Summary
Descriviamo un insieme di protocolli che, insieme, forniscono un bioink idrogel tessuto-mimando con le quali costrutti di tessuto 3-D funzionali e vitali possono essere bioprinted per l'utilizzo in applicazioni di screening in vitro.
Introduction
Negli ultimi anni, una varietà di tecnologie sono diventate disponibili che risponde alla necessità di fonti alternative di organi funzionali e tessuti cercando di fabbricare o biofabricate, li. Bioprinting è emerso come uno dei più promettenti di queste tecnologie. Bioprinting può essere pensato come una forma di robotica additivo fabbricazione di parti biologiche, che può essere utilizzato per costruire o modello praticabile strutture organo-simili o tessuto-come in 3 dimensioni. 1 Nella maggior parte dei casi, bioprinting impiega un 3-dimensionale (3 -D) dispositivo di stampa che è diretta da un computer per depositare cellule e biomateriali in posizioni precise, riassumendo così anatomicamente imitano architetture fisiologici. 2 Questi dispositivi stampare una "bioink", che può assumere la forma di aggregati di cellule, cellule incapsulate in idrogel o fluidi viscosi, o microcarriers cellulari testa di serie, così come i polimeri privi di cellule che forniscono struttura meccanica o agire come PLA cell-freeceholders. 3,4 A seguito del processo bioprinting, la struttura risultante può essere maturata in strutture tessuto o organo funzionale, e utilizzati per la sua applicazione finale previsto. 5,6 Fino ad oggi, un organo completo a misura d'uomo completamente funzionale non è stato stampato, ma rimane l'obiettivo principale a lungo termine della bioprinting ricerca e sviluppo. 2 Tuttavia, su piccola scala "organoide" costrutti di tessuto sono attualmente in corso di attuazione in una serie di applicazioni, tra cui la modellazione patologia, lo sviluppo di farmaci, e lo screening tossicologico.
Uno dei principali ostacoli che i ricercatori hanno incontrato nell'applicazione della tecnologia bioprinting è che ben pochi materiali sono stati sviluppati per l'esplicito scopo di bioprinting. Per avere successo in modo efficace in bioprinting, un biomateriale deve soddisfare 4 requisiti fondamentali. Il biomateriale deve avere 1) le proprietà meccaniche appropriate per consentire la deposizione (sia estrusione attraverso un ugello come un gel o un inkjet come una gocciolina), 2) la capacità di mantenere la sua forma come componente di una struttura 3-D dopo la deposizione, 3) la capacità di controllo utente delle 2 caratteristiche precedenti, e 4) ambiente amichevole e solidale una cella a tutti fasi della procedura bioprinting. 7 Storicamente, bioprinting lavoro è spesso cercato di impiegare biomateriali tradizionali esistenti in dispositivi bioprinting senza considerazione per la loro compatibilità, invece di progettare un biomateriale per avere le proprietà necessarie per bioprinting e successive applicazioni di post-stampa.
Una varietà di bioinks sono stati sviluppati di recente per migliore interfaccia con l'hardware deposizione e di fabbricazione. sistemi di idrogel standard pongono notevoli problemi perché esistono in generale sia come precursore di soluzioni fluide con insufficienti caratteristiche meccaniche, o idrogel polimerizzati che se stampati possono ostruire gli ugelli o diventano rotto sul processo di estrusione. La nostra squadra, così come OtheRS, hanno esplorato varie formulazioni idrogel per affrontare questi problemi, tra cui la stampa bioprinting sferoide cella in substrati idrogel, 5,8 cellulare e idrogel filamento di estrusione da tubi microcapillari, 9-11 estrudibili acido ialuronico (HA) idrogel nanoparticelle -Gold con proprietà di reticolazione dinamiche , 12 controllo temporale della rigidità idrogel usando fotopolimerizzabile metacrilato HA e la gelatina, 13 reticolazione a base di fibrinogeno-trombina, 14,15 a scambio ionico gel alginato-collagene, 16 e recentemente rapida polimerizzazione luce ultravioletta (UV) reticolazione iniziati con, 17
Questi esempi dimostrano la fattibilità di materiali che generano che può venire bioprinted efficace. Tuttavia, in aggiunta all'integrazione con hardware, per generare successo costrutti tissutali vitali e funzionali 3-D, biomateriali devono contenere segnali biochimici e meccanici che aiuti nel mantenimento cellularevitalità e funzionalità. Questi fattori aggiuntivi, profili biochimici e meccanici, possono avere un'influenza significativa sulla funzione di successo di costrutti di tessuto bioprinted.
Sia le cellule e la matrice extracellulare nativa (ECM) sono responsabili di presentare una vasta gamma di molecole di segnalazione come fattori di crescita e altre citochine ad altre celle. La combinazione di questi segnali varia da tessuto a tessuto, ma può essere estremamente potente e influente nella regolazione del comportamento delle cellule e dei tessuti. 18 Impiegando componenti ECM tessuto-specifici da organi diversi e attuazione come idrogel o come parte di un idrogel è stata esplorata con successo. 19-21 Questo approccio, che comprende decellularizing un determinato tessuto, polverizzazione, e dissolverla, può essere utilizzato per produrre segnali biochimici tessuto-specifici da qualsiasi tessuto e possono essere incorporati in 3-D costrutti idrogel. 22
Inoltre,è ampiamente documentato che i tessuti del corpo occupano una vasta gamma di impedenze. 23 Pertanto, la possibilità di regolare le proprietà meccaniche dei biomateriali, quali il modulo elastico E 'o tranciare modulo elastico G', è uno strumento utile in ingegneria tissutale . Come descritto sopra, il controllo bioink proprietà meccaniche consente biofabrication estrusione-basato usando gel morbido, che può poi ulteriormente manipolato da reticolazione secondaria in un momento successivo, in cui i livelli di modulo elastico possono essere raggiunti che corrisponde a quella del tipo organo bersaglio. Ad esempio, biomateriali possono essere personalizzati per abbinare una rigidità di 5-10 kPa come un fegato nativo, 23 o abbinare una rigidità di 10-15 kPa come tessuto cardiaco nativo, 24,25 in teoria aumentare la capacità di questi organoidi di funzionare in un modo simile alle loro controparti tessuto nativo. L'influenza della rigidità dell'ambiente sul fenotipo cellulare è stato explored negli ultimi anni, in particolare rispetto alle cellule staminali. Engler et al. Hanno dimostrato che l'elasticità del substrato aiutato a guidare le cellule staminali mesenchimali (MSC) verso linee con elasticità dei tessuti corrispondente a quello del substrato. 25 Questo concetto è stato ulteriormente esplorato per la differenziazione in muscolo, la funzione cardiaca, fenotipo fegato, staminali ematopoietiche proliferazione cellulare e manutenzione di potenziale terapeutico delle cellule staminali. 24,26-29 Essendo in grado di sintonizzare un idrogel di diversi moduli di elasticità è una caratteristica importante di un biomateriale che verrà utilizzato per biofabricate costrutti tissutali. 30
Qui si descrive un protocollo che rappresenta un approccio versatile utilizzato nel nostro laboratorio per formulare un sistema idrogel che può essere estruso bioprinted e personalizzata per 1) contenere il profilo biochimico di un particolare tipo di tessuto e 2) mimare il modulo elastico di tale tipo di tessuto . Affrontando questi requisiti, ci proponiamo di provide un materiale che può riassumere le caratteristiche fisico-chimiche e biologiche di in vivo tessuto. 31 Il sistema composito idrogel modulare descritta sfrutta un approccio multi-reticolazione per produrre bioinks estrudibili, e permette una reticolazione secondaria per stabilizzare e aumenta la rigidità della prodotti finali per abbinare una vasta gamma di tipi di tessuto. personalizzazione biochimica viene soddisfatta utilizzando componenti ECM tessuto-specifici. A dimostrazione, ci avvaliamo di una varietà specifica di fegato di questo sistema idrogel per Bioprint fegato funzionale costrutti organoide. Il protocollo descritto utilizza un dispositivo bioprinting 3-D personalizzato. In generale, questo protocollo può essere adattato alla maggior parte delle stampanti estrusione-based, parametri di stampa specifici variano notevolmente per ciascun tipo di dispositivo e richiedono test dall'utente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. idrogel Bioink formulazioni e Preparazione
- Al fine di fornire profili biochimici tessuto-specifici, preparare tessuto-specifica ECM digerire soluzioni come descritto in precedenza per il fegato. 20
Nota: In generale, questo ECM digest comprenderà 40% del volume bioink idrogel finale che viene impiegato. Diverse centinaia di millilitri di soluzione ECM digest possono essere preparati, aliquotati e congelati a -80 ° C per un uso futuro. - Prima di idrogel formulazione, sciogliere un fotoiniziatore, 2-idrossi-4 '- (2-idrossietossi) -2-methylpropiophenone, in acqua a 0,1% w / v.
Nota: I volumi nel range 50-100 ml possono essere preparati in anticipo e conservati al riparo dalla luce a 4 ° C per diversi mesi. - Per formare bioinks idrogel, prima sciogliere i componenti del materiale base dalla acido ialuronico (HA) Kit idrogel nella soluzione acqua-fotoiniziatore.
- Sciogliere la gelatina tiolati HA e tiolati separatamente in acqua-psoluzione hotoinitiator (passo 1,2) per rendere il 2% w / v soluzioni.
- Sciogliere polietilenglicole diacrilato (PEGDA), il reticolante nei kit idrogel, in soluzione acquosa-fotoiniziatore (passo 1.2) per rendere un 8% w / v.
- Sciogliere polietilene glicole (PEG) 8-Braccio alchino (10 kDa MW) in soluzione acquosa-fotoiniziatore (passo 1.2) per rendere un 8% w / v.
- In generale, formare idrogeli utilizzando il seguente schema, anche se la personalizzazione supplementare è possibile.
- Unire 4 parti 2% tiolati HA, 4 parti 2% di gelatina tiolati, 1 parte reticolante 1, 1 parte di reticolante 2 con 8 parti soluzione tessuto ECM e 2 parti di terreni di coltura degli epatociti (HCM) (o 10 parti di acqua come un non-tessuto generici idrogel SPECIFICI).
Nota: Altre modificato HA o gelatina possono essere aggiunti per rendere l'estrusione bioink più agevolmente. Questo è descritto di seguito.
- Unire 4 parti 2% tiolati HA, 4 parti 2% di gelatina tiolati, 1 parte reticolante 1, 1 parte di reticolante 2 con 8 parti soluzione tessuto ECM e 2 parti di terreni di coltura degli epatociti (HCM) (o 10 parti di acqua come un non-tessuto generici idrogel SPECIFICI).
- Agitare la miscela risultante in alto (velocità 10 su 10) per 10 secondi per miscelare prima dell'uso. </ Li>
- L'uso di idrogel bioink
- Per l'estrusione o il collaudo bioprinting, trasferire il composto in una cartuccia siringa o della stampante e lasciare reticolare spontaneamente per 30 minuti (fase 1 reticolazione) a 37 ° C.
- Per le misure reologiche, trasferire il composto in da 35 mm piastra di Petri e lasciare reticolare per 30 min.
Nota: La miscela comincia immediatamente reticolare tramite formazione di legami tiolo-acrilato e inizierà ad aumentare di viscosità. La miscela deve essere trasferito in una siringa, cartuccia di stampa, o posizione di destinazione entro 10 min per evitare l'intasamento di una pipetta o una siringa durante il trasferimento. - Quando reticolazione secondario (fase 2) si desidera, irradiare la fase gel 1-reticolati con la luce ultravioletta (365 nm, 18 W / cm 2) per avviare una reazione di polimerizzazione tiolo-alkyne.
Nota: durata dell'irradiazione dipende dalla superficie del materiale. In generale, un centimetro quadrato di materiale richiede solo 1-2 sec di esposizione ai raggi UV a questo potere UV.
Compatibilità 2. Stampante Test
- Prima di test di integrazione con i dispositivi bioprinting, caratteristiche di prova di estrusione in panchina laboratorio con semplici test di estrusione usando siringhe standard e piccoli suggerimenti ago calibro (20-30 gauge).
- Spingere il bioink attraverso una siringa standard per raggiungere agevolmente filamenti estrusi di idrogel con poche o nessuna urti. Estrusione di linee o modelli semplici è sufficiente a determinare il successo.
- Per l'integrazione bioprinter, caricare bioink preparati da loro pipettando in cartucce per stampanti, e consentire 30 minuti per il bioink di sottoporsi spontaneamente fase 1 di reticolazione all'interno della cartuccia.
Nota: Volume di bioink dipende dall'applicazione specifica e deve essere determinato dall'utente. Cartucce per stampanti possono assomigliare o essere siringhe che sono compatibili con il dispositivo bioprinter. - Valutare la compatibilità di estrusioneper bioprinting, stampando un motivo semplice utilizzando il bioink. Ad esempio, stampare un reticolo 7 x 7 mm composto da linee parallele. Applicare pressione (pressione pneumatica ad esempio, 20 kPa), mentre la testina di stampa si porta nel piano XY ad una velocità di circa 300 mm / min.
Nota: i diametri degli ugelli delle testine di varie dimensioni possono essere usati, ma ugelli conici con aperture di diametro 400-500 mM sono ottimali per la stampa sferoidi nell'intervallo 250-350 micron.- Se i materiali estrusi sono nodosi o irregolari, vedere il punto 2.4, o ridurre la quantità di PEGDA per ammorbidire il materiale reticolato fase 1. formulazioni bioink adeguatamente preparato estrudere senza intoppi, permettendo la deposizione precisa nei modelli o architetture desiderati.
Nota: Le procedure bioprinting uso descritto un dispositivo bioprinting 3-D progettato su misura in casa appositamente per il tessuto costruire la stampa 32 Come tale, i parametri di stampa specifici variano notevolmente per ogni tipo di dispositivo e richiedono testin.g dall'utente.
- Se i materiali estrusi sono nodosi o irregolari, vedere il punto 2.4, o ridurre la quantità di PEGDA per ammorbidire il materiale reticolato fase 1. formulazioni bioink adeguatamente preparato estrudere senza intoppi, permettendo la deposizione precisa nei modelli o architetture desiderati.
- Per migliorare le proprietà di estrusione, non modificato integrare HA e gelatina per le bioinks (1,5 mg / ml e 30 mg / ml, rispettivamente).
3. La convalida da Bioprinting con primari costrutti fegato
- Preparare 3-D sferoidi fegato cellula primaria per impiccagione metodi Drop come la componente cellulare 33
Nota: Bioprinting può essere eseguita senza sferoidi, ma con singole cellule sospese nei bioinks idrogel pure. Sferoidi sono impiegati qui per accelerare le interazioni cellula-cellula e costruire funzionalità. Il numero di sferoidi o cellule impiegate dipende dalla specifica applicazione e deve essere determinato dall'utente. Queste procedure devono essere eseguite in condizioni sterili, utilizzando materiali sterili.- Preparare HCM aggiungendo il contenuto scongelati del kit di componenti supplemento HCM ai media epatociti basale (HBM) e filtraggio sterile.
- Scongelare il supplemento componenti delle Nazioni Unitetil liquido.
- Aggiungere i componenti supplemento (acido ascorbico, 0,5 ml; albumina sierica bovina [acidi grassi liberi], 10 ml; gentamicina solfato / amfotericina B, 0,5 ml; idrocortisone 21-emisuccinato, 0,5 ml, insulina, 0,5 ml; fattore di crescita epidermico umano ricombinante , 0,5 ml, trasferire, 0,5 ml) a 500 ml HBM.
- filtro sterile attraverso un 0,45 micron o 0,22 micron filtro utilizzando un gruppo filtro bottiglia-top o un filtro di punta della siringa.
- Determinare la densità cellulare di epatociti primari umani, cellule di Kupffer e cellule stellate contando su un emocitometro dopo ogni tipo di cellula è stato scongelato in base alle istruzioni del fabbricante.
- Combinare epatociti primari umani, cellule di Kupffer e cellule stellate in un rapporto 80:10:10 in numero di cellule in mezzi HCM che è stato riscaldato a 37 ° C in una provetta conica.
Nota: Il volume del supporto da utilizzare dipende dal numero complessivo cella specifica per l'applicazione e deve essere determinata da the utente. - Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 520 xga 20 ° C.
- Aspirare il surnatante, lasciando dietro di sé il pellet.
- Risospendere il pellet di cellule in mezzi HCM per ottenere una sospensione cellulare contenente 1.000 cellule per 40 mezzi microlitri. Il volume totale dipende dal numero di sferoidi prodotta.
- Trasferire la sospensione cellulare a 96 pozzetti formato appesi piastre goccia. Aggiungere un totale di circa 1.000 cellule in ciascun pozzetto in HCM e mantenere a 37 ° C, in 5% CO 2 per 3 giorni durante i quali formano sferoidi multicellulari.
- Raccogliere sferoidi fegato dalla piastra goccia appeso con una pipetta. Trasferire in un tubo da 15 ml sterile.
- Preparare HCM aggiungendo il contenuto scongelati del kit di componenti supplemento HCM ai media epatociti basale (HBM) e filtraggio sterile.
- sferoidi fegato Bioprint a specifici fegato idrogel bioink
- Preparare una formulazione di fegato ECM contenenti idrogel bioink come descritto al punto 1, impiegando 8% PEGDA e l'8% 8-Braccio PEG alkyne come reticolanti. Utilizzare questa combinazione per la sua capacità di resulting in un idrogel vicino a taglio modulo elastico al tessuto del fegato nativo.
- Che i sferoidi depositano sul fondo della provetta conica in cui sono stati collocati nel passaggio 3.1.7. Questo varia in base alle dimensioni e alla densità sferoide, ma in genere si verifica entro 1-2 min. Rimuovere tutti i supporti con attenzione aspirando o con una pipetta.
- Trasferire il volume desiderato di soluzione di idrogel bioink preparata al momento per il tubo conico contenente sferoidi. Generalmente, un volume adeguato è del 10% -25% superiore al volume del costrutto 3-D da stampare. pipetta con cautela su e giù per risospendere sferoidi nella soluzione idrogel bioink. Trasferimento in una cartuccia bioprinter utilizzando una pipetta o una pipetta sierologica.
- All'interno della cartuccia bioprinter, lasciare che la soluzione di sottoporsi primo stadio di reticolazione (reazione tiolo-acrilato) per 30 min.
Nota: A seconda delle dimensioni sferoide, la cartuccia può essere necessario lentamente ruotato o può avere bisogno di essere miscelato con i contenutiuna spatola sterile per mantenere sferoidi distribuiti nel bioink durante la fase 1 di reticolazione. Questo è meno di una necessità per bioinks preparati con cellule sospese invece di sferoidi.
Nota: Dopo la fase 1 di reticolazione, gli utenti hanno una finestra operativa di diverse ore. Tuttavia, si raccomanda di eseguire il processo bioprinting rapidamente per migliorare la vitalità cellulare. - A seguito di fase 1 di reticolazione, utilizzare un dispositivo bioprinting per creare strutture di idrogel desiderati contenenti sferoidi fegato primari (o altre cellule).
Nota: Questa tecnologia fornisce un sistema per biofabricating un'ampia varietà di strutture. Parametri come volume totale, il numero di cellule o sferoidi, la geometria struttura stampata, e il substrato su cui sono stampati costrutti sono altamente dipendenti dagli obiettivi dell'utente. - Dopo la deposizione nella configurazione desiderata, amministrare luce UV per 2-4 secondi per avviare il meccanismo di reticolazione secondaria, stabilizzando la constructs e aumentando la rigidità al livello desiderato.
Nota: La concentrazione di PEG-alchino, e quindi la densità di reticolazione finale complessiva, controlla primariamente la rigidità costrutto finale. - Ripetere la 3.2.4 e 3.2.5 passaggi per creare costrutti multistrato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Quando le procedure sopra descritte vengono seguite correttamente, idrogel dovrebbero contenere un profilo biochimico specifico per il tipo di tessuto bersaglio, 20 permettono un elevato grado di controllo su bioprinting e modulo elastico finale, 34 e supportano cellule vitali funzionali nei costrutti tissutali.
idrogel Personalizzazione
Per meglio fegato nativo mimica, la bioink idrogel è stata completata da soluzioni ECM di fegato e di un Array Fattore di crescita, 20 soluzioni ECM contengono una vasta gamma di fattori di crescita e citochine (mostrate in pg / ml, Figura 1A). Questi includono il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), bFGF, proteina morfogenetica dell'osso 5 (BMP-5), FGF-4, proteina legante il fattore di crescita insulino-simile 2 (IGFBP-2), TGF-b1, BMP-7, EGF , FGF-7, ormone della crescita (GH), fattore di crescita EGF-like eparina-binding (HB-EGF), HGF e neurotrophin 3 (NT-3). Inoltre, le soluzioni ECM contengono componenti strutturali aggiuntivi, che vengono analizzati da test colorimetrici. 20 Per le soluzioni ECM fegato, contenuto totale di collagene di soluzioni ECM di fegato era 91.33 ± 0,58 mg / ml, il contenuto di elastina era 189,33 ± 48,40 mg / ml, e il glicosaminoglicani contenuti (GAG) è stato 86,00 ± 53,45 mg / ml (Figura 1B).
Idrogel bioink proprietà meccaniche possono essere caratterizzati utilizzando un test di stress di taglio sweep (0,6-10 Pa, frequenza di oscillazione 1 Hz) sul reometro. 10,12,13,34 Consentendo spontanea fase 1 tiolo-acrilato chimica che si verifichi a pH neutro, si forma un idrogel morbido con un G 'di 113.66 ± 22.59 Pa. Dopo l'inizio della fase 2 tiolo-alkyne reticolazione per fotopolimerizzazione UV, aumenta G 'a circa il 10 kPa (10.637 ± 113.83 Pa, Figure 1C), imitando elasticità dei tessuti del fegato. Ulteriori manipolazione delle concentrazioni, pesi molecolari, e geometrie di reticolanti può realizzare una vasta gamma di valori di fase 2 G '. 34
Qualità di idrogel bioprinted
Strategia chimica e attuazione della fase 1 e fase 2 reticolazione di bioinks idrogel sono descritti in Figura 2. In generale, reticolanti come Extralink, che sono basati su polimeri PEG acrilati, spontaneamente reagiscono con gruppi tiolici sulla HA e catene di gelatina a neutro pH (stadio 1) in presenza di cellule per formare un idrogel estrudibile morbido. Questo idrogel morbido può essere bioprinted come bioink, dopo di che la luce UV è usato per iniziare la fotopolimerizzazione di tioli non reagiti e le reticolanti secondari base di polimeri PEG alchini-modificato. I pesi molecolari particolari e geometrie dei reticolanti vannoVern la rigidità fine del costrutto bioprinted. A mm reticolo 7 x 7 è stata attuata per scopi di test (Figura 3A). I test iniziali hanno dimostrato che le formulazioni iniziali erano estrudibile, ma sono apparsi irregolare e clumped durante e dopo l'estrusione (Figura 3B). Per migliorare le proprietà di estrusione, non modificata HA e la gelatina è stata integrata ai bioinks (1,5 mg / ml e 30 mg / ml). La struttura liscia stampata migliorata è mostrato in Figura 3C.
Vitalità e funzione di base di costrutti di fegato umano primari bioprinted
Utilizzando il 3-D bioprinter il bioattivo specifica fegato bioink idrogel è stato utilizzato per incapsulare e depositare sferoidi di fegato umano primario, precedentemente preparate per impiccagione culture goccia, su vetrini di plastica. In fase di stampa su vetrini di plastica consentiti per la gestione e il trasferimento robusto per una varietà di ambienti di coltura cellulare. Dopo bioprinting, hivitalità cellulare GH nei costrutti del fegato è stato osservato dopo Live / Dead vitalità / citotossicità colorazione e microscopia confocale (Figura 4A). In condizioni ambientali ottimali vitalità deve essere superiore a 85%. epatociti umani primari sono generalmente considerati sensibili alle sollecitazioni meccaniche e chimiche, che richiedevano alcune ottimizzazioni delle variabili ambientali.
Dopo bioprinting e la verifica di fattibilità, costrutti fegato aggiuntivi che vengono inseriti nella cultura possono essere valutate per la funzionalità attraverso l'analisi dei media aliquote rimossi il giorno 3, il giorno 7, il giorno 10 e il giorno 14 per l'analisi di urea secreta e l'albumina. I saggi urea colorimetrico rivelano un livello relativamente costante della secrezione di urea da costrutti fegato nel corso di tempo di 14 giorni, rimanendo tra 15 e 20 ng / ml (Figura 4B). livelli di urea rilevate non erano significativamente differenti tra loro al tempo differentepunti. Il saggio ELISA umano Albumina rivela che la produzione di albumina dai costrutti rimane relativamente costante nel tempo, rimanendo stabile tra 125 e 140 ng / ml (Figura 4C). Inoltre, quando macchiato per i marcatori indicativi di tessuto epatico, espressione positiva di albumina intracellulare, CYP3A4 (una isoforma del citocromo P450 coinvolto il metabolismo), E-caderina (una proteina di adesione cellula-cellula epiteliale) e dipeptidil peptidasi-4 (una proteina espressa altamente nel fegato) sono osservati (Figura 4D-F). Nel loro insieme, questa vitalità e dati funzionali suggeriscono che le tessuto-specifici aiuti idrogel bioink a mantenere la vitalità e la funzione di costrutti fegato a base di cellule primarie bioprinted.
Figura 1. Hydrogel caratterizzazione dei componenti e la valutazione rigidità. A) Fattore di crescita eanalisi di citochine da parte di proteomica array di soluzioni ECM preparate dal fegato. B) colorimetrico test quantificazione del collagene, glicosaminoglicani, e il contenuto di elastina nelle soluzioni di ECM del fegato. C) Dimostrazione della capacità di controllare la rigidità bioink. Dopo la fase 1 di reticolazione, il gel è relativamente morbido e in grado di estrudere intoppi. Dopo la fase 2 reticolazione da luce UV, modulo elastico aumenta di più di un ordine di grandezza, mimano tessuto epatico modulo elastico. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. L'applicazione di più reticolanti PEG-based per l'estrusione bioprinting e il controllo di tessuto costruire proprietà meccaniche. SSTRATEGIA di formulazione di bioinks stampabili composto da reticolanti a base di acrilato (reticolante 1), reticolanti alchini-based (reticolante 2), HA tiolati, gelatina tiolati, materiali tessuti ECM, e non modificato HA e gelatina. La formulazione viene preparata bioink e reticola spontaneamente attraverso tiolo-acrilato vincolante, risultando in un materiale morbido, estrudibile. Bioprinting viene eseguita. Infine, gli strati bioprinted sono fusi, stabilizzati, e portato al fegato modulo elastico. Questo processo può essere ripetuto per generare strutture multistrato. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. test Bioprinting di bioinks. A) mm modello di avvolgimento 7 x 7 è stato utilizzato per le prove di estrusione bioinkzione nel bioprinter. B) La formulazione iniziale di un PEGDA e 8 braccio PEG bioink alkyne provocato irregolare deposizione. C) Aggiunta prime HA e la gelatina migliorata estrusione, con conseguente liscia di estrusione del bioink. Scala bar -. 1 millimetro Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. dimostrazione della vitalità e la funzione del fegato sferoidi bioprinted nel bioink idrogel specifico per il fegato. A) L'attuazione del bioink fegato per bioprinting, ha provocato costrutti alti vitalità. Verde - calceina AM-macchiato cellule vitali; Red - etidio omodimero macchiato di cellule morte B) Urea e C) di albumina secreta da costrutti del fegato oltre il 14 d.AYS nella cultura, quantificati mediante saggi colorimetrici ed Elisa, rispettivamente. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Immunocolorazione di marcatori associati al tessuto del fegato: D) CYP3A4, E) l'albumina intracellulare, e F) DPP4 ed E-caderina. Verde o rosso - indicato macchia; Blue -. DAPI Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ci sono diverse componenti che sono fondamentali per prendere in considerazione quando si cerca di biofabricate 3-D costrutti di tessuto, per l'uso eventuale negli esseri umani o per applicazioni di screening in vitro. Impiegando i componenti cellulari appropriati determina il potenziale funzionalità end, mentre il dispositivo biofabrication si determina la metodologia generale per raggiungere il costrutto finale. Il terzo componente, il biomateriale, è altrettanto importante, in quanto serve un doppio ruolo. In particolare, la componente biomateriale deve essere compatibile con l'hardware biofabrication (cioè bioprinters) e anche sostenere i componenti cellulari biologiche potenzialmente fragili. Ottimizzazione entrambi questi requisiti può essere difficile, in quanto i materiali bioprintable devono soddisfare diversi parametri chiave: 1) possedere le proprietà chimiche del caso, meccanici, e temporali per facilitare la stampa efficiente e svincolato; 2) la vitalità delle cellule di supporto durante le fasi di preparazione e bioprinProcedura ting; 3) e fornire un ambiente ospitale che meglio valorizza la vitalità delle cellule e l'eventuale funzione del tessuto costrutto dopo l'bioprinting. Impieghiamo il sistema idrogel bioink modulare descritto nella metodologia descritta qui per rispondere a queste esigenze. Innanzitutto, incorporando fattori di crescita, collageni, GAGs e elastins derivati dalla ECM di un particolare tipo di tessuto, possiamo ottenere un profilo biochimico che ricorda tipo tessuto bersaglio. In secondo luogo, impiegando 2 reazioni di reticolazione simili, ma indipendenti siamo in grado di ottenere un materiale estrudibile morbido che è compatibile con la maggior parte estrusione-based, che può essere ulteriormente modificato con la seconda fase di reticolazione per raggiungere un modulo elastico materiale determinato che soddisfa un bersaglio tessuto di scelta. 34
La caratteristica fondamentale di questo sistema che lo rende utile è la capacità di supportare reazioni chimiche multiple che possono essere sfruttate per manipolare il polymecinetiche rizzazione e le proprietà meccaniche del sistema bioink. Impiegando 2 tipi di reazione indipendenti, tiolo-acrilato e tiolo-alchini, otteniamo la capacità di eseguire una fase 1 reazione tiolo-acrilato che si traduce in un materiale morbido che può essere estruso attraverso un dispositivo a siringa o bioprinting, e un tiolo fase 2 reazione -alkyne, che è iniziata solo dopo esposizione UV in presenza di un fotoiniziatore, che determina il modulo elastico del costrutto bioprinted finale. Questi passaggi multipli determinano un materiale bioprintable. Come tale, per ottenere un bioink stabile che supporta estrusione e successiva personalizzazione modulo elastico, mantenendo questi tipi di reazione separati è importante.
Il forte progetto di utilizzare il sistema per biofabrication è la facilità di personalizzazione, che avviene attraverso sia la manipolazione fine modulo elastico attraverso il reticolante secondario, o mediante inserimento di diversi materiali ECM derivate dal tessuto o cocktail fattore di crescita. L'ECM nei tessuti contiene una varietà di fattori di crescita e altre citochine, che spesso variano distribuzione complessiva tra i tipi di tessuto. Noi crediamo che questi fattori sono parte integrante per la funzione di alcuni tipi di cellule, come epatociti umani primari mantenimento. L'attuazione di questo concetto è stato precedentemente dimostrato di aumentare la vitalità e la funzione di epatociti umani primari in eparinizzate ialuronico culture panino acido. 20 Grazie alla combinazione di catene di eparina in idrogel con fattori di crescita eparina vincolante, così come altri componenti ECM da ECM fegato, siamo stati in grado presentare questo profilo biochimico specifico fegato di epatociti umani primari, mantenendo vitalità e funzionalità in vitro per un periodo prolungato di tempo. Questo approccio può essere facilmente estesa ad altri tipi di tessuto, consentendo ai ricercatori di raggiungere ricapitolazione di questi fattori tessuto-specifiche da decellularizing e solubilizzante altri tessuti.
tenda "> Gli utenti devono essere consapevoli che, mentre i componenti di base di questo sistema bioink sono state attuate in precedenza bioprinting, 10,12,17 ma in approcci meno sfumate tessuto specifico, nonché una varietà di altre applicazioni di medicina rigenerativa, 35- 45 biofabrication non è stato tentato per tutti i tipi di tessuto. come tale, ci può essere qualche ulteriore sviluppo e risoluzione dei problemi necessarie per creare tali costrutti tissutali supplementari. Tuttavia, un sistema modulare come quello descritto qui può benissimo essere adattabile. Altri potenziali limitazioni includono affinità naturali che alcuni tipi di cellule possono avere verso biomateriali specifici. In generale, abbiamo trovato che i componenti di base di acido, la gelatina, e PEG-based ialuronico di questo supporto del sistema idrogel colture vitali di una grande varietà di tipi di cellule, ma ci possono essere alcuni tipi di cellule che svolgono meglio in ambienti ingegnerizzati di varia composizione, come il collagene, che ha una fibroso intrinseca natura, o elastina, che è per sua natura più elastica. Come tale, la considerazione per il materiale ottimale per un dato tipo di tessuto e l'applicazione finale è importante, e il sistema idrogel bioink qui descritto potrebbe non essere adeguato per tutti gli usi. Inoltre, è importante considerare le condizioni ambientali in cui viene eseguita bioprinting. Durante lo sviluppo di questo protocollo, la transizione da vicino ambiente (temperatura ambiente) le condizioni che utilizzano bioinks senza alcun supporto delle cellule, che portano a scarsa vitalità se il tempo di preparazione e stampa è stato anche tirato fuori, i protocolli a più rapide sotto 37 ° C utilizzando bioinks con una componente media, che drammaticamente aumentata vitalità cellulare.Fino a poco tempo, pochi materiali e sistemi materiali sono stati sviluppati specificamente per interfacciarsi con i sistemi bioprinting. Come risultato, la maggior parte dei materiali sono semplice, sfruttando sia le caratteristiche biologiche di sostenere cellule, o, la loro compatibilità con biofabricationhardware. Pochi materiali sono ottimali in entrambi i regni. Il sistema descritto in questa metodologia disaccoppia queste caratteristiche, consentendo la personalizzazione di caratterizzazione biologica, agevolando le proprietà meccaniche necessarie per l'estrusione bioprinting. Un'ulteriore distinzione di questo sistema idrogel bioink è che può imitare entrambi i parametri biochimici e fisici dei tessuti bersaglio viene utilizzato per biofabricating. Questo supporta un impressionante livello di flessibilità, consentendo ricapitolazione dei fattori biochimici di quasi qualsiasi tessuto, oltre a contenere il modulo elastico di qualsiasi tessuto molle. L'attenzione ad entrambi questi aspetti di un tessuto raramente sono state esplorate in tandem.
La natura modulare di questa tecnologia offre una flessibilità da attuare in un'ampia varietà di applicazioni. La capacità di imitare i vari tipi di tessuto fornisce la possibilità di biofabricate non solo costrutti del fegato utilizzato come esempio in questo lavoro, ma conle strutture che rappresentano molti degli altri tessuti del corpo. Forse la vasta applicazione più ovvia usando questi parametri è la capacità di abbinare entrambi gli aspetti di un particolare tessuto per ottimizzare la funzione fine di costrutti ingegnerizzati per applicazioni reali come l'impianto o di droga e lo screening tossicologico. Mentre la generazione di tessuti umani di dimensioni per l'impianto in pazienti è l'obiettivo finale per molti ricercatori, a causa di ostacoli normativi, approvvigionamento di cellule, e limitazioni alla capacità di fabbricare vascolare funzionale in organi di ingegneria tessutale, questo nobile obiettivo richiederà un ulteriore sviluppo e l'ora da realizzare. Tuttavia, le tecnologie come la metodologia descritta qui stanno cominciando da attuare per la generazione di "organoidi" per le piattaforme in vitro. La nostra squadra, così come gli altri, non è al momento utilizzando organoide biofabrication per creare sistemi modello in cui vengono eseguiti studi di tossicologia. Inoltre, tali organoidi possono essere impiegati perstudiare patologie e la progressione della malattia, come il cancro, 46 e testare potenziali trattamenti terapeutici. Infine, questo sistema supporta anche un altro importante uso. Manipolando questi parametri in modo indipendente, i ricercatori possono eseguire esperimenti scientifici di base per determinare l'importanza relativa di biochimica rispetto a fattori meccanici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano finanziamento da parte della Defense Threat Reduction Agency (DTRA) in Space and Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC Pacifico) contratto n N6601-13-C-2027. La pubblicazione di questo materiale non costituisce approvazione da parte del governo dei risultati o le conclusioni nel presente documento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid | Sigma | 53747 | |
| Gelatin | Sigma | G6144 | |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP) | ESI-BIO | GS315 | Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA) |
| PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa | Creative PEGWorks | PSB-887 | |
| Primary human hepatocytes | Triangle Research Labs | HUCPM6 | |
| Primary human liver stellate cells | ScienCell | 5300 | |
| Primary human Kupffer cells | Life Technologies | HUKCCS | |
| Hepatocyte Basal Media (HBM) | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte Media Supplement Kit | Lonza | CC-3198 | HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml) |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Other manufacturers are ok. |
| Ammonium hydroxide | Fischer Scientific | A669 | Other manufacturers are ok. |
| Fresh porcine cadaver tissue | n/a | n/a | |
| Lyophilizer | any | n/a | |
| Freezer mill | any | n/a | |
| Bioprinter | n/a | n/a | The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials. |
| Hanging drop cell culture plate | InSphero | CS-06-001 | InSphero GravityPlus 3D Culture Platform |
References
- Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, 921-926 (2012).
- Fedorovich, N. E., et al. Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing. Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regen Med. 3, 93-103 (2008).
- Skardal, A., Atala, A. Biomaterials for integration with 3-d bioprinting. Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates. Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6, 024105 (2014).
- Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels. Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).
- Skardal, A., et al. Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting. Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).
- Skardal, A., et al. Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds. Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).
- Xu, T., et al. Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications. Biofabrication. 5, 015001 (2013).
- Xu, T., et al. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34, 130-139 (2013).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder. J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).
- Skardal, A., et al. Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function. Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).
- Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. Injectable ECM scaffolds for cardiac repair. Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nat comm. 5, 3935 (2014).
- Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering. Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle. Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).
- Lozoya, O. A., et al. Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche. Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).
- Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
- Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells. J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).
- Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. Kang, H. W., Lee, S. J., Atala, A., Yoo, J. J. , 2012/00889238 A1 (2011).
- Drewitz, M., et al. Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues. Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).
- Skardal, A., et al. A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs. Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).
- Peattie, R. A., et al. Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants. Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells. Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing. Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).
- Liu, Y., et al. Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix. J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).
- Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery. Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).
- Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).
- Xu, X., Prestwich, G. D. Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model. Cancer. 116, 1739-1750 (2010).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels. Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).
- Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro. Ann Biomed Eng. , (2015).
