Summary
L'esposizione a teratogeni può causare difetti alla nascita. Zebrafish sono utili per determinare il potenziale teratogeno di sostanze chimiche. Dimostriamo l'utilità di zebrafish esponendo embrioni a vari livelli di nitriti e anche in diversi tempi di esposizione. Abbiamo dimostrato che il nitrito può essere tossico e causare gravi difetti di sviluppo.
Abstract
Alti livelli di nitrati nell'ambiente può causare difetti congeniti o aborti negli esseri umani. Presumibilmente, questo è dovuto alla conversione dei nitrati in nitriti da intestinali e salivari batteri. Tuttavia, in altri studi di mammiferi, alti livelli di nitriti non causano difetti alla nascita, anche se possono portare a scarsi esiti riproduttivi. Pertanto, il potenziale teratogeno di nitriti non è chiaro. Sarebbe utile avere un sistema modello vertebrato valutare facilmente effetti teratogeni di nitrito o qualsiasi altro prodotto chimico di interesse. Qui, dimostriamo l'utilità di zebrafish (Danio rerio) per lo screening di composti per la tossicità e difetti embrionali. zebrafish embrioni sono fecondati esternamente ed avere un rapido sviluppo, che li rende un buon modello per gli studi teratogeni. Abbiamo dimostrato che aumentando il tempo di esposizione al nitrito influenza negativamente la sopravvivenza. Aumentando la concentrazione di nitrito anche effetti negativi di sopravvivenza, considerando che il nitrato non. Per gli embrioni that sopravvivere l'esposizione nitrito, vari difetti si possono verificare, tra cui pericardico e tuorlo d'edema sac, nuotare noninflation vescica e malformazioni cranio-facciale. I nostri risultati indicano che il zebrafish è un sistema conveniente per studiare il potenziale teratogeno di nitriti. Questo approccio può essere facilmente adattato per testare altre sostanze chimiche per i loro effetti sul primo sviluppo dei vertebrati.
Introduction
Teratogenesi è un processo che sconvolge il normale sviluppo di un embrione o il feto, provocando anomalie strutturali e funzionali permanenti, ritardo della crescita, o aborto spontaneo nei casi più gravi 1. Esso può essere causato da alcuni agenti naturali (teratogeni), che interferiscono con lo sviluppo embrionale in diversi modi 2. Durante lo sviluppo fetale umano, teratogeni comuni come le radiazioni, agenti infettivi, metalli tossici e sostanze chimiche organiche sono stati segnalati per causare difetti di epicanto (la pelle piega nella palpebra superiore) e clinodattilia (dito curvo o tep) attraverso errori morfogenetici 1.
La comprensione del meccanismo molecolare di teratogenesi è il primo passo verso lo sviluppo di trattamento e la prevenzione. Diversi modelli vertebrati quali la rana africana artigliata (Xenopus laevis) e zebrafish (Danio rerio) sono stati utilizzati per determinare i percorsi molecolari colpite dalla TeratOgens. Studi precedenti hanno utilizzato zebrafish come modello per l'epidemiologia, tossicologia e teratogenesi 3-7. Scholz et al. zebrafish considerato come un "gold standard" per la valutazione della tossicità ambientale. Ciò è dovuto, in parte, alla trasparenza dell'embrione zebrafish, che permette ai ricercatori di visualizzare il difetto di sviluppo come avviene 8. Circa il 70% dei geni umani hanno ortologhi in zebrafish, facendo zebrafish un modello vertebrato desiderabile per lo studio di difetti umani 9.
Alcuni studi epidemiologici hanno suggerito che nitrati e nitriti, comunemente presenti negli alimenti agricoli e acqua, sono associate a difetti di nascita o aborti spontanei 10,11, mentre altri studi non supportano questa associazione 12. Nitrati (NO 3 -) e nitriti (NO 2 -) sono naturalmente presenti nel suolo e nell'acqua. Essi sono una fonte di azoto per le piante e sono una parte della nciclo itrogen 13. Alimenti come fagiolini, carote, zucca, spinaci, bietole e provenienti da allevamenti che utilizzano fertilizzanti ad alto contenuto di nitrati hanno livelli di nitrati e nitriti 7 aumentata in modo significativo. Il latte da mucche alimentate con alimenti di nitrati alti e pesci in acqua alta nitrato (principalmente dal deflusso terreno 30) può portare agli esseri umani che consumano grandi quantità di nitrati e nitriti 14. Nitrati e nitriti sono comunemente utilizzati nella conservazione degli alimenti, che aumenta notevolmente la quantità ingerita dagli esseri umani 12.
Livelli ottimali di nitrati e nitriti svolgono un ruolo fondamentale nei processi fisiologici come omeostasi vascolare e la funzione, la neurotrasmissione e meccanismi di difesa ospite immunologici 13-15. Tuttavia, l'esposizione ad alti livelli di nitrati e nitriti può portare ad effetti negativi, soprattutto nei neonati e nei bambini 16. nitrato ingerito viene ulteriormente convertito in nitriti nella cavità orale microflora e in the tratto gastrointestinale dalla microflora intestinale 17.
Nitrato mette i neonati ad alto rischio per la sindrome del bambino blu per ossidazione di emoglobina a metaemoglobina, compromettendo l'emoglobina che trasporta l'ossigeno dalla sua capacità di 18. Ciò comporta il colore blu di pelle che si estende ai tessuti periferici nei casi più gravi. L'ossigenazione inibito di tessuti risultati in altri sintomi, più gravemente che porta al coma e alla morte 19,20. Sintomi simili sono stati osservati nei bambini e negli adulti a concentrazioni più elevate di nitrati 21. Elevati livelli di metaemoglobina negli adulti a causa di risultati di avvelenamento nitrito di cianosi, mal di testa, disturbi respiratori, 31 e morte se non trattata a causa di complicazioni legate alla ipossia tissutale vitale 32,33.
Il nitrato ingerito a livelli più alti può anche tradursi in varie complicazioni di salute. diabete infantile, diarrea ricorrente, e infezioni delle vie respiratorie ricorrentinei bambini sono stati collegati con elevata assunzione di nitrato 11,17,22. L'esposizione cronica a un alto livello di nitrato è associato con la minzione e della milza emorragie. L'esposizione acuta ad alte dosi di nitrati può portare ad un ampio spettro di condizioni mediche come dolori addominali, debolezza muscolare, sangue nelle feci e nelle urine, svenimenti e morte 11. L'esposizione prenatale al nitrato ad alti livelli è stato associato con il tubo neurale e difetti muscolo-scheletrico 11.
Un recente rapporto ha mostrato che il trattamento di embrioni di zebrafish con il nitrito ha portato alla tuorlo edema sac, malformazioni cranio-facciali e assiali, e vescica natatoria noninflation 5. In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per il trattamento di embrioni di zebrafish con nitrati e nitriti per determinare il loro potenziale teratogeno. Gli embrioni sono stati esposti a nitrito a differenti concentrazioni e periodi di tempo diversi. L'etanolo è stato utilizzato come controllo positivo, poiché è un teratogeno stabilita 23. Our metodo ha dimostrato che entrambe le concentrazioni elevate e tempi di esposizione lunghi in nitriti erano dannosi per la sopravvivenza e ha portato in vari fenotipi, che vanno da lievi (edema) a gravi difetti di sviluppo (lordi). Pertanto, il pesce zebra è un modello utile per esplorare direttamente i potenziali effetti teratogeni di nitrati e nitriti sugli embrioni per completare gli studi epidemiologici.
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Protocol
Le procedure descritte in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l'Indiana University of Pennsylvania.
1. Harvest embrioni
- Mantenere zebrafish a 28,5 ° C, pH 7, conducibilità tra 500-1.500 mS, e un ciclo luce / buio di 14 ore di luce e 10 ore scuro 24. Utilizzare ceppi wild-type, come Tu, AB o TU / AB ibrido. Diversi ceppi possono rispondere in modo diverso al trattamento chimico 25.
- Impostare il pesce per l'accoppiamento la sera prima le uova di raccolta con l'aggiunta di acqua sistema di pesce in un serbatoio di accoppiamento. Aggiungere un maschio e femmina di pesce nel serbatoio e separare le due pesci con un divisore. Ogni coppia di pesce produrrà una gamma di 50-300 uova. Per garantire che saranno prodotti abbastanza uova, istituito 30 paia di pesce. In genere, circa il 50% delle coppie di pesce all'età di accoppiamento primo (6-9 mesi) produrrà uova, con conseguente fino a 200 uova per ogni coppia e un massimo di fino a 3, 000 uova per questo esperimento.
- La mattina seguente dopo che la luce si accende, rimuovere il divisore di avviare l'accoppiamento. Controllare i serbatoi di accoppiamento per le uova ogni 15 min.
- Una volta che i pesci depongono le uova, raccogliere tutti gli embrioni utilizzando un colino da tè e combinarle in un unico grande contenitore con E3 tampone (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mm CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4). A 1,5 HPF, rimuovere ed eliminare le uova non fecondate con una pipetta di plastica sotto un microscopio da dissezione. Uova non fecondate sono opache mentre le uova fecondate sono trasparenti 34.
- Trasferire 50 embrioni in una piastra di Petri di 100 x 15 mm di vetro contenente 50 ml E3 buffer per ciascuna condizione di trattamento. Un totale di 33 piatti sono necessari per 11 condizioni di trattamento e 3 repliche.
2. Gli embrioni Trattamento
- Effettuare trattamenti a 2 ore dopo la fecondazione (HPF) 35. Incubare gli embrioni / larve a 28,5 ° C ed esaminare le larve a 120 HPF. Eseguire a least tre repliche di ogni condizione di trattamento per l'analisi statistica.
- Per 3 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di 300 mm etanolo diluito in tampone di E3. Coprire le piastre di Petri con parafilm per minimizzare l'evaporazione dell'etanolo.
- Continuare ad esporre gli embrioni di etanolo per 22 ore. Poi rimuovere l'etanolo con una pipetta di trasferimento. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare il piatto più volte per lavare l'etanolo. Rimuovere questo buffer E3 con una pipetta di trasferimento e ripetere la fase di lavaggio altre 2 volte.
- Per 3 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di nuovo buffer E3.
- Per 9 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di nitrito di sodio 1,000 mg / l disciolti in tampone E3. Confermare la concentrazione della soluzione di riserva di nitriti in anticipo utilizzando unmodifica della diazotazione (US EPA Method 354.1) metodo spettrofotometrico 28.
- Continuare ad esporre 3 piatti per 46 ore, 3 piatti per 70 ore e 3 piatti per 94 ore. Sostituire la soluzione di nitrito con una soluzione di nitrito di fresco tutti i giorni.
- Dopo ogni tempo di esposizione, rimuovere la nitriti con una pipetta. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare il piatto più volte per lavare la nitriti. Rimuovere questo buffer E3 con una pipetta di trasferimento e ripetere la fase di lavaggio altre 2 volte.
- Per 3 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di nitrito di sodio 200 mg / L. Ripetere questa operazione con 400, 600, 800, e 1000 mg / l di nitrito di sodio.
- Continuare ad esporre gli embrioni in nitrito per 70 ore. Sostituire la soluzione di nitrito con una soluzione di nitrito di fresco tutti i giorni.
- Dopo il tempo di esposizione, rimuovere la nitriti con una pipetta. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare il piatto diversivolte per lavare i nitriti. Rimuovere questo buffer E3 con una pipetta di trasferimento e ripetere la fase di lavaggio altre 2 volte.
- Per 3 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di nitrato di sodio 1,000 mg / l disciolti in tampone E3. Conferma la concentrazione della soluzione di nitrato anticipo usando una modifica della riduzione cadmio (metodo USEPA 353.3) metodo spettrofotometrico 28.
- Continuare ad esporre gli embrioni per il nitrato di 70 ore. Sostituire la soluzione di nitrato con soluzione di nitrato appena fatto quotidiano.
- Dopo il tempo di esposizione, rimuovere il nitrato con una pipetta. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare il piatto più volte per lavare il nitrato. Rimuovere questo buffer E3 con una pipetta di trasferimento e ripetere la fase di lavaggio altre 2 volte.
- Durante ogni giorno di esposizione, contare il numero di morti dell'embrione / larve utilizzando uno stereomicroscopio. Segni di morteincludono la mancanza di battito cardiaco e la circolazione del sangue, o la mancanza di motilità dopo 1 minuto di osservazione. Rimuovere morti embrioni / larve con una pipetta di trasferimento per ridurre la contaminazione del buffer E3.
- Quando gli esperimenti finiscono a 120 HPF, eutanasia le larve.
- Rimuovere il buffer E3 con una pipetta. Quindi aggiungere 50 ml di 0,2% MS-222 (tamponata a pH 7) e attendere 10 min.
- Rimuovere il MS-222 con una pipetta di trasferimento. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare per lavare la MS-222.
- Rimuovere il buffer E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 20 ml di 4% paraformaldeide (PFA) per fissare le larve. Agitare più volte piatto. Utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire le larve in una fiala di vetro lungo con abbastanza PFA per riempire il flacone. Conservare le fiale in frigorifero per una notte (O / N).
- Scatta foto di larve fisso con uno stereoscopio con una fotocamera digitale. Utilizzare 30X di ingrandimento, ISO 200, e 200 msec tempo di esposizione. Orientare le larve modo che anteriore alla left e dorsale è all'inizio del campo.
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Representative Results
L'esposizione a 300 mm di etanolo per 22 ore ha avuto alcun effetto sulla sopravvivenza (dati non mostrati), in linea con le precedenti relazioni 5,23,26. Questo è previsto, come l'etanolo è un teratogeno conosciuto e servito come controllo positivo. Fenotipi osservati inclusi edema pericardico, noninflation vescica natatoria (figura 1), difetti cranio-facciali e ritardo dello sviluppo (dati non riportati).
Il trattamento con il nitrito provocato lievi a gravi effetti sulla sopravvivenza, a seconda del tempo di esposizione. Ad esempio, l'esposizione a 1.000 mg / L per 94 hr sopravvivenza gravemente colpiti rispetto ai più brevi tempi di esposizione (Figura 2).
Abbiamo anche valutato l'effetto di diverse concentrazioni di nitrito sulla sopravvivenza. Gli embrioni sono stati esposti per 70 ore a 200, 400, 600, 800 e 1.000 mg / L. I tassi di sopravvivenza erano inferiori quando esposti ad alteconcentrazione di nitriti, nitrati, mentre non hanno avuto un effetto sulla sopravvivenza (figura 3). Fenotipi per larve nitriti trattati assomigliava a quella degli embrioni trattati etanolo (Figura 4).
Figura 1:. Effetti sullo sviluppo di etanolo trattamento embrioni trattati con etanolo ha mostrato edema pericardico (freccia), nuotare noninflation vescica (linea tratteggiata), edema sacco vitellino (punta di freccia), e difetti cranio-facciali (dati non riportati). Le immagini sono state scattate a 96 HPF. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Survival of 1.000 mg / l nitrito trattamento dopo diverse ore del Exposure. Gli embrioni sono stati esposti a 1.000 mg / l di nitriti a 2 HPF. Nitrito è stato lavato dopo 46, 70, e 94 ore di esposizione, e il tasso di sopravvivenza è stata calcolata. Aumento del tempo di esposizione ha portato il tasso di sopravvivenza è diminuito. Le deviazioni standard: non trattati = 24; 46 hr = 6; 70 hr = 6; 94 hr = 0,9. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. La sopravvivenza dopo esposizione a diversi concentrazione di nitriti Gli embrioni sono stati esposti per 70 ore a concentrazioni crescenti di nitriti. Concentrazioni più elevate di nitriti portato a tassi di sopravvivenza inferiori. Il nitrato non ha avuto effetto anche a più alta concentrazione di 1000 mg / L dopo l'esposizione per 70 ore. deviazioni standard per nitrito: non trattati = 19; 200 mg / L = 16; 400 mg / L = 21; 600 mg / L = 20; 800mg / L = 14; 1000 mg / L = 12. Deviazione standard per i nitrati è pari a 4. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Effetti sullo sviluppo di nitrati e nitriti embrioni trattati con 1000 mg / l di nitrati (pannello centrale) non ha avuto effetto rispetto al controllo non trattato (pannello superiore). trattamento nitrito a 1.000 mg / L determinato difetti di sviluppo lordi in aggiunta a fenotipi simili osservati nel trattamento etanolo (pannello inferiore). Le immagini sono state scattate a 120 HPF. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo descritto qui dimostra l'utilità di zebrafish nel valutare il potenziale teratogeno di nitriti e nitrati. Rispetto ad altri vertebrati, zebrafish hanno vantaggi che includono alta fecondità, fecondazione esterna, trasparenza ottica e rapido sviluppo. Mutanti disponibili che mancano di pigmentazione (come ad esempio il pesce zebra Casper 36) aiutano anche a migliorare la visibilità degli organi interni. E 'anche facile generare zebrafish transgenico con geni reporter per facilitare l'analisi di pesci vivi 37. Poiché il genoma zebrafish è conservata con gli esseri umani, le informazioni acquisite dai loro studi può condurre a risultati traslazionali negli esseri umani 9. Il metodo può essere applicato a analisi di espressione genica, come ibridazione in situ, per ottenere ulteriori informazioni sul misregulation di geni causate da teratogeni.
l'esposizione di etanolo non ha influenzato significativamente la sopravvivenza, ma ha causato madifetti rked simili a precedenti relazioni 5,23,26. Questo dimostra che il nostro metodo è affidabile nel ripetere risultati pubblicati. Nitrato ha avuto alcun effetto sulla sopravvivenza, mentre il nitrito ha avuto un effetto significativo a seconda della concentrazione e dal tempo di esposizione. Più esposizione e più alti livelli di nitriti hanno avuto un effetto negativo sulla sopravvivenza, in linea con i risultati precedenti 5. E 'stato recentemente dimostrato che l'esposizione nitriti eccessiva ha causato lo sviluppo della valvola cardiaca difettosa in zebrafish 27, convalidando l'uso di zebrafish per studiare il meccanismo di teratogeni.
E 'fondamentale per confermare le concentrazioni di soluzioni di lavoro dopo che sono state fatte. Le concentrazioni di nitrati e nitriti possono essere misurati con modificazioni della riduzione cadmio (US EPA Method 353.3) e diazotazione (US EPA Method 354.1) metodi spettrofotometrici, rispettivamente 28. Un altro passo importante è quello di coprire la piastra di Petri con Parafilm per ridurre al minimo evaporazione di etanolo se questo viene utilizzato come controllo positivo. Se le larve hanno mortalità inaspettati (troppo alte o troppo basse), controllare i calcoli e le concentrazioni delle soluzioni.
Recentemente, un metodo simile è stata utilizzata per determinare gli effetti teratogeni di etanolo 29. Anche se questo metodo è simile al nostro metodo qui, espone solo embrioni in etanolo fino a 24 ore, presumibilmente a causa della tossicità di esporre embrioni ad etanolo per un lungo periodo di tempo. Al contrario, il nostro metodo espone embrioni a nitrati e nitriti per diversi giorni con la sostituzione delle soluzioni di prova quotidiane. Ciò è vantaggioso per il test chimici meno tossici.
Immaginiamo che il nostro metodo può essere applicato per testare altri farmaci o condizioni ambientali specifiche. Tuttavia, questo metodo è limitato soltanto alle prove molecole idrosolubili. La sensibilità alla luce di alcune sostanze chimiche è un altro fattore da considerare. Se le sostanze chimiche di prova sono Sensit luceive, avvolgere le piastre di Petri foglio d'alluminio per proteggerlo dalla luce. Inoltre, il metodo non è buono per testing dell'acqua prelevata da un ambiente specifico in quanto laboratorio zebrafish richiede condizioni particolari (come il pH e conducibilità) per lo sviluppo ottimale. Anche così, il pesce zebra serve come un modello positivo per determinare rapidamente difetti di sviluppo causati dal potenziale teratogeni.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DREL/2010 instrument | Hach | 26700-03 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| KIMAX glass Petri Dish | VWR | 89001-244 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| NitraVer 5 Nitrate Reagent | Hach | 14034-46 | |
| NitriVer 3 Nitrite Reagent | Hach | 14065-99 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 3-374-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| S6E stereomicroscope | Leica | 10446294 | |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | S343 | |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | S347 | |
| Transfer pipets | Laboratory Products Sales | L320072 | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-338B |
References
- Gilbert-Barness, E.
- Brent, R. L. The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years. Con Anom. 41 (1), 3-21 (2001).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E. Zebrafish: an in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
- Pamanji, R., et al. Toxicity effects of profenofos on embryonic and larval development of zebrafish (Danio rerio). Environ Toxicol Pharmacol. 39 (2), 887-897 (2015).
- Simmons, A. E., Karimi, I., Talwar, M., Simmons, T. W. Effects of nitrite on development of embryos and early larval stages of the zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9 (4), 200-206 (2012).
- Mantecca, P., et al. Toxicity Evaluation of a New Zn-Doped CuO Nanocomposite With Highly Effective Antibacterial Properties. Toxicol Sci. , (2015).
- Jensen, F. B. Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish. J Exp Biol. 210, 3387-3394 (2007).
- Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing). Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- CDC. Spontaneous abortions possibly related to ingestion of nitrate-contaminated well water--LaGrange County, Indiana, 1991-1994. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 45 (26), 569-572 (1996).
- Brender, J. D., et al. Prenatal nitrate intake from drinking water and selected birth defects in offspring of participants in the national birth defects prevention study. Environ Health Perspect. 121 (9), 1083-1089 (2013).
- Huber, J. C., et al. Maternal dietary intake of nitrates, nitrites and nitrosamines and selected birth defects in offspring: a case-control study. Nutr J. 12, 34 (2013).
- Phillips, W. E. Naturally occurring nitrate and nitrite in foods in relation to infant methaemoglobinaemia. Food Cosmet Toxicol. 9 (2), 219-228 (1971).
- Moncada, S., Palmer, R. M., Higgs, E. A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev. 43 (2), 109-142 (1991).
- Gladwin, M. T., Crawford, J. H., Patel, R. P. The biochemistry of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin: role in blood flow regulation. Free Radic Biol Med. 36 (6), 707-717 (2004).
- Gupta, S. K., et al. Recurrent acute respiratory tract infections in areas with high nitrate concentrations in drinking water. Environ Health Perspect. 108 (4), 363-366 (2000).
- Kross, B. C., Ayebo, A. D., Fuortes, L. J. Methemoglobinemia: nitrate toxicity in rural America. Am Fam Physician. 46 (1), 183-188 (1992).
- Greer, F. R., Shannon, M. Infant methemoglobinemia: the role of dietary nitrate in food and water. Pediatrics. 116 (3), 784-786 (2005).
- Sanchez-Echaniz, J., Benito-Fernandez, J., Mintegui-Raso, S. Methemoglobinemia and consumption of vegetables in infants. Pediatrics. 107 (5), 1024-1028 (2001).
- Reregistration Eligibility Decision: Inorganic Nitrate/Nitrite (Sodium and Potassium Nitrates). , U.S. Environmental Protection Agency. Available from: http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/old_reds/4052red.pdf (1991).
- Virtanen, S. M., et al. Nitrate and nitrite intake and the risk for type 1 diabetes in Finnish children. Childhood Diabetes in Finland Study Group. Diabet Med. 11 (7), 656-662 (1994).
- Case Studies in Environmental Medicine: Nitrate/Nitrite Toxicity. , U.S. Agency for Toxic Substances and Diseases Registry. Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/HEC/CSEM/nitrate/docs/nitrate_nitrite.pdf (2001).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).
- Westerfield, M. The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
- Loucks, E., Carvan, M. J. Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).
- Bilotta, J., Barnett, J. A., Hancock, L., Saszik, S. Ethanol exposure alters zebrafish development: a novel model of fetal alcohol syndrome. Neurotoxicol Teratol. 26 (2), 737-743 (2004).
- Li, J., Jia, W., Zhao, Q. Excessive nitrite affects zebrafish valvulogenesis through yielding too much NO signaling. PLoS One. 9 (3), e92728 (2014).
- Methods for chemical analysis of water and wastes. , United States Environmental Protection Agency. Cincinnati, OH. Environmental Monitoring and Support Laboratory, Office of Research and Development (1983).
- Loucks, E., Ahlgren, S. Assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure. J Vis Exp. (61), (2012).
- Addiscott, T. M. Fertilizers and nitrate leaching. Agricultural Chemicals and the Environment, Issues in Environmental Science and Technology. , book 5 1-26 (1996).
- Su, Y. F., Lu, L. H., Hsu, T. H., Chang, S. L., Lin, R. T. Successful treatment of methemoglobinemia in an elderly couple with severe cyanosis: two case reports. Journal of Medical Case Reports. 6 (290), (2012).
- Harvey, M., Cave, G., Chanwai, G. Fatal methaemoglobinaemia induced by self-poisoning with sodium nitrite. Emergency Medicine Australasia. 22, 463-465 (2010).
- Nishiguchi, M., Nushida, H., Okudaira, N., Nishio, H. An autopsy case of fatal methemoglobinemia due to ingestion of sodium. Forensic Research. 6, (2015).
- Avdesh, A., Chen, M., Martin-Iverson, M. T., Mondal, A., Ong, D., Rainey-Smith, S., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
