Summary
Birlikte işlevsel ve uygun bir 3-D doku yapıları in vitro tarama uygulamalarında kullanılmak üzere bioprinted edilebildiği bir doku taklit hidrojel bioink sağlayan bir protokol kümesi tarif eder.
Introduction
Son yıllarda, teknolojiler çeşitli bunları üretmek veya biofabricate isteyen fonksiyonel organ ve dokuların alternatif kaynaklar ihtiyacını giderir kullanılabilir hale gelmiştir. Bioprinting bu teknolojilerin en umut verici olarak ortaya çıkmıştır. Bioprinting 3 boyutlu desen uygulanabilir organı gibi veya doku benzeri yapılar oluşturmak veya kullanılabilir biyolojik parçaların robot ilave imalat biçimi olarak düşünülebilir. Çoğu durumda, 1, bioprinting 3 (3 boyutlu kullanmaktadır -D) bu suretle yansıtan, hassas pozisyonlarda içine hücreleri ve biyomalzemeleri yatırmak için bir bilgisayar tarafından yönlendirilir baskı cihazı fizyolojik mimariler anatomik taklit. 2 Bu cihazlar hücre agrega şeklini alabilir bir "bioink" yazdırmak, hidrojeller kapsüllü hücreleri veya yapışkan sıvılar veya hücre tohumlanır mikro taşıyıcılar, hem de hücresiz pla gibi mekanik yapı veya hareket sağlayan hücre içermeyen polimerlerceholders. 3,4 bioprinting işleminden sonra, elde edilen yapı, işlev doku ya da organ yapılarına olgunlaşmış ve amaçlanan son uygulama için de kullanılabilir. 5,6 Bugüne kadar, tam bir tam olarak işlevsel insan boyutunda organı baskılı edilmemiştir, ancak araştırma ve geliştirme bioprinting birincil uzun vadeli bir hedef olmaya devam etmektedir. 2 Bununla birlikte, "organoid" doku yapıları şu anda patoloji modelleme, ilaç geliştirme ve toksikoloji tarama dahil olmak üzere uygulamaların, bir dizi yürütülmektedir küçük ölçekli.
Araştırmacılar bioprinting teknolojisini uygulayarak karşılaştığım en önemli engellerden biri çok az malzeme bioprinting açık amaç için geliştirilmiş olmasıdır. etkin bir bioprinting başarılı olabilmek için, bir biyomalzeme 4 temel gereksinimleri karşılaması gerekir. Biyo materyal birikimi sağlamak için 1), uygun mekanik özelliklere sahip olması gerekir (bir jel veya I gibi bir meme boyunca ekstrüzyonlaBir damlacık olarak nkjet) birikmeden sonra bir 3-D yapının bir bileşeni olarak şekli korumak için 2) yeteneği, 3) 2, önceki özelliklerinin kullanım kontrolü, ve 4), bir hücre için uygun ve destekleyici ortamda tüm yeteneği bioprinting prosedürünün aşamaları. 7 Tarihsel olarak, işi bioprinting yerine sıkça bioprinting ve sonraki baskı sonrası uygulamalar için gerekli özelliklere sahip bir biyo materyal tasarlama, onların uyumluluk için dikkate olmadan bioprinting cihazlarda mevcut geleneksel biyomalzemeleri istihdam etmeye çalıştı.
bioinks çeşitli kaplama ve üretim donanımı ile daha iyi son zamanlarda geliştirilmiştir. genellikle iki habercisi olarak yetersiz mekanik özellikleri, ya da eğer memeleri yapışmasına neden olabilir basılı veya sıkma işlemi sırasında kırılmış olma polimerize hidrojeller ile sıvı çözümler bulunması nedeniyle standart hidrojel sistemleri önemli sorunlar oluşturmaktadır. Ekibimiz, hem de tasarımlarıyla olarakRS, hidrojel substratlar içine hücre sferoid baskı, Mikro kapiller tüpler 5,8 hücresi ve hidrojel filament ekstrüzyon dinamik çapraz bağlama özelliklerine sahip 9-11 ekstrüde hiyalüronik asit (HA) -Altın nanopartikül hidrojeller de dahil olmak üzere, bu bioprinting sorunları çözmek için çeşitli hidrojel formülasyonlar, araştırdık , fotopolimerleşebilen kullanarak hidrojel sertlik 12 zamansal kontrolü, 17 HA ve jelatin, 13 fibrinojen-trombin tabanlı çapraz bağlanmasını, 14,15 iyonik değişim aljinat-kolajen jelleri, 16 metakrile ve son zamanlarda hızla polimerize ultraviyole ışık (UV) -initiated çapraz
Bu örnekler etkin bir bioprinted seçebilirsiniz üreten malzemelerin uygulanabilirliğini göstermek. Ancak, donanım ile entegre ek olarak, başarılı bir şekilde, sürekli ve işlevsel 3 boyutlu doku yapıları oluşturmak için, biyo materyaller hücre korumada yardımın biyokimyasal ve mekanik ipuçları içermelidircanlılığı ve işlevi. Bu ek faktörler, biyokimyasal ve mekanik profiller, bioprinted doku yapıları başarılı fonksiyonu üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir.
Her iki hücre ve doğal hücre-dışı matrisi (ECM) gibi büyüme faktörleri ve diğer hücrelere diğer sitokinler gibi sinyal molekülleri geniş yelpazeli sorumludur. Bu sinyallerin birleşimi dokudan dokuya değişir, ancak, hücre ve doku davranışını düzenleyen son derece kuvvetli ve etkili olabilir. 18, araştırılmış olan farklı organlardan doku spesifik ECM bileşenleri kullanan ve bir hidrojel olarak veya bir hidrojel bir parçası olarak uygulanması başarısı. 19-21, belirli bir doku decellularizing o ince öğütme ve eriterek oluşan bu yaklaşım, bir dokudan dokuya özel biyokimyasal sinyallerin üretilmesi için 3-D hidrojel yapılarında dahil edilebilir kullanılabilir. 22
Buna ek olarak,yaygın vücuttaki dokular katılıkları geniş bir yelpazede işgal olduğu belgelenmiştir. Bu nedenle 23, ayarlamak için yeteneği gibi elastik modülü E 'veya kesme elastik modülü G' olarak biyomateryaller, mekanik özellikleri, doku mühendisliğinde yararlı bir araçtır . Yukarıda tarif edildiği gibi, bioink mekanik özellikler üzerinde kontrol hedef organ Çeşidi ile aynı olduğu daha sonra elastik modül seviyesi elde edilebildiği de daha sonraki bir noktada, ikincil çapraz bağlama ile manipüle yumuşak bir jel kullanılarak ekstrüzyon bazlı biofabrication sağlar. Örneğin, biyomalzemeler çalışması için bu organoids yeteneği artan teoride 24,25, yerli karaciğer gibi 23 5-10 kPa sertliğine uyum veya yerel kalp dokusu gibi 10-15 kPa sertliği maç için özelleştirilmiş olabilir kendi ana doku meslektaşları benzer bir şekilde. hücre fenotipinde çevresel sertlik etkisi Exp olmuşturÖzellikle kök hücreleri ile ilgili olarak, son yıllarda lored. Engler ve ark., Doku elastikiyeti substrat olduğunu eşleşen soylar karşı mezenkimal kök hücreleri (MSC) sürüş destekli bu alt tabaka esnekliğini göstermiştir. 25 Bu kavram daha kas içine farklılaşma, kalp fonksiyonu, karaciğer fenotip, hematopoetik kök hücre çoğalması için araştırılmaktadır ve kök hücre tedavi potansiyelinin bakım. 24,26-29 ayarlamak için güçlü olmak farklı elastik modülünün bir hidrojel doku yapıları biofabricate için kullanılacak biyomalzeme önemli bir özelliğidir. 30
Burada ekstrüzyon bioprinted edilebilir bir hidrojel sistemi formüle etmek bizim laboratuvarda kullanılan çok yönlü bir yaklaşımı temsil eder ve belirli bir doku tipi biyokimyasal profil içeren ve 2) doku Çeşidi elastik modülü taklit) 1 özelleştirilmiş bir protokol tarif . Bu gereksinimleri ele alarak, biz p hedefliyoruzin vivo fizikokimyasal ve biyolojik özelliklerini özetlemek bir malzeme rovide dokusudur. 31. Burada tarif edilen modüler hidrojel bileşik sistem ekstrüde bioinks üretmek üzere bir çok çapraz bağlama yaklaşım yararlanır ve stabilize etmek için ikinci bir çapraz bağlanma sağlar ve sertliğini artırır son ürünlerin doku tiplerinin aralığında uyum sağlamak. Biyokimyasal özelleştirme doku spesifik ECM bileşenleri kullanarak karşılanmaktadır. bir göstergesi olarak, fonksiyonel karaciğer organoid yapıları bioprint bu hidrojel sisteminin bir karaciğere özgü çeşitli kullanır. açıklanan protokol, özel bir 3-D bioprinting cihazı kullanır. Genel olarak, bu protokol çoğu ekstrüzyon tabanlı yazıcılara adapte edilebilir, özel baskı parametreleri cihazın her türü için önemli ölçüde değişir ve kullanıcı tarafından test gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hidrojel Bioink Formülasyonlar ve Hazırlama İşlemi
- , Dokuya özel bir biyokimyasal profiller temin önce karaciğer için tarif edildiği gibi doku spesifik ECM çözümler sindirimi hazırlanması için. 20
Not: Genel olarak, bu ECM özeti kullanıldığında son hidrojel bioink hacminin% 40 ihtiva edecektir. ECM özeti çözeltisi birkaç yüz mililitre hazırlanabilir bölünmüştür ve ileride kullanılmak üzere -80 ° C'de dondurulabilir. - bir foto-başlatıcı, 2-hidroksi-4 'çözülür, formülasyonun hidrojel için -% 0.1 (2-hidroksietoksi) -2-methylpropiophenone, su içinde ağ / hac.
Not: 50-100 mi aralığında hacimleri önceden hazırlanabilir ve birkaç ay boyunca 4 ° C'de ışıktan korunmuş olarak saklanmıştır. - Hidrojel bioinks oluşturmak için, ilk olarak suda foto-başlatıcı çözeltisi içinde hiyalüronik asit (HA) hidrojel kitleri baz malzemesi bileşenleri çözülür.
- Su arıtımı ayrı HA tiolatlanmış ve tiolatlanmış jelatin çözülürhotoinitiator çözeltisi (aşama 1.2) hac çözeltiler / ağ% 2 olmak için.
- % 8 ağırlık / hacim solüsyonu yapmak üzere, suda foto-başlatıcı çözeltisi (aşama 1.2) polietilen glikol diakrilat (PEGDA), hidrojel kitlerinde çapraz bağlayıcı, eritin.
- % 8 ağırlık / hacim solüsyonu yapmak üzere, suda foto-başlatıcı çözeltisi (aşama 1.2) polietilen glikol (PEG), 8-kollu alkin (10 kDa MW) içinde çözülür.
- ek özelleştirme mümkün olmasına rağmen, genel olarak, aşağıdaki şema kullanılarak hidrojeller oluştururlar.
- genel olmayan doku olarak% 2 HA tiolatlanmış 4 parça, 4 parça% 2 tiolatlanmış jelatin, 1 kısım çapraz bağlayıcı 1, 1 kısım çapraz bağlayıcı 2 8 parça doku, ECM çözümü ve 2 parça hepatosit kültür ortamı (HKM) (ya da 10 parça su birleştirin e özgü hidrojel).
Not: Ek modifiye edilmemiş HA ya da jelatin daha düzgün bioink ekstrüzyonunu yapmak için ilave edilebilir. Bu, aşağıda açıklanmaktadır.
- genel olmayan doku olarak% 2 HA tiolatlanmış 4 parça, 4 parça% 2 tiolatlanmış jelatin, 1 kısım çapraz bağlayıcı 1, 1 kısım çapraz bağlayıcı 2 8 parça doku, ECM çözümü ve 2 parça hepatosit kültür ortamı (HKM) (ya da 10 parça su birleştirin e özgü hidrojel).
- Kullanmadan önce karıştırmak için 10 saniye (10 üzerinden hız 10) yüksek üzerinde ortaya çıkan karışımın Vortex. </ Li>
- Hidrojel bioink kullanımı
- ekstrüzyon veya bioprinting testi için, bir şırınga ya da yazıcı kartuşu içine karışımı aktarın ve 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca (aşama 1 çapraz bağlama) için kendiliğinden çapraz bağ sağlar.
- Reolojik ölçümler için, 35 mm Petri kabı içine karışımı aktarın ve 30 dakika boyunca çapraz sağlar.
Not: Karışım hemen tiol akrilat bağı oluşumu yoluyla çapraz bağlanması için başlar ve viskozite artmaya başlar. Karışım transferi sırasında bir pipet veya şırınga tıkanmasını önlemek için 10 dakika içinde bir şırınga, baskı kartuşu, ya da hedef konuma transfer edilmelidir. - İkinci çapraz bağlama (Aşama 2) arzu edildiği zaman, bir tiol-alkin polimerizasyon reaksiyonunu başlatmak için evre ultraviyole ışığı (365 nm, 18 W / cm2) ile 1-çapraz bağlanmış jeller ışın tedavisi.
Not: Işınlama süresi malzemenin yüzey alanına bağlıdır. Genel olarak, malzemenin bir santimetre karelik, ancak 1- gerektirirBu UV gücü UV maruz kalma 2 sn.
2. Yazıcı Uyumluluk Testi
- Standart şırınga ve küçük iğne uçları (20-30 gauge) kullanılarak basit ekstrüzyon testleri ile laboratuvar tezgah üzerinde bioprinting cihazlar, deney ekstrüzyon özellikleri ile entegrasyon test öncesinde.
- az veya hiç darbe ile hidrojel sorunsuz haddelenmiş filamentler elde etmek için standart bir şırınga ile bioink itin. çizgiler veya basit desen ekstrüzyon başarısını belirlemek için yeterlidir.
- bioprinter entegrasyonu için yazıcı kartuşları içine pipetleme hazırlıklarını bioink yük ve bioink 30 dk kartuş içinde kendiliğinden aşama 1 çapraz bağlanmasının geçmesi için izin verir.
Not: bioink hacmi uygulamaya bağlıdır ve kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Yazıcı kartuşları benzer ya da bioprinter cihazla uyumlu şırınga olabilir. - ekstrüzyon uyumluluğu değerlendirmekbioink kullanarak basit bir desen yazdırarak bioprinting için. Örneğin, paralel çizgilerin oluşan 7 x 7 mm desenini yazdırmak. Baskı (örneğin, 20 kPa pnömatik basınç) uygulanır ise yaklaşık 300 mm / dakika bir hızda XY düzleminde yazıcı kafası hareket eder.
Çeşitli büyüklüklerde kafası meme çapları kullanılabilir, ancak 400-500 mikron çapında delikleri olan konik püskürtme 250-350 um aralığında sferoidler baskı için uygun olunur.- ekstrüde malzemeler pütürlü veya düzensiz ise, 2.4 adım bakın veya evre 1 çapraz malzemeyi yumuşatmak için PEGDA miktarını azaltır. Düzgün hazırlanmış bioink formülasyonlar istenilen desen veya mimarileri hassas birikimi sağlayan sorunsuz a'ya.
Cihazın her türü için önemli ölçüde bu tür özel baskı parametreleri gibi 32 tarif kullanım bioprinting prosedürleri, özellikle baskı oluşturmak doku için evde tasarlanmış özel bir 3-D bioprinting cihazı değişir ve testin gerektirir. NotKullanıcı tarafından örn.
- ekstrüde malzemeler pütürlü veya düzensiz ise, 2.4 adım bakın veya evre 1 çapraz malzemeyi yumuşatmak için PEGDA miktarını azaltır. Düzgün hazırlanmış bioink formülasyonlar istenilen desen veya mimarileri hassas birikimi sağlayan sorunsuz a'ya.
- Ekstrüzyon özelliklerini geliştirmek bioinks değiştirilmemiş HA ve jelatin ek (1.5 mg / ml ve 30 mg / ml) ile.
Primer Karaciğer Yapıları ile Bioprinting tarafından 3. Doğrulama
- Hücresel bileşen 33 olarak açılan yöntemleri asarak 3-D birincil hücre karaciğer parçacıklarının hazırlayın
Not: Bioprinting da hidrojel bioinks içinde süspansiyon haline tek tek hücreler ile parçacıklarının olmadan gerçekleştirilir, ancak bunun yerine edilebilir. Sferoidler hücre-hücre etkileşimleri hızlandırmak ve işlevselliği oluşturmak için burada istihdam edilmektedir. Kullanılan sferoitlerin ve hücre sayısı, belirli uygulamaya bağlıdır ve kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Bu adımlar, steril malzemeleri kullanarak, steril koşullar altında yapılmalıdır.- hepatosit bazal ortamı (HBM) ve steril filtreleme HCM ek bileşen kiti çözülmüş içeriği ekleyerek HCM hazırlayın.
- ek bileşenleri un çözülmesıvı til.
- gentamisin sülfat / amfoterisin B, 0.5 mi;, hidrokortizon 21-hemisüksinat, 0.5 mi, insülin, 0.5 mi, 10 mi, büyükbaş hayvan serum albümini [yağlı asit serbest]; 0.5 mi ek parçaları (askorbik asit ekleme insan rekombinan epidermal büyüme faktörü , 0.5 mi, 500 mi HBM'ye), 0.5 ml aktarılması.
- Bir şişe üstü filtre ünitesi veya bir şırınga ucu filtre kullanarak bir 0.45 mikron ya da 0.22 mikron filtre ile steril filtre.
- Her hücre tipi üreticinin talimatlarına göre çözüldükten sonra bir hemasitometre sayarak birincil insan hepatositlerin, Kupffer hücreleri ve stellat hücrelerin hücre yoğunluğu belirlemek.
- konik bir tüp içinde 37 ° C'ye kadar ısıtıldı edilmiştir HCM ortam hücre sayısına göre bir 80:10:10 oranında primer insan hepatositleri, Kupffer hücreleri ve stellat hücreleri birleştirir.
Not: kullanılan ortam hacmi genel hücre sayısı uygulamaya özel bağlıdır ve th belirlenmelidire kullanıcı. - 20 ° C'de 520 x g'de 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj.
- Hücre pelet geride bırakarak, süpernatant aspire.
- 40 ul ortam 1.000 hücreleri ihtiva eden bir hücre süspansiyonu elde etmek için HCM medya hücre pelletini. sferoidler sayısı üretilen toplam hacim bağlıdır.
- 96 göz formatındaki Asılı damla plakalar hücre süspansiyonu aktarın. Çok hücreli küreler oluşturan 3 gün boyunca% 5 CO2 içinde, hcm Her bir oyuğa, yaklaşık 1.000 hücre toplam ekleyin ve 37 ° C 'de muhafaza.
- Bir pipet kullanarak asılı damla plaka karaciğer parçacıklarının toplayın. steril bir 15 ml konik tüp aktarın.
- hepatosit bazal ortamı (HBM) ve steril filtreleme HCM ek bileşen kiti çözülmüş içeriği ekleyerek HCM hazırlayın.
- karaciğere özgü hidrojel bioink olarak Bioprint karaciğer sferoidler
- çapraz bağlantı sağlayıcı olarak% 8 PEGDA ve% 8 8-kollu PEG alkin kullanılarak, Kademe 1 de tarif edildiği gibi, karaciğer ECM içeren hidrojel bioink bir formülasyonunun hazırlayın. resu onun yeteneği için bu arada kullanınyerli karaciğer dokusuna kayma elastik modülü yakın bir hidrojel sonuçtaki.
- sferoidler onlar Adım 3.1.7 yerleştirildi olan konik tüpün dibine dinlendiriniz. Bu sfero büyüklüğü ve yoğunluğuna göre, ancak genellikle 1-2 dakika içinde gerçekleşir değişir. dikkatle aspire veya pipet ile tüm ortamları çıkarın.
- küremsiler içeren konik tüp taze hazırlanmış hidrojel bioink çözeltisi istenilen hacmi aktarın. Genel olarak, uygun bir hacmi,% 10 basılacak 3-B yapısı hacminden% 25 daha fazladır. Dikkatle hidrojel bioink çözeltide parçacıklarının tekrar süspansiyon aşağı yukarı pipet ve. Bir pipet veya serolojik pipet kullanarak bir bioprinter kartuşa aktarın.
- bioprinter kartuş içinde, çözelti, 30 dakika boyunca, ilk çapraz bağlama aşaması (tiyol-akrilat reaksiyonu) girmesine neden olurlar.
Not: sfero boyutuna bağlı olarak, kartuş yavaş yavaş döndürüldüğünde gerekebilir ya da içerisinde karıştırılabilir gerekebilirsteril bir spatula kademe 1 çapraz bağlanma sırasında bioink boyunca dağılmış sferoidler tutmak. Bu süspansiyon hücreleri yerine parçacıklarının hazırlanan bioinks için bir gereklilik azdır.
Not: Sahne 1 çapraz bağlama sonrasında, kullanıcıların birkaç saatlik bir çalışma penceresi var. Ancak, hücre canlılığını geliştirmek için hızlı bir şekilde bioprinting işlemini gerçekleştirmek tavsiye edilir. - evre 1 çapraz bağlama ardından, primer karaciğer parçacıklarının (veya diğer hücreleri) içeren istenen hidrojel yapıları oluşturmak için bir bioprinting aygıtı kullanın.
Not: Bu teknoloji yapılarının çeşitli biofabricating için bir sistem sunmaktadır. yapıları baskılı edildiği gibi toplam hacmi, hücreler ya da küresel cisimler, basılı yapı geometri sayısı ve alt tabaka gibi parametreler kullanıcı hedeflerine büyük ölçüde bağlıdır. - arzu edilen konfigürasyona içine tevdiattan sonra, CO stabilize ikincil bir çapraz bağlama mekanizmasını başlatmak için 2-4 saniye UV ışığı tatbikistenen seviyeye nstructs ve artan sertlik.
Not: PEG-alkin konsantrasyonu ve bu nedenle genel olarak nihai çapraz bağlama yoğunluğu, esas olarak Nihai yapının sertliğini kontrol eder. - çok katmanlı yapılar oluşturmak üzere adım 3.2.4 ve 3.2.5 tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan prosedürler doğru takip edildiğinde, hidrojeller hedef doku tipine özgü bir biyokimyasal profil içermelidir, 20 bioprinting ve nihai elastik modülü, 34 üzerinde kontrol yüksek derecede izin ve doku yapılarında yaşayabilir işlevsel hücreleri destekler.
hidrojel Özelleştirme
En iyi taklit ana karaciğer, hidrojel bioink karaciğer ECM çözümleri ve bir büyüme faktöründen dizisi ile takviye edilmiştir, 20 ECM çözeltiler (pg / ml, Şekil 1a'da gösterilmektedir), büyüme faktörleri ve sitokinler çok çeşitli içerir. Bu, beyin-türevi nörotrofik faktör (BDNF), bFGF, kemik morfogenetik protein, 5 (BMP-5), FGF-4, insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein 2 (IGFBP-2), TGF-B1, BMP-7, EGF, FGF'ler FGF-7, büyüme hormonu (GH), heparin-bağlayıcı EGF-benzeri büyüme faktörü (HB-EGF), HGF ve neurotrophin 3 (NT-3). Buna ek olarak, ECM'nin çözeltiler kolorimetrik analiz ile incelendiğinde ilave yapısal bileşenler, ihtiva etmektedir. 20, karaciğer, ECM çözeltiler, karaciğer ECM solüsyonlarının toplam kolajen içeriği olan 91,33 ± 0,58 mg / ml, elastin içeriği olan 189,33 ± 48.40 mg / ml, ve glikozaminoglikan (GAG) içeriği 86.00 ± 53.45 mg / ml (Şekil 1b).
Hidrojel, spontan evre 1 tiyol-akrilat kimyası nötr pH meydana izin vererek mekanik özellikleri bir kayma gerilmesi süpürme testini reometre üzerinde (0,6-10 Pa, salınım frekansı 1 Hz). 10,12,13,34 kullanılarak karakterize edilebilir bioink 113.66 ± 22,59 Pa bir G 'sahip bir yumuşak hidrojel oluşturulmuştur. UV fotopolimerizasyonu ile Aşama 2 tiol alkin çapraz bağlama başlandıktan sonra, yaklaşık 10 kPa (10.637 ± 113.83 Pa, figu G 'artar1C yeniden), karaciğer doku elastikiyetini taklit. Konsantrasyonları, moleküler ağırlıklarda ve çapraz bağlayıcıların geometrilerinin ek işleme aşaması 2 G 'değerleri geniş bir sağlayabilir. 34
Bioprinted hidrojel Kalitesi
Kimyasal strateji ve hidrojel bioinks 1. Aşama ve 2. Aşama çapraz bağlama uygulaması Şekil 2'de tarif edilmiştir. Genel olarak, akrilatlı PEG polimerlere dayanan örneğin Extralink gibi çapraz bağlayıcılar, kendiliğinden doğal HA tiol grupları ve jelatin zincirleri ile reaksiyona hücrelerin varlığında pH (aşama 1) yumuşak ekstrüde hidrojel oluşturmak üzere. Bu yumuşak hidrojel UV ışığı alkin-modifıye edilmiş bir PEG polimer bazlı reaksiyona girmemiş tiol ve ikinci çapraz bağlayıcı ışıkla polimerizasyonunu başlatmak için kullanılır ve bundan sonra, bir bioink olarak bioprinted edilebilir. çapraz bağlayıcı özellikle moleküler ağırlıkları ve geometrileri gitmekVern bioprinted yapının uç sertliği. A 7 x 7 mm model test amaçlı (Şekil 3A) için uygulanmıştır. İlk testler ilk formülasyonlar sıkılabilir olduğunu gösterdi, ancak sırasında ve ekstrüzyon (Şekil 3B) sonra düzensiz ve clumped çıktı. çekme özelliklerini geliştirmek için, modifiye edilmemiş HA ve jelatin bioinks (1.5 mg / ml ve 30 mg / ml) ilave edildi. Geliştirilmiş yumuşak baskılı yapısı Şekil 3C gösterilmiştir.
Canlılık ve bioprinted birincil insan karaciğer yapılarının temel işlevi
biyoaktif karaciğere özgü hidrojel bioink saklanması ve daha önce plastik lamelleri üzerine, damla kültürleri asarak hazırlanan primer insan karaciğer sferoidler, mevduat kullanılan bioprinter 3-D kullanarak. Hücre kültürü ortamlarında çeşitli sağlam kullanım ve transfer için izin verilen plastik lamelleri üzerinde yazılı olan. bioprinting sonra, merhabaKaraciğer yapılarda gh hücre canlılığı CANLI / DEAD canlılığı / sitotoksisite boyama ve konfokal mikroskopi (Şekil 4A) sonra gözlenmiştir. uygun çevre koşulları altında yaşayabilirliği% 85'in üzerinde olmalıdır. Primer insan hepatositler genellikle çevresel değişkenlerin bazı optimizasyon gerekli mekanik ve kimyasal etkinin, duyarlı kabul edilir.
bioprinting ve canlılık doğrulanmasını takiben, kültür içinde yer alan ek karaciğer yapıları salgılanmış üre ve albümin analizi için 3. gün, 7. gün, 10. gün ve 14. günde çıkarılır ortam alikotları analiz ederek işlevler için değerlendirilebilir. Üre kolorimetrik tahlilleri, 15 ve 20 ng / ml (Şekil 4B) arasında kalan, 14 günlük bir süre boyunca, karaciğer yapılardan üre salgılaması nispeten tutarlı bir düzeyde ortaya koymaktadır. Algılandı üre düzeyleri farklı zamanlarda birbirinden anlamlı olarak farklı değildiişaret eder. İnsan Albümin ELISA deneyi yapılardan albümin üretimi de 125 ve 140 ng / ml (Şekil 4C) ile sabit kaldığı zaman içinde nispeten tutarlı kalmasını göstermektedir. karaciğer dokusu, hücre içi albümin pozitif ifadesi, CYP3A4 (metabolizmasına katılan bir sitokrom P450 izoformu), E-kadherin (bir epitel hücre-hücre yapışma proteini), ve dipeptidil göstergesidir belirteçleri için boyandı Ayrıca, peptidaz-4 (bir protein olarak ifade büyük oranda karaciğerde) (Şekil 4D-F) gözlenir. Birlikte ele alındığında, bu canlılığı ve fonksiyonel veriler, canlılığı ve bioprinted primer hücre bazlı karaciğer yapıların işlevi muhafaza dokuya özel hidrojel bioink yardımcı olur.
Şekil 1. Hidrojel bileşeni karakterizasyonu ve sertlik değerlendirmesi. A) Büyüme faktörü veKaraciğer. B'den hazırlanan ECM çözümleri) kolajen, glukozaminglikanın kolorimetrik tahlil ölçümü ve karaciğer ECM çözümleri elastin içeriği için proteomik dizileri tarafından sitokin analizi. C) bioink sertliği kontrol yeteneğinin gösterilmesi. 1. aşama çapraz bağlama sonrası, jel, nispeten yumuşak ve düzgün bir şekilde ekstrüde edilmesi mümkündür. UV ışığı, karaciğer dokusu, esneklik katsayısı taklit fazla bir büyüklük sırasına göre göre elastik modül artar, 2. aşama çapraz bağlama sonrası. Hata çubukları standart sapmayı göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Doku üzerinde ekstrüzyon bioprinting ve kontrol için birden çok PEG-bazlı çapraz bağlayıcılar istihdam Şekil 2. mekanik özellikleri yaparız. Sakrilat bazlı çapraz bağlayıcı (çapraz bağlayıcı 1), alkin tabanlı ıslatma maddelerinin (çapraz bağlayıcı 2) oluşan yazdırılabilir bioinks formülasyon trategy, tiollenmiş jelatin, doku ECM maddeleri ve modifiye edilmemiş HA ve jelatin HA tiollenmiş. bioink formülasyonu ve kendiliğinden yumuşak, ekstrüde edilebilir malzeme elde bağlayıcı tiol akrilat ile çapraz bağlanmaktadır edilir. Bioprinting gerçekleştirilir. Son olarak, bioprinted katmanlar kaynaşmış, stabilize ve karaciğer elastik modülü getirdi. Bu süreç çok katmanlı yapıların üretilmesi için tekrar edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bioinks Şekil 3. Bioprinting testi. A) 7 x 7 mm sarım şeması bioink ekstrüzyon test için kullanıldıbioprinter ing. B) PEGDA ve 8 kollu PEG alkin bioink ilk formülasyonu ham HA ekleme) düzensiz birikimi. C sonuçlandı ve jelatin bioink düzgün ekstrüzyon sonuçlanan ekstrüzyon düzeldi. Ölçek çubuğu -. 1 mm bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Canlılığı ve karaciğere özgü hidrojel bioink. A) bioprinting için karaciğer bioink uygulanması halinde bioprinted karaciğer sferoidler fonksiyonu Şekil 4. Gösteri, yüksek canlılık yapıları sonuçlandı. Yeşil - kalsein canlı hücre AM-lekeli; Kırmızı - Etidyum homodimer lekeli ölü hücreler B) Üre ve C) 14 d üzerinde karaciğer yapıları tarafından salgılanan albümin.sırasıyla, kolorimetrik ve ELISA tahlilleri ile nicelleştirilmiştir kültürde ays. Hata çubukları standart sapmayı belirtir. D) CYP3A4, E) Hücre içi albümin, ve F) DPP4 ve E-kaderin: Karaciğer dokusu ile ilişkili markörlerde immün. Yeşil ya da kırmızı - leke belirtilen; Mavi -. DAPI bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsanlarda ya da in vitro tarama uygulamaları için nihai kullanım için, 3-D doku yapıları biofabricate çalışırken dikkate kritik çeşitli bileşenler vardır. biofabrication cihazın kendisi son yapı ulaşmak için genel metodolojiyi belirler iken uygun hücresel bileşenleri kullanılarak, uç potansiyel işlevselliği belirler. o ikili rolleri hizmet olarak üçüncü bileşen, biyomalzeme, eşit derecede önemlidir. Özellikle, biyo materyal bileşeni biofabrication donanım (yani, bioprinters) ve aynı zamanda potansiyel olarak hassas biyolojik hücre bileşenleri desteklemek ile uyumlu olması gerekir. Bu gerekliliklerin her ikisi de en iyi duruma getirme bioprintable malzemeler birkaç anahtar parametreleri karşılamak gerekir olarak, zor olabilir: 1) verimli ve ipoteksiz baskı kolaylaştırmak için uygun kimyasal, mekanik ve zamansal özelliklere sahip; Hazırlık aşamaları ve bioprin sırasında 2) desteği hücre canlılığıting prosedürü; 3) ve en iyi hücre canlılığı ve bioprinting aşağıdaki nihai doku yapısı işlevini artırır misafirperver bir ortam sağlar. Biz bu gereksinimleri karşılamak için burada açıklanan metodoloji açıklanan modüler hidrojel bioink sistemini kullanır. İlk olarak, büyüme faktörleri, kollagenler, gags, ve belirli bir doku tipinin ECM türetilen elastinler dahil ederek, hedef doku tipine anımsatan bir biyokimyasal profil elde edebilirsiniz. İkinci olarak, 2 benzer şekilde, ancak bağımsız çapraz bağlama reaksiyonları kullanılarak ekstrüzyon bazlı, ayrıca ikinci bir çapraz bağlama aşaması ile değiştirilebilen bir hedef ile eşleşen bir tespit edildiği üzere malzemenin elastik modüle ulaşmak için en uygun olan yumuşak ekstrüde materyal elde edebiliyoruz seçim doku. 34
yararlı kılan bu sistemin kritik özelliği polimer işlemek için harnessed olabilir çoklu kimyasal reaksiyonları desteklemek yeteneğihaklara ait kinetik ve bioink sisteminin mekanik özellikleri. 2 bağımsız Reaksiyon türleri, tiol-akrilat ve tiol-alkin kullanılmasıyla, bir şırınga ya da bioprinting cihazı ekstrüde edilebilir bir yumuşak malzeme ile sonuçlanan bir Aşama 1 tiol akrilat reaksiyonu ve bir sahne 2 tiol gerçekleştirmek için yetenek sağlamak sadece son bioprinted yapının bir esneklik modülüne belirleyen bir foto-başlatıcı varlığında, UV'ye maruz kalmadan sonra başlatılır -alkyne reaksiyon. Bu çoklu adımlar bioprintable malzeme ile sonuçlanır. Bu şekilde, bu ayrı bir tepkime türlerini muhafaza, ekstrüzyon ve daha sonra elastik modül özelleştirme destekler stabil bioink elde etmek için önemlidir.
biofabrication için sistemini kullanarak birincil beraberlik ya ikincil çapraz bağlayıcı ile son elastik modülü manipüle veya farklı doku kökenli ECM malzemelerin eklenmesi ile aracılığıyla yapılır özelleştirme kolaylığı olduğunu veya büyüme faktörü kokteyller. dokularda ECM büyüme faktörleri ve genellikle doku türleri arasında genel olarak dağıtım değişen başka sitokinlerin çeşitli içerir. Biz, bu faktörler primer insan hepatositleri gibi belli hücre tiplerinin, fonksiyonunu muhafaza etmek için yekparedir inanıyoruz. Bu kavramın uygulanması önceden heparin bağlayıcı büyüme faktörleri ile hidrojel yanı sıra karaciğer ECM diğer ECM bileşenleri heparin zincirleri birleştirerek canlılığı ve heparinize hyaluronik asit sandviç kültürlerinde birincil insan hepatositlerin işlevini. 20 artırmak için gösterilmiştir, biz başardık uzun bir zaman dönemi için, in vitro olarak canlılığı ve fonksiyonu muhafaza primer insan hepatositleri, bu karaciğere özgü biyokimyasal sunmaktır. Bu yaklaşım kolayca araştırmacılar decellularizing ve diğer dokular çözündürücü bu dokuya özel faktörler yeniden vücuda elde etmek için izin diğer doku türlerine uzatılabilir.
tert "> Kullanıcılar farkında olmalıdır, bu bioink sisteminin baz bileşenleri, bioprinting uygulanmıştır ise, 10,12,17 ancak daha az nüanslı dokuya özgü yaklaşımlar, hem de diğer rejeneratif tıp uygulamalarında çeşitli, 35- 45 biofabrication Tüm doku türleri için teşebbüs edilmemiştir. bu nedenle, bu tür ek doku yapıları oluşturmak için gerekli olan bir miktar daha geliştirilmesi ve sorun olabilir. Bununla birlikte, bu burada tarif edilen gibi bir modüler sistem, çok iyi adapte olabilir. Diğer potansiyel sınırlamalar bazı hücre tipleri, özel biyo doğru olabilir, doğal afinitelere içerir. Genel olarak, örnekleme ile, bu hidrojel sistemi destek hiyalüronik asit, jelatin ve PEG-bazlı temel bileşen canlı hücre tipleri çok çeşitli kültürler, henüz bu tür bir doğal fibröz na sahip kolajen, farklı bileşimlerin işlenmiş ortamlarda daha iyi performans hücrelerin bazı türlerinde olabilirdaha fazla elastik doğası gereği Türe veya elastin. Bu şekilde, belirli bir doku tipine ve son uygulama için uygun malzeme göz önemlidir ve burada açıklanan hidrojel bioink sistemi tüm kullanımlar için yeterli olmayabilir. Buna ek olarak, bioprinting gerçekleştirilir altında çevre koşullarını dikkate alınması önemlidir. hazırlık ve baskı süresi çok 37 ° C kullanarak bioinks altında, daha hızlı protokoller çizilmiş olsaydı, bu protokolün geliştirilmesi sırasında, yakın çevre (oda sıcaklığı) kötü canlılığı neden herhangi bir hücre medya olmadan bioinks kullanarak şartlarından geçiş önemli ölçüde hücre canlılığı artan bir medya bileşiklerle hazırlanabilir.Yakın zamana kadar, birkaç malzeme veya malzeme sistemleri bioprinting sistemleriyle arayüz için özel olarak geliştirilmiştir. Bunun bir sonucu olarak, birçok malzeme, biofabrication ile uyumluluk hücrelerini desteklemek için biyolojik özelliklerini ya yararlanarak, basit, ya dadonanım. Birkaç malzemeler her iki alanda da en uygun olan. Bu metodoloji açıklanan sistem ekstrüzyon bioprinting için gerekli olan mekanik özellikleri kolaylaştırmak ederken böylece, biyolojik karakterizasyonu özelleştirme sağlayan, bu özellikleri decouples. Bu hidrojel bioink sisteminin bir başka fark, o biofabricating için kullanılan hedef dokuların hem biyokimyasal hem de fiziksel parametrelerin taklit edebilir olmasıdır. Bu neredeyse her doku biyokimyasal faktörlerin yeniden vücuda sağlayan, hem de herhangi bir yumuşak doku bir esneklik modülüne uyan, esneklik özellikle geniş destekler. Bir doku bu yönüyle hem dikkat nadiren tandem araştırılmıştır.
Bu teknolojinin modüler doğası, geniş bir uygulama çeşitli uygulanacak bir esneklik elde edilir. çeşitli doku tiplerini taklit yeteneği, bu çalışmada örnek olarak kullanılan sadece karaciğer yapıları biofabricate yeteneği sağlar, ancak aleyhteyapılar vücuttaki diğer dokularda çok temsil eder. Belki de bu parametreleri kullanarak en bariz geniş uygulama gibi implantasyon veya ilaç ve toksikoloji tarama gibi gerçek uygulamalar için tasarlanmış yapıları bitiş fonksiyonunu optimize etmek için özel bir dokuya iki açıdan maç için yeteneğidir. hastalarda implantasyon için insan ölçekli dokuların nesil nedeniyle doku mühendisliği organlara fonksiyonel damarsal imal yeteneği üzerinde düzenleyici engeller, hücre kaynak ve sınırlamalar, birçok araştırmacının için nihai hedefi olsa da, bu yüce amaç daha da geliştirilmesi ve zaman gerektirecektir gerçekleştirilmesi. Ancak, bu tür burada açıklanan metodoloji gibi teknolojiler şu anda başlıyor in vitro platformları için "organoids" üretilmesi için uygulanacak. Ekibimiz, diğerlerinin yanı sıra, şu anda toksikoloji çalışmaları gerçekleştirildiği model sistemleri oluşturmak için biofabrication organoid kullanmaktadır. Ayrıca, bu tür organoids için kullanılabilirkanser, 46 olarak patolojileri ve hastalığın ilerlemesini, çalışma ve potansiyel terapötik tedavileri test edin. Son olarak, bu sistem, bir diğer önemli kullanımını destekler. bağımsız Bu parametreleri manipüle ederek, araştırmacılar, mekanik faktörlerin karşı biyokimyasal göreli önemini belirlemek için temel bilim deneyleri gerçekleştirebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar minnetle Uzay ve Deniz Harp Sistemleri Merkezi Pasifik (SSC PASİFİK) Sözleşme No. N6601-13-C-2027 kapsamında Savunma Tehdit Azaltma Dairesi (DTRA) tarafından fon kabul. Bu malzemenin yayın buradaki bulgular veya sonuçların hükümet tarafından onaylanması anlamına gelmez.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid | Sigma | 53747 | |
| Gelatin | Sigma | G6144 | |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP) | ESI-BIO | GS315 | Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA) |
| PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa | Creative PEGWorks | PSB-887 | |
| Primary human hepatocytes | Triangle Research Labs | HUCPM6 | |
| Primary human liver stellate cells | ScienCell | 5300 | |
| Primary human Kupffer cells | Life Technologies | HUKCCS | |
| Hepatocyte Basal Media (HBM) | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte Media Supplement Kit | Lonza | CC-3198 | HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml) |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Other manufacturers are ok. |
| Ammonium hydroxide | Fischer Scientific | A669 | Other manufacturers are ok. |
| Fresh porcine cadaver tissue | n/a | n/a | |
| Lyophilizer | any | n/a | |
| Freezer mill | any | n/a | |
| Bioprinter | n/a | n/a | The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials. |
| Hanging drop cell culture plate | InSphero | CS-06-001 | InSphero GravityPlus 3D Culture Platform |
References
- Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, 921-926 (2012).
- Fedorovich, N. E., et al. Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing. Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regen Med. 3, 93-103 (2008).
- Skardal, A., Atala, A. Biomaterials for integration with 3-d bioprinting. Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates. Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6, 024105 (2014).
- Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels. Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).
- Skardal, A., et al. Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting. Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).
- Skardal, A., et al. Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds. Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).
- Xu, T., et al. Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications. Biofabrication. 5, 015001 (2013).
- Xu, T., et al. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34, 130-139 (2013).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder. J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).
- Skardal, A., et al. Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function. Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).
- Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. Injectable ECM scaffolds for cardiac repair. Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nat comm. 5, 3935 (2014).
- Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering. Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle. Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).
- Lozoya, O. A., et al. Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche. Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).
- Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
- Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells. J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).
- Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. Kang, H. W., Lee, S. J., Atala, A., Yoo, J. J. , 2012/00889238 A1 (2011).
- Drewitz, M., et al. Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues. Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).
- Skardal, A., et al. A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs. Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).
- Peattie, R. A., et al. Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants. Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells. Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing. Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).
- Liu, Y., et al. Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix. J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).
- Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery. Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).
- Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).
- Xu, X., Prestwich, G. D. Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model. Cancer. 116, 1739-1750 (2010).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels. Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).
- Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro. Ann Biomed Eng. , (2015).
