membranbaserte antigener (f.eks. TRA-1-60, SSEA4) 12 rapporterte fluorescerende fargestoffer for å detektere alkalisk fosfatase 13 eller små molekyler som spesifikt etikett embryonale stamceller (ES) og iPS-celler 14. Imidlertid kan antistoffene likevel påvirke celler og hver method er begrenset til en enkelt pluripotency markør. Til slutt, fluorescerende molekylære beacons, dual-antisensoligonukleotider med hårnål strukturer, som tillater levende farging av celler, har blitt beskrevet 15. Selv om denne fremgangsmåten kan anvendes på mange gener, krever teknikken nucleofection av en enkelt cellesuspensjon, som ikke kan anvendes på voksende kolonier IPS.
For et par år siden genspesifikke nanopartikler har blitt beskrevet å analysere Survivin uttrykk i menneskelige SKBR3 brystkreftceller 16. Dette manuskriptet beskriver en ny innovativ tilnærming til å påvise pluripotency markører i live-ES og iPS-celler gjennom bruk av gull nanopartikkel konjugater. Disse nanopartikler består av en sentral gull partikkel med en koplet fange tråd som bærer den komplementære RNA-sekvens og en Cy3-merket reporter tråden. Det fluorescente signalet av reporter tråden ble stanset ved den sentrale gullpartikkel. I tillegg er passendenanopartikler tjene som negative og positive kontroller, henholdsvis (figur 1). For et program nanopartiklene blir bare lagt til kulturmediet (figur 2) og inn i cellene via endocytose (figur 3). Hvis target RNA uttrykkes den fortrenger rapportør tråden som deretter avgir et fluorescerende signal. Denne metoden krever ikke manipulering av målcellen og ekspresjon av målgen kan overvåkes optisk under et fluorescensmikroskop direkte i levende celler. Videre kan teknologien anvendes på hvilket som helst ønsket mål-gen over arter i tilfelle av iPS celler og således kan anvendes i mange forskjellige forskningsområder. Til slutt, analyserer flowcytometrisk tillate identifikasjon og anrikning av Cy3-positive celler.
Protocol
1. Utarbeidelse av Media, reagenser og cellekultur betingelser
- Menneskelig HEK 293 embryonale nyreceller
- Kultur HEK 293 celler (CRL-1573, ATCC) i DMEM / Hams F-12 medium supplert med 5% FCS, L-glutamin (2 mM) og penicillin (100 E / ml) / streptomycin (100 ug / ml).
- For å passasje cellene, vaskes cellene en gang med PBS, tilsett 0,05% trypsin / EDTA og inkuberes i 3 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Overfør celler i et 15 ml rør, sentrifuger i 5 minutter ved 1200 rpm (300 x g) og overføre ca. 5x10 5 celler inn i en ny T25 kulturflaske.
- Murine embryonale fibroblaster (MEFs)
- Tilsett 1 ml av en 0,1% gelatinoppløsning til individuelle 6-brønner og inkuber ved værelsestemperatur (RT) i 1 time. Aspirer flytende og oppbevares ved romtemperatur før bruk.
- MEFs kultur i DMEM supplert med 10% FCS, L-glutamin (2 mM), L-glukose (4,5 g / l), natriumpyruvat (1 mM) og penicillin (100 U /ml) / streptomycin (100 ug / ml) på gelatin-belagte 6-brønns plater.
- Fordel MEFs inn seks-brønns plater og la dem vokse til samløpet. Legg mitomycin (5 ug / ml) i 2,5 timer for å stanse celler. Aspirer medium, vaske cellene to ganger med komplett MEF medium og tilsett 3 ml MEF medium til hver 6-brønnen. Disse cellene tjene som en mater-lag for murine og svin IPS celler.
- Culture of murine ES og iPS-celler
- For å fremstille mus ES kulturmedium, supplere DMEM medium med 15% FCS, L-glutamin (2 mM), L-glukose (4,5 g / l), MEM ikke-essensielle aminosyrer (1x), β-merkaptoetanol (0,1 mM) og leukemi-inhiberende faktor (1,000 U / ml).
- Skyll 6-brønner med vekst-arrestert MEFs en gang med serumfritt DMEM, tilsett 2 ml mus ES medium og murine iPS celler (20% av cellene til et konfluent tallerken). Hver dag vaske cellene gang med serum-free DMEM og tilsett 2 ml frisk muse ES middels.
- Å passasje cellene, vask hver brønn gang med serum-free DMEM, tilsett 00,25% trypsin / EDTA og inkuberes i 3 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Overfør celler i et 15 ml rør, sentrifuger i 5 minutter ved 1200 rpm (300 x g), Resuspender celler i 500 ul mus ES medium og tilsett 100 ul av suspensjonen til 2 ml muse ES medium i en frisk 6-brønn med en MEF mater-lag.
- Culture of pig iPS-celler
- For å fremstille gris IPS medium, supplere DMEM / Hams F-12 medium med 20% knockout serum, L-glutamin (2 mM), MEM ikke-essensielle aminosyrer (1x), β-merkaptoetanol (0,1 mM) og penicillin (100 U / ml) / streptomycin (100 ug / ml). Filtrer gjennom et 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C i 2 til 3 uker. Ved første gangs bruk, legge bFGF (10 ng / ml endelig konsentrasjon).
- Skyll 6-brønner med vekst-arrestert MEFs en gang med serumfritt DMEM / Hams F-12 og tilsett 1,5 ml gris IPS medium og svin iPS celler (10% av cellene i et konfluent tallerken). Hver dag vaske cellene gang med serum-free DMEM / Hams F-12 og legge 1,5 ml fersk gris iPS middels.
- For å fremstille dissosiasjon buffer legge til 2,5% trypsin, kollagenase IV (10 mg / ml), knockout serum (20%) og CaCl2 (1 mM) for å Ca 2 + -fri PBS. Vask cellene to ganger med PBS og inkuberes med dissosiasjon buffer i 5 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Overfør celler i et 15 ml rør, sentrifuger i 5 minutter ved 1200 rpm (300 x g).
- Suspender svin iPS-celler i 500 mL frisk gris iPS medium og tilsett 50 mL av suspensjonen til 1,5 ml gris iPS medium i en fersk 6-brønnen med en MEF mater-lag. Hver dag vaske cellene gang med serum-free DMEM / Hams F-12 og legge 1,5 ml fersk gris iPS medium.
- Feeder-fri kultur av menneskelige iPS-celler
- Tine den opprinnelige hetteglasset med basalmembran forberedelse ved 4 ° C og spe med iskald serum-free DMEM / Hams F-12 til 8 mg / ml, delmengde og oppbevar ved -20 ° C inntil videre bruk.
- Tine en delmengde av basenment membranpreparat ved 4 ° C og fortynnet med iskald serumfritt DMEM / Hams F12 (90 ug / ml). Pipetter 1 ml av denne løsningen i 3 cm kulturskåler og virvles forsiktig for å sikre at hele overflaten er dekket. Forsegle retter med parafilm og oppbevares ved 4 ° C i opptil en uke. Før bruk for cellekultur inkuberes retter til 30 minutter ved 37 ° C eller 3 timer ved romtemperatur for å tillate polymerisering av basalmembran preparatet.
- Aspirer medium fra retter belagt med basalmembranen preparatet og vask to ganger med serumfritt DMEM / Hams F-12. Tilsett 1,5 ml E8 medium til dyrkningsskålen og humane iPS celler (10% av cellene til et konfluent tallerken). Hver dag vaske cellene gang med serum-free DMEM / Hams F-12 og tilsett 1,5 ml frisk E8 medium.
- Å passasje cellene, skyll retter to ganger med PBS og tilsett 1 ml PBS / 0,5 mM EDTA. Inkuber oppvasken i 5 min ved RT. Overvåke cellene under et mikroskop. Merk: Når koloniene begynner å runde opp og appear å ha hull de er klare for overføring.
- Aspirer væsken, tilsett 1,5 ml E8 medium og løsne cellene ved forsiktig pipettering opp og ned. Overføre celler til et 15 ml rør, sentrifuger i 5 minutter ved 1200 rpm (300 x g), resuspender i 500 mL E8 medium og tilsett 50 pl av suspensjonen til 1,5 ml E8 medium i et friskt kulturskål belagt med basalmembran fremstillingen .
2. Design av Target-sekvenser på tvers av arter Borders
- Velg henvisning menneske, mus og svin cDNA sekvenser av målet gener (GAPDH, Nanog, GDF3) og utføre en Clustal flersekvenssammenstilling analyse.
Merk: Dette vil indikere sekvensene homolog mellom arter.- Bruk følgende innstillinger for flere oppstilling: gap straff (fast) 10, gap straff (varierende) 5, overgang vekting 0, gap separasjon straff spekter 8% identitet for forsinkelse 40, til maks antall gjentakelser utføre tre.
- Send inn ønskede målsekvenser til produsenten (se tabell for material) for probe design og produksjon.
Merk: Produsenten vil da bekrefte kompatibilitet ønsket sekvens med teknologien. Hvis ønskelig sekvensen ikke er kompatibel, vil produsenten foreslå alternative sekvenser.- Sikre at homologe områder som kan brukes som potensielle fangst tråd sekvenser har en lengde på 27 bp.
Merk: Det er lurt å bestille flere nanopartikler med ulike fangst tråder for en valgt målgen som bare realmobil eksperimentet vil gi et klart bevis på funksjonaliteten til en individuell sekvens. Derfor ble to ulike sekvenser for GAPDH og GDF3 evaluert mens tre ulike nanopartikler ble testet for å evaluere Nanog uttrykk. Deres plassering og den eksakte sekvenser er publisert andre steder 17. Produsenten kommersielt produserer nanopartikler med ønskede sekvenser og gir dem i frysetørket format.
- Sikre at homologe områder som kan brukes som potensielle fangst tråd sekvenser har en lengde på 27 bp.
3. Tilberedning av Nanopartikler og Tillegg til cellekulturer
- Oppbevar frysetørkede nanopartikler ved mottak ved 4 ° C i mørket.
- Rekonstituer nanopartikler ved tilsetning av 50 ul dobbeltdestillert vann, som gir en sluttkonsentrasjon på 100 nM. Etter rekonstituering butikknanopartikler ved RT i mørket. Merk: I denne tilstanden er de stabile i minst ett år. Oppbevaring av rekonstituert prøver ved 4 ° C kan påvirke deres stabilitet.
- Pre-nanopartikkel fortynne stamløsning med PBS til en konsentrasjon på 2 (HEK 293 celler) eller 8 nM (IPS og ES-celler) på dag etter påføring. Merk: Denne konsentrasjonen er 20 ganger høyere enn den endelige konsentrasjonen i dyrkningsskålen. I ES-celler og iPS-celler, 400 pM av nanopartikler indusert et fluorescerende signal lett synlig under mikroskopet. For HEK 293 celler, aconcentration på 100 pM er tilstrekkelig.
- Pipetter 12,5 ul av prediluted nanopartikler til en 24-brønn inneholdende 237,5 ul fullstendig cellekulturmedium. For brønner med forskjellige størrelser, justerer mengdene tilsvarende. Virvle plate nøye for å sikre lik fordeling av nanopartikler. Cellene inkuberes over natten (O / N) ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig atmosfære.
- Den neste dag analysere cellekulturer for genspesifikke Cy3 fluorescens med en eksitasjonsbølgelengde på 546 nm (emisjon 575 - 640 nm) under et fluorescensmikroskop. Merk: Den tid som kreves for å oppnå en tilstrekkelig sterk fluorescens kan avhenge av celletype og målgenet. I disse eksperimentene, ble dette sett på mellom 16 og 20 timer etter påføringen av sonden.
4. Identifisering av Cy3 Positive celle populasjoner ved flowcytometri
- Grow HEK 293 eller murine ES-celler ved hjelp av de vilkår som er angitt i avsnitt 1.1 eller 1.3, respectively. En dag før FACS-analyse legge GAPDH-spesifikke nanopartikler ved forskjellige konsentrasjoner i HEK 293 celler (se figur 6A) og ved 400 pM overfor murine ES-celler. Cellene inkuberes O / N ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig atmosfære.
- Analyser cellekulturer for genspesifikke Cy3-induserte fluorescens under et fluorescensmikroskop.
- Løsne HEK 293 celler som er spesifisert under punkt 1.1.2. Sentrifuger, overføre til et 1,5 ml rør og resuspender i 200 mL iskald PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA (FACS-buffer). Hold celler mørke på is inntil flowcytometrisk analyse.
- Løsne murine ES-celler som er spesifisert under punkt 1.3.3. Sentrifuger, overføre til et 1,5 ml rør og resuspender i 200 mL iskald PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA. Hold celler mørke på is inntil flowcytometrisk analyse.
- Trykk cellene gjennom et 30 um filter for å forhindre celle-aggregering og tilsett propidiumjodid (2 ug / ml endelig konsentrasjon) 2 minfør FACS-analyse for å ekskludere døde celler.
- Å analysere Cy3-positive celler først sette hierarkiske portene på FSC-A / SSC-A undergruppe, FSC-H / FSC-W-undergruppe og SSC-H / SSC-W undergruppe. Bruk fremover og siden scatter å utelukke cellerester og celler som ikke er spredt. Utelukke døde celler ved deres propidiumjodidfarging viser PE mot PE-Texas Red. Utføre den endelige slags gate på Cy3-PE positive celler (figur 4).
Representative Results
I et første forsøk på å kontrollere og fastslå den intracellulære påvisning av spesifikk genekspresjon i levende celler ved hjelp av nanopartikler har vi besluttet å gjennomføre pilotforsøk ved hjelp av en konstitutivt uttrykt vaktmester genet (GAPDH) i menneskelig HEK 293 celler. Konsentrasjonen av nanopartikler som brukes i disse forsøkene ble valgt i henhold til anbefalingen fra produsenten. Tilsetningen av et GAPDH-spesifikke probe til kulturmediet på en 100 pM endelig konsentrasjon induserte en entydig Cy3-fluorescens i disse cellene som var synlige under et fluorescens mikroskop etter O / N inkubasjon (figur 5A). To kontroller ble inkludert i disse forsøkene for å underbygge resultatet. En kontroll består av en såkalt "rykke" nanopartikkel der reporteren tråden ikke har en tilsvarende sekvens i pattedyr eller eukaryote celler. Den "rykke" nanopartikkel bestemmer uspesifikke bakgrunn fluorescence på grunn av mulig nedbrytning probe eller ufullstendig slukking av fluorescensen. Tilsetningen av krafse probe produsert kun marginale fluorescerende signal, noe som er neglisjerbart (figur 5B). En permanent fluorescerende "opptak" kontroll bidrar til å bestemme evnen av celler for å inkorporere de nanopartikler ved endocytose, som kan variere mellom ulike celletyper. Disse positive kontroll partikler produsert et sterkt fluorescerende signal i HEK 293 celler (figur 5C). Således ble gjennomførbarheten av teknologi for å registrere en bestemt fluorescente signalet fra en intracellulær gen med en ubetydelig bakgrunn signal bekreftet. Det må nevnes at forskjellen mellom bakgrunnssignalet og den spesifikke fluorescens avtar over tid. Bakgrunns øker på grunn av sondere nedbrytning eller ufullstendig slukke mens spesifikk fluorescens tones gradvis (Figur 5D). De samme GAPDH-spesifikke nanopartikler harblitt testet i grunnskolen fibroblast kulturer av muse, svin og sau opprinnelse 17. Disse cellene produsere en mye høyere enn bakgrunnssignalet HEK 293 celler, mens target-spesifikke fluorescens er ganske svak, muligens på grunn av den relativt lave proliferative kapasitet på disse kulturene.
Disse pilotforsøk bedt oss om å bruke denne teknologien for påvisning av pluripotency genuttrykk i iPS avledet fra forskjellige arter. For dette formål Nanog og GDF3 ble analysert, som begge er kjent for å uttrykkes i pluripotente celler 18. Ved første iPS celler avledet fra tail-tip fibroblaster av en Nkx2.5 hjerte Enhancer transgen muse linje 19 ble undersøkt. For begge genene et sterkt fluorescerende signal ble erholdt (figur 6A) og et ubetydelig Cy3-fluorescens av krafse kontrollen (data ikke vist). Lignende resultater ble oppnådd på menneskelige og svin iPS-celler (Figur 6B og C). Viktigere, ble fluorescenssignalet begrenset til IPS koloniene og ikke merke fibroblaster som brukes som et matesjikt for mus og svin IPS (se pilene på figur 6A og C). Analysen av Nanog genuttrykk også avdekket at ikke hver sekvens spådd i silico å være "god" endelig er funksjonell. Ett av tre utførelser av en Nanog-spesifikke nanopartikler forårsaket nesten ingen fluorescerende signal som kan sammenlignes med den krafse kontroll til tross for en 100% sekvens kamp i murine iPS celler (figur 6D). Et tilsvarende resultat ble oppnådd på iPS celler av human opprinnelse og porcin med denne probe (data ikke vist). Således kan nanopartikler kan brukes til å detektere pluripotency genekspresjon på tvers av arter grenser, mens funksjonaliteten til hver enkelt utformet for proben må vurderes på forhånd.
De lovende resultatene av in situmerking av levende celler i cellekulturskåler blir bedt om å analysere genekspresjon kvantitativt ved strømningscytometri. For dette formål GAPDH-spesifikke nanopartikler ble tilsatt i graderte konsentrasjoner til HEK 293 monolag for å sammenligne effektiviteten av merking i den målcellepopulasjon. Som vurderes av fluorescerende mikros en forbedret Cy3-indusert fluorescens ble sett med lavest konsentrasjon sammenlignet med celler som ikke mottar nanopartikler. Økende konsentrasjoner av nanopartikler induserte en tydelig konsentrasjonsavhengig fluorescensen til HEK-293-celler in situ (figur 7A). Utsette disse cellene til en strømningscytometrisk analyse bekreftet den konsentrasjonsavhengige merking effektivitet. Hyppigheten av Cy3 positive celler økt betydelig (mer enn syv ganger) ved den høyeste konsentrasjonen av nanopartikler ble anvendt (figur 7B). I ytterligere eksperimenter ES-celler fra Nkx2.5 hjerteenhancer transgen mus ledning 19 ble brukt til å analysere ekspresjonen av gener pluripotency ved strømningscytometri. Pilot eksperimenter med 400 pM av den positive kontrollen opptaket ga tydelig Cy3 positive førende ES-kolonier under mikroskopet og flowcytometri påvises nesten 40% av Cy3-positive celler (figur 7C). I motsetning til dette kan sammenlignes med ubehandlede celler omtrent 0,1% av celler behandlet med krafse farget positive (data ikke vist). Likeledes kan tilsetningen av nanopartikler som er spesifikke for GAPDH, Nanog og Gdf3 induserte en tydelig fluorescens signal i individuelle kolonier i cellekulturskål. Hyppigheten av Cy3 positive celler for GAPDH som bestemt ved strømningscytometri var sammenlignbart med det som ses for begge pluripotency gener (figur 7C). Dette resultatet er expectable som Nanog og Gdf3 er også antatt å bli uttrykt konstitutivt i pluripotente ES-celler. Dermed disse data klart indicate at celler som uttrykker et bestemt gen, kan identifiseres ved strømningscytometrisk analyse, kvalitativt og ved deres relative mengde.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av strukturen av nanopartikler. (A) Oppbygging av et gen-spesifikke nanopartikkel. (B) Scramble nanopartikkel (negativ kontroll). (C) Opptak nanopartikkel (positiv kontroll). Tilpasset fra Lahm et al. 17, gjengitt med tillatelse fra Wiley.
Figur 2: Anvendelse av nanopartikler til cellekulturer Et riktig fortynnet oppløsning av nanopartikler blir pipettert bare i dyrkningsmediet.. Etter at O / N ruge genspesifikke fluorescerende celler er synlig under af luorescent mikroskop.
Figur 3:. Aktivt opptak av nanopartikler av celler via Endocytose (A) Cells aktivt sluke nanopartikler ved endocytose (B) Target mRNA binder seg til fangst strand og fortrenger den fluorescerende reporter..
Figur 4: gating Strategi for flowcytometrisystemer. (A) Strategi for HEK 293 celler. (B) Strategi for murine ES-celler. Data ble anskaffet ved hjelp av enheten 1 for HEK 293 celler eller enhet 2 for murine ES-celler og ble deretter analysert av et verktøy (se tabell for material).
/53268fig5.jpg "/>
Fig. 5: Analyse av GAPDH-ekspresjon i HEK 293 celler En GAPDH-spesifikke nanopartikler ble tilsatt til cellene ved 100 pM (sluttkonsentrasjon) og fluorescens ble målt etter O / N inkubasjon (A) GAPDH -spesifikk nanopartikler (B.. ) scramble (negativ kontroll). (C) Opptak (positiv kontroll). (D) Kinetics of krafse og opptak kontroll. Fluorescens ble bestemt ved de indikerte tidspunkter etter tilsetning av GAPDH-spesifikke nanopartikler. Skala barer representerer 50 mikrometer.
Fig. 6: Analyse av pluripotency Gene Expression IPS Celler av forskjellige arter Nanopartikler som er spesifikke for Nanog eller GDF3 ble tilsatt til cellene ved 400 pM (slutt concentration) og fluorescens ble registrert etter O / N inkubasjon. (A) murine iPS-celler. (B) Menneskelig iPS-celler. (C) Svine iPS-celler. Piler i (A) og (C) betegner umerket fibroblast mater lags-celler. (D) Fluorescens in murine iPS-celler etter tilsetning av Nanog-utforming SF3 nanopartikkel. Skala barer representerer 50 mikrometer.
Figur 7: Nanopartikkel Merket levende celler kan identifiseres ved flowcytometrisystemer. (A) Mikroskopisk riss av Cy3 positive HEK 293 celler etter tilsetning av forskjellige konsentrasjoner av nanopartikler. (B) Frekvens av Cy3-positive celler bestemt ved strømningscytometri. (C) Direkte farging av murine ES-cellekolonier og bestemmelse av frekvensen av Cy3 positive celler. Nanopartikler ble lagtved en sluttkonsentrasjon på 400 pM. Skala barer representerer 50 mikrometer.
Discussion
Foreliggende arbeid beskriver bruk av fluorescens-merket nanopartikler som tillater pålitelig vurdering av intracellulær genekspresjon direkte på levende celler fra forskjellige pattedyrarter med forskjellige histogenetic sted under et fluorescensmikroskop. Denne metoden har noen fordeler i forhold til andre publiserte metoder. Først av alt forskeren er ikke begrenset med hensyn til enten mål-genet eller celletype. Alle antistoffbaserte deteksjonsmetoder er begrenset til en enkelt epitop. Selv fluorescerende molekylære beacons kan også være utformet for et bredt spektrum av gener, krever denne metoden dissosiasjon av celler og påfølgende nucleofection 15. I motsetning til dette, gjør bruk av genspesifikke nanopartikler ikke krever noen manipulering av målcellen som omslutter nanopartikler aktivt ved endocytose. I løpet av påfølgende aging gullpartiklene gradvis forlater cellene, og kulturen kan brukes i seg nedstrømsm eksperimenter.
Men også fortsatt har teknologien noen begrensninger. Noen markører er åpenbart ikke påvisbare på grunn av deres natur, for eksempel karbohydrat SSEA-1 eller TRA-1-81 20. I dag er et stort utvalg av nanopartikler er kommersielt tilgjengelige. Disse partiklene har blitt testet for deres funksjonalitet i mobilnettet eksperimenter. Målet med dette arbeidet var å designe skreddersydde sonder som kan brukes på tvers av artsgrensene. Når du følger en slik tilnærming eller når du utformer en sonde for en roman målgen man må være klar over at funksjonaliteten til en in silico spådd probe må bli grundig evaluert in vitro. Den Nanog-SF3 sonde som viste en 100% homologi til sekvenshomologien fungerte ikke i det hele tatt mens Nanog-SF1 med ett feilaktige base i murine og svin sekvens produsert en hyggelig fluorescens signal. Et annet spørsmål refererer til effektivt opptak av nanopartiklene. Partiklene angicellene ved endocytose, en prosess som er påvirket av størrelsen av nanopartikler 21, til den celletype og differensiering status 22 og den cellulære evne utføre phago- og macropinocytosis 23. Den optimale konsentrasjon for å oppnå en tilfredsstillende fluorescens-signal og må derfor kontrolleres for hver enkelt applikasjon, eller cellelinje. For dette formål bør den første eksperimentet alltid være anvendelsen av opptaks kontrollen for å evaluere kompatibilitet av sondene i de celletyper og dyrkningsbetingelser før går videre for å målrette-spesifikk påvisning av genekspresjon.
Et kritisk punkt for å få pålitelige resultater når du søker denne protokollen til en ny cellelinje eller cellepopulasjon er inkluderingen av riktige kontroller. Den stadig fluorescerende opptak kontroll vil gi en antydning hvilke konsentrasjoner av nanopartikler vil indusere en tilstrekkelig fluorescerende signal i mål-cellepopulasjon. Fluorescens må vurdered neste dag som signalet vil blekne med tiden 17. Samtidig krafse kontroll uten en motpart i den eukaryote genomet påført på en identisk konsentrasjon må indusere en minimal bakgrunnssignal. Som en tredje kontroll det er tilrådelig å bruke en nanopartikkel som er spesifikt for et husholdningsgenet (f.eks GAPDH, β-aktin). Disse nanopartikler tjene som en positiv kontroll at tilnærmingen kan brukes for å påvise spesifikk genekspresjon i valgt målcellepopulasjon. Hvis disse kontrollene vise seg tilfredsstillende man kan forvente å få pålitelige spesifikke fluorescerende signaler ved hjelp av nanopartikler som er spesifikke for andre mål gener. Konsentrasjonen av de anvendte nanopartikler kan også være viktig som de har vist seg å nedregulerer målsekvensen 24. Dette krever imidlertid effekten mye høyere konsentrasjoner (5 nM) enn de konsentrasjoner som anvendes i forsøkene er presentert her (400 pM). Ved denne konsentrasjonen av nanoflares påvirker ikke målgenet mRNA eller proteinnivåer og konsentrasjoner så høye som 2 nM ikke påvirker spredning av HEK293 og murine ES-celler 17. I tillegg gjorde en hel genom uttrykk analyse avdekket ingen vesentlige endringer i genuttrykk 25. Derfor ved konsentrasjoner opp til 1 nM de nanoflares bør ikke viser noen viktige bivirkninger.
En meget lovende anvendelse av denne teknologi er det mulig å merke en gitt cellepopulasjon som er markert med et bestemt gen. Nylig har genspesifikke nanopartikler med hell blitt brukt til å selektivt flekke levende ventrikulære myocytter 26, subpopulasjoner av melanomceller 27, monocytter 28 og cerebellar cellekulturer 29. Slike fluorescens-merkede cellepopulasjoner kan sorteres og renses ved strømningscytometri som levende celler. På området onkologi er det tenkelig å isolere levende metastatiske tumorceller i dyremodellerbasert på deres uttrykk for CEA, mest verdifulle for leting etter potensielle metastaser fremme gener eller målet strukturer. Vi har nylig vist at virkelig omprogrammeres murine iPS kolonier kan identifiseres in situ med Nanog-spesifikke nanopartikler basert på oppdaget fluorescens intensitet 17. Derfor kan identifisering av virkelig omprogrammeres iPS kolonier utføres på høy gjennomstrømning plattformer, som bruker robot fluorescensdeteksjon og plukke enheter for å identifisere de mest lovende kolonier. Denne teknologien ser ut til å være egnet i mange forskningsområder å velge bestemte cellulære subpopulasjoner og det synes mulig å bruke nanopartikler i høy gjennomstrømning plattformer. I konklusjonen, representerer denne protokollen en ny tilnærming ved hjelp av fluorescens-merket nanopartikler som gjør påvisning av intracellulære genuttrykk direkte i levende celler. Denne teknologien kan være et verdifullt verktøy for å rense, utvide og videre karakterize sjeldne cellulære subpopulasjoner i mange forskningsområder.
Disclosures
HL har fått nanopartikler fra EMD Millipore Corporation gratis. Alle andre forfattere har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
| Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
| Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
| DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
| Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
| MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
| 0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
| Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
| Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
| E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
| EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
| SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
| HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
| Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
| Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
| BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
| Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
| FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).
- Liao, J., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).
- Luo, J., et al. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).
- Bao, L., et al. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).
- Esteban, M. A., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig. J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).
- Maekawa, M., et al. Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1. Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).
- Marti, M., et al.
- Wada, N., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts. J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).
- Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
- Singh, U., et al. Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).
- Kang, N. -Y., et al. Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1. Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).
- Ban, K. B., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).
- Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells. J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).
- Lahm, H., et al. Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species. Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).
- Clark, A. T., et al. NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).
- Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Yue, T., Zhang, X. Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles. ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).
- Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells. Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J.
- Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. Nano-flares for mRNA regulation and detection. ACS Nano. 3 (8), (2009).
- Weldon, D., Williams, Y., Ko, A. Cell sorting based on RNA detection in living cells using SmartFlareTM RNA detection reagents.. , EMD Millipore Application Note. Available from: http://www.emdmillipore.com/ (2013).
- Mehta, A., et al. Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes. Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).
- Seftor, E. A., et al. Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal. Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).
- Khare, S., et al. The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus. Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).
- Kratz, A., et al. Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons. Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).
