Summary
teratojen Pozlama doğum kusurlarına neden olabilir. Balığı kimyasal teratojenik potansiyeli belirlemek için faydalıdır. Biz maruz kalma farklı zamanlarda da nitrit değişik düzeylerde embriyoların açığa tarafından zebrabalıkları yararını göstermektedir. Biz nitrit toksik ve ağır gelişimsel bozukluklara neden olduğunu göstermektedir.
Abstract
ortamda yüksek nitrat seviyeleri insanlardaki konjenital bozuklukların ve düşüklere neden olabilir. Tahminen bu bağırsak ve tükürük bakterilerin nitratın nitrite dönüştürülmesi kaynaklanmaktadır. fakir üreme sonuçlara yol açabilir Ancak, her ne diğer memeli çalışmalarda, yüksek nitrit düzeyleri, doğum kusurlarına neden yok. Böylece, nitrit teratojenik potansiyel açık değildir. Kolayca nitrit veya ilgi duyulan herhangi bir başka kimyasal teratojenik etkileri değerlendirmek için bir omurgalı bir model sistemi olması yararlı olacaktır. Burada, toksisite ve embriyonik kusurları için bileşiklerin taranması için zebrabalıkları (Danio rerio) kullanımını göstermektedir. Zebra balığı embriyolar onlara teratojenik çalışmalar için iyi bir model yapma, dışarıdan döllenmiş ve hızlı bir gelişme vardır. Biz olumsuz nitrite maruz kalma süresinin artması hayatta kalmasını etkilediğini göstermektedir. nitrat bunu yapmaz nitrit konsantrasyonunu arttırarak da olumsuz, hayatta kalma etkiler. Embriyoların tha içint nitrit poz hayatta, çeşitli kusurlar perikardial dahil oluşabilir ve mesane noninflation ve kraniofasial malformasyon yüzmek, sac ödem yolk. Sonuçlarımız zebra balığı nitrit teratojenik potansiyeli çalışmaları için uygun bir sistem olduğunu göstermektedir. Bu yaklaşım kolayca erken, omurgalı gelişimi üzerindeki etkileri, diğer kimyasal maddeler test etmek için uyarlanabilir.
Introduction
Teratojenez ağır vakalarda 1 kalıcı yapısal ve fonksiyonel anormallikler, büyüme geriliği, ya da düşük yapma yol açarak bir embriyo ya da ceninin normal gelişimini bozan bir süreçtir. Bu çeşitli şekillerde 2 embriyonik gelişim müdahale bazı doğal maddelerin (teratojenler), neden olabilir. insan fetal gelişim sırasında, radyasyon, enfeksiyöz ajanlar, toksik metaller ve organik kimyasallar gibi ortak teratojenler morfogenetik hatalar ile epicanthic kıvrımlar kusurları (üst göz kapağındaki deri kıvrımı) ve klinodaktili (kavisli parmak veya ayak) neden olduğu bildirilmiştir 1.
teratogenez moleküler mekanizmasını anlamak tedavi ve korunma geliştirilmesine yönelik ilk adımdır. Böyle Afrika gibi bazı omurgalı modeller terat etkilenen moleküler yolları belirlemek için kullanılır olmuştur kurbağa (Xenopus laevis) ve zebrafish (Danio rerio) pençeliogens. Önceki çalışmalar epidemiyolojisi, toksikoloji ve teratogenez 3-7 için bir model olarak zebrafish kullandık. Scholz ve diğ. Çevresel toksisite değerlendirmesi için bir "altın standart" olarak kabul zebrafish. Bu 8 olarak ortaya çıkar araştırmacılar gelişimsel defekti görüntülemenizi sağlar zebrafish embriyo, şeffaflık, kısmen, kaynaklanmaktadır. İnsan genlerinin yaklaşık% 70'i insan kusurları 9 çalışmak için Zebra balığı bir arzu omurgalı modeli yapma, zebrafish ortologlara var.
Diğer çalışmalar bu ilişkiyi 12 desteği yok iken bazı epidemiyolojik çalışmalar çiftlik gıdalar ve su yaygın olarak mevcut olduğu nitrat ve nitrit, sürmüşlerdir, doğum kusurlarına veya spontan abortus 10,11 ile ilişkilidir. Nitrat (NO 3 -) ve nitrit (NO 2 -) toprak ve su doğal olarak bulunur. Bu bitkiler için bir azot kaynağı ve bir N bir parçasıdıritrogen döngüsü 13. Böyle nitrat yüksek gübre kullanımı çiftlikleri yeşil fasulye, havuç, kabak, ıspanak, ve pancar gibi yiyecekler ölçüde nitrat ve nitrit 7 seviyelerini yükseltmiştir. (Özellikle toprak ikinci tur 30) yüksek nitrat suda yüksek nitrat gıdalar ve balık ile beslenen ineklerden elde edilen süt nitrat ve nitrit 14 büyük miktarda tüketen insanlarda yol açabilir. Nitrat ve nitrit de yaygın dramatik insanlar 12 ile yutulur miktarı artar gıda muhafaza, kullanılmaktadır.
Nitrat ve nitrit Optimal düzeyleri vasküler homeostaz ve fonksiyon, nörotransmisyon ve immünolojik konak savunma mekanizmaları 13-15 gibi fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynaması. Bununla birlikte, nitrat ve nitrit yüksek düzeyde maruz Özellikle bebeklerde ve çocuklarda 16, yan etkilere neden olabilir. Özeti Alınan nitrat mikroflorasının ve inci ağız boşluğunda nitrit da dönüştürüldüğübağırsak mikroflorası 17 e gastrointestinal sistem.
Nitrat yeteneği 18 taşıyan kendi oksijen hemoglobin zarar, methemoglobin hemoglobin oksidasyonu ile mavi bebek sendromu için yüksek risk altında bebeklerin koyar. Bu, daha şiddetli vakalarda periferal dokulara uzanan cilt mavi renk elde edilir. Diğer belirtiler dokular sonuçların inhibe oksijenasyonu, en ağır koma ve ölüm 19,20 yol açar. Benzer semptomlar nitrat 21 daha yüksek konsantrasyonlarda bebeklerde ve yetişkinlerde görülür. Yükseltilmiş nedeniyle siyanoz, baş ağrısı nitrit zehirlenmesi sonuçlarına erişkinlerde methemoglobin düzeyleri, solunum bozuklukları, 31 ve ölüm nedeniyle hayati doku hipoksisi 32,33 ilgili komplikasyonlar tedavi edilmediği takdirde.
daha yüksek seviyelerde yutulur nitrat, çeşitli sağlık komplikasyonlara neden olabilir. Çocukluk diyabet, tekrarlayan ishal ve tekrarlayan solunum yolu enfeksiyonlarıÇocuklarda yüksek nitrat alımı 11,17,22 ile bağlantılı olmuştur. nitrat yüksek düzeyde kronik maruz kalma idrar ve dalak kanaması ile ilişkilidir. Nitrat Akut yüksek doz maruz karın ağrısı, kas güçsüzlüğü, dışkı ve idrarda, bayılma kan ve ölüm 11 gibi tıbbi koşulları geniş bir yelpazede yol açabilir. Yüksek seviyelerde nitrata prenatal maruziyet nöral tüp ve kas-iskelet defekt 11 ile ilişkili olmuştur.
Yeni bir rapor nitrit ile zebrafish embriyolar tedavi kesesi ödem, kraniofasial ve eksenel malformasyonlar sarisi yol açtı, ve mesane noninflation 5 yüzmek olduğunu gösterdi. Bu çalışmada, kendi teratojenik potansiyeli belirlemek için nitrat ve nitrit ile zebra balığı embriyolar tedavi etmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Embriyolar, farklı konsantrasyonlarda ve farklı zaman uzunlukları nitrit maruz bırakılmıştır. Bu kurulu bir teratojen 23 olduğu Etanol, bir pozitif kontrol olarak kullanıldı. Our yöntem nitrit yüksek konsantrasyonlarda ve uzun pozlama süreleri hem hayatta zarar ve şiddetli (brüt gelişimsel kusurlar) hafif (ödem) arasında değişen çeşitli fenotipleri yol açtığını gösterdi. Bu nedenle, zebra balığı doğrudan epidemiyolojik çalışmalar tamamlamak için embriyolar üzerinde nitrat ve nitrit potansiyel teratojenik etkileri keşfetmek için bir modeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol açıklanan prosedürler Pennsylvania Indiana Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
1. Hasat Embriyolar
- 28.5 ° C, pH 7, 500-1,500 uS arasındaki iletkenlik zebrafish muhafaza ve 14 saat ışık ve 10 saat 24 ışıksız bir ışık / karanlık çevrimi. Böyle Tü, AB ya da Tü / AB melez olarak yabani tip suşlar kullanın. Farklı suşları kimyasal arıtma 25 farklı yanıt verebilir.
- Bir çiftleşme tankına balık sistem su ilave edilerek hasat yumurta önceki gece çiftleşme için balık ayarlayın. tanka bir erkek ve dişi balık ekleyin ve bir bölücü ile iki balık ayırın. Her balık çifti 50-300 yumurta bir dizi üretecek. bu yeterli yumurta balık 30 çift kurmak, üretilecek sağlamak. Tipik olarak, Başbakan çiftleşme yaşta balık çiftlerinin yaklaşık% 50 (6-9 aylık) 200 çifti başına yumurta ve 3'e kadar maksimum sonuçlanan yumurta üretecekBu deney için 000 yumurta.
- ışığı yanar sonra ertesi sabah, çiftleşme başlatmak için bölücü kaldırın. Yumurtalar için her 15 dakikada bir çiftleşme tankları kontrol edin.
- Balık yumurtalarını kez, bir çay süzgeci kullanarak tüm embriyolar hasat ve E3 tamponu (5 mM NaCl, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4) ile büyük bir kap içine bunları birleştirmek. 1.5 hpf, kaldırmak ve bir mikroskop altında plastik bir transfer pipet ile döllenmemiş yumurta atmak. Döllenmiş yumurtalar 34 şeffaf ise döllenmemiş yumurtalar opak bulunmaktadır.
- Her bir tedavi durumu için 50 mi E3 tamponu ihtiva eden bir 100 x 15 mm ebadındaki bir cam Petri kabı içine başına 50 embriyo. 33 yemekleri toplam 11 tedavi koşulları ve 3 tekerrürlü için gereklidir.
2. Şifalı Embriyolar
- 2 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 35 bakımları yürütmek. 28.5 ° C embriyolar / larvaları inkübe ve 120 hpf larvaları inceleyin. lea gerçekleştirmekst İstatistiksel analiz için her tedavi durumun üç suret.
- 2 HPF 3 Petri kapları (her biri 50 embriyo) için bir transfer pipetiyle E3 tamponunu çıkarın ve E3 tamponu içinde seyreltilmiş 300 mM 50 ml etanol ekleyin. etanol buharlaşmasını en aza indirmek için Parafilm ile Petri kapları örtün.
- 22 saat boyunca etanol embriyolar maruz devam edin. Sonra bir transfer pipet ile etanol çıkarın. E3 tampon 50 ml ekleyin ve etanol yıkamak için çanak birkaç kez girdap. Bir transfer pipet ile bu E3 tamponu çıkarın ve yıkama adım 2 kez daha tekrarlayın.
- 2 HPF 3 Petri kapları (her biri 50 embriyo) için bir transfer pipetiyle E3 tamponunu çıkarın ve yeni bir E3 tamponu 50 ilave edin.
- 2 hpf 9 Petri kapları (her biri 50 embriyo) için bir transfer pipetiyle E3 tamponunu çıkarın ve E3 tamponu içinde çözülmüş 1.000 mg / l sodyum nitrit 50 ilave edin. Önceden kullanarak stok nitrit çözeltisinin konsantrasyonu onaylayındiyazotizasyonda modifikasyonu (USEPA Yöntem 354.1) spektrofotometrik yöntem 28.
- 46 saat 3 yemekler, 70 saat boyunca 3 yemekler ve 94 saat süreyle 3 yemekler açığa devam edin. günlük taze yapılmış nitrit çözeltisi ile nitrit çözeltisi değiştirin.
- Her maruziyet süresinden sonra, bir transfer pipet ile Nitrit çıkarın. E3 tampon 50 ml ekleyin ve nitrit yıkamak için çanak birkaç kez girdap. Bir transfer pipet ile bu E3 tamponu çıkarın ve yıkama adım 2 kez daha tekrarlayın.
- 2 HPF 3 Petri kapları (her biri 50 embriyo) için bir transfer pipetiyle E3 tamponunu çıkarın ve 200 mg / L sodyum nitrit 50 ilave edin. 400, 600, 800 ile bu işlemi tekrarlayın ve sodyum nitrit 1,000 mg / L.
- 70 saat süre ile nitrite embriyolar maruz devam edin. günlük taze yapılmış nitrit çözeltisi ile nitrit çözeltisi değiştirin.
- pozlama süresinden sonra, bir transfer pipet ile Nitrit çıkarın. E3 tampon 50 ml ekleyin ve birkaç çanak girdapzaman nitrit yıkayın. Bir transfer pipet ile bu E3 tamponu çıkarın ve yıkama adım 2 kez daha tekrarlayın.
- 2 HPF 3 Petri kapları (her biri 50 embriyo) için bir transfer pipetiyle E3 tamponunu çıkarın ve E3 tamponu içinde çözülmüş 1.000 mg / L sodyum nitrat 50 ml ekleyin. Kadmiyum indirgeme (USEPA Yöntem 353.3) spektrofotometrik 28 bir modifikasyonu kullanılarak, önceden hazır nitrat çözeltisi konsantrasyonunu kontrol edin.
- 70 saat boyunca nitrata embriyolar maruz devam edin. günlük taze yapılmış nitrat çözeltisi ile nitrat çözeltisi değiştirin.
- pozlama süresinden sonra, bir transfer pipet ile nitratı temizler. E3 tampon 50 ml ekleyin ve nitrat yıkamak için çanak birkaç kez girdap. Bir transfer pipet ile bu E3 tamponu çıkarın ve yıkama adım 2 kez daha tekrarlayın.
- maruziyet her gün boyunca, bir stereomikroskopta kullanarak ölü embriyo / larvaların sayısını. Ölüm İşaretlerkalp atışı eksikliği ve kan dolaşımını, ya da gözlem 1 dakika sonra hareketlilik eksikliği sayılabilir. E3 tampon kirlenmesini azaltmak için bir transfer pipet ile ölü embriyolar / larva çıkarın.
- Deneyler 120 hpf bittiğinde, larva euthanize.
- Bir transfer pipet ile E3 tamponu çıkarın. Daha sonra, (pH 7 tamponlanmış)% 0.2, MS-222, 50 ml ilave edilir ve 10 dakika boyunca bekleyin.
- Bir transfer pipet ile MS-222 çıkarın. MS-222 yıkamak için E3 tampon ve girdap 50 ml ekleyin.
- Bir transfer pipet ile E3 tamponu çıkarın ve larvaları düzeltmek için% 4 paraformaldehid (PFA) 20 ml ekleyin. çanak birkaç kez girdap. şişeyi doldurmak için yeterli PFA ile birlikte bir cam şişenin içine larva aktarmak için bir aktarma pipeti kullanarak. gece buzdolabında şişeleri (O / N) saklayın.
- Bir dijital kamera ile Stereoskop kullanarak sabit larva fotoğraf çekmek. 30X büyütme, ISO 200 ve 200 msn pozlama süresini kullanın. larvaları yönlendirmek böylece le anteriorft ve dorsal alanının üst etmektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
22 saat süre ile, 300 mM etanol maruz önceki raporlarda 5,23,26 tutarlı sağkalım (veriler gösterilmemiştir), üzerinde herhangi bir etki. etanol, bilinen bir teratojen ve pozitif kontrol olarak hizmet gibi bu beklenir. Gözlenen fenotipleri perikardiyal ödem, yüzme kesesi noninflation (Şekil 1), kraniofasyal kusurları ve gelişimsel gecikme (veriler gösterilmemiştir) dahil.
nitrit ile muamele maruz kalma süresine bağlı olarak, hayatta kalma üzerinde ciddi etkileri, hafif sonuçlanmıştır. Örneğin, 94 saat ciddi etkilenmiş hayatta kalmak için poz 1.000 mg / L daha kısa pozlama süreleri (Şekil 2) karşılaştırıldı.
Biz de hayatta kalma farklı nitrit konsantrasyonlarının etkisi değerlendirildi. Embriyolar 200 70 saat, 400, 600, 800 ve 1000 mg / L maruz bırakılmıştır. yüksek maruz kaldığında sağkalım oranları düşüktüsağkalım üzerinde bir etkisi yoktu nitrat ise nitrit konsantrasyonları, (Şekil 3). Nitrit ile muamele edilmiş larva fenotiplerinin (Şekil 4) etanol muamele edilmiş embriyoların benziyordu.
Şekil 1:., Etanol ile işlemden geçirildi Etanol tedavi Embriyolar Gelişim etkileri mesanenin noninflation (kesikli çizgi), yolk kesesi ödem (ok başı) ve kraniofasial kusurları (veriler gösterilmemiştir), yüzün, perikardiyal ödem (ok) göstermiştir. Görüntüler 96 hpf alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Exposé Farklı Times sonra 1,000 mg Survival / L Nitrit Tedavisiure. Embriyolar 2 hpf 1,000 mg / L nitrit maruz bırakıldı. Nitrit maruziyet 46, 70 ve 94 saat sonra yıkandı ve hayatta kalma oranı hesaplandı. Artan maruz kalma süresi azalmış sağkalım sonuçlandı. Standart sapmalar: = 24 İşlenmemiş; 46 saat = 6; 70 saat = 6; 94 saat = 0.9. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Farklı nitrit maruz kaldıktan sonra hayatta kalma Embriyolar nitrit artan konsantrasyonları 70 saat boyunca tabi tutulmuştur. nitrit yüksek konsantrasyonlarda düşük sağkalım oranları sonuçlandı. Nitrat, hatta 70 saat boyunca maruz bırakıldıktan sonra 1000 mg / L arasında en yüksek konsantrasyonda hiç bir etkisi yoktu. nitrit standart sapmalar: = 19 İşlenmemiş; 200 mg / L = 16; 400 mg / L = 21; 600 mg / L = 20; 800mg / L = 14; 1,000 mg / L = nitrat 12. Standart sapma 4. eşittir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Nitrat ve nitrit Embriyolar Gelişim etkileri 1,000 mg / L nitrat (orta panel) ile muamele, muamele edilmemiş kontrola (üst panel) ile karşılaştırıldığında hiçbir etki yapmamıştır. 1.000 mg / L nitrit tedavisi etanol tedavisi (alt panel) gözlenen benzer fenotiplere ek olarak büyük gelişimsel kusurlar ile sonuçlanmıştır. Görüntüler 120 hpf alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan yöntemi nitrit ve nitrat teratojenik potansiyelini değerlendirirken zebrafish faydasını ortaya koyar. diğer omurgalılar ile karşılaştırıldığında, Zebra balığı yüksek doğurganlığını, dış döllenme, optik şeffaflık ve hızlı bir gelişme içeren avantajlara sahip. (Örneğin casper zebrabalıkları 36 gibi) pigmentasyon eksikliği mevcut mutantlar da iç organların görünürlüğünü artırmak için yardımcı olur. Ayrıca, canlı balık 37 analizini kolaylaştırmak için raportör genlerine sahip transgenik zebrafish oluşturmak kolaydır. Zebra balığı genom insanlar ile korunduğu için, onların çalışmalarından elde edilen bilgiler insanlarda 9 translasyonel sonuçlara yol açabilir. Yöntem, teratojenler kaynaklanan genlerin yanlış ile ilgili ek bilgiler elde etmek için, bu gibi in situ melezleme gibi gen ekspresyon analizi uygulanabilir.
Etanol maruz sağkalımı anlamlı etkilemedi, ancak ma neden vermediDaha önceki raporlarda 5,23,26 benzer rked bozukluklar. Bu bizim yöntem yayınlanan sonuçları tekrarlayarak güvenilir olduğunu göstermektedir. nitrit önemli bir konsantrasyon ve maruz kalma süresine bağlı olarak etkileyecek var mıydı oysa Nitrat, sağkalım üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır. Daha uzun maruz kalma ve nitrit daha yüksek seviyelerde daha önceki sonuçlar 5 ile uyumlu sağkalım üzerinde olumsuz bir etkisi vardı. Son zamanlarda aşırı nitrit maruz Teratojenlerle mekanizmasını incelemek için Zebra balığı kullanımını doğrularken, Zebra balığı 27 kusurlu kalp kapak gelişimini neden olduğu gösterilmiştir.
Da yapılır sonra çalışma konsantrasyonlar teyit etmek için kritiktir. Nitrat ve nitrit konsantrasyonları, kadmiyum indirgeme modifikasyonlarını (USEPA Yöntem 353.3) ve diazotizasyon (USEPA Yöntem 354.1) spektrofotometrik sırasıyla 28 kullanılarak ölçülebilir. Diğer önemli adım buharlaştırılmaktadır en aza indirmek için Parafilm ile Petri plaka kapsayacak şekildeetanol oranı, bu bir pozitif kontrol olarak kullanıldığında. Larvalar (çok yüksek veya çok düşük) beklenmedik ölümleri varsa, çözümlerin hesaplamaları ve konsantrasyonları çift kontrol edin.
Son zamanlarda, benzer bir yöntem etanol 29 teratojenik etkileri belirlemek için kullanılmıştır. Bu yöntem, burada yöntem benzer olmasına rağmen, sadece tahminen bu, uzun bir süre için etanol embriyolar ortaya toksisitesi, en fazla 24 saat boyunca etanol embriyolar ortaya çıkarır. Buna karşılık, bizim metot günlük deneme çözümleri değiştirme ile birkaç gün nitrat ve nitrit embriyolar ortaya çıkarır. Bu, daha az toksik kimyasal maddelerin ölçülmesine yönelik avantajlıdır.
Bizim yöntem diğer ilaçlar ya da belirli çevresel koşullar test etmek için uygulanabilir olduğunu öngörülüyor. Bununla birlikte, bu yöntem sadece suda çözünür moleküller test sınırlıdır. Bazı kimyasalların ışık hassasiyeti dikkate başka bir faktördür. Test kimyasalları hafif Sensit isenizive ışıktan korumak için aliminyum folyoya Petri kapları sarın. Ayrıca, yöntem laboratuvar Zebra balığı optimum gelişimi için (örneğin pH ve iletkenlik gibi) belirli koşulları gerektirdiğinden, belirli bir ortamda alınan test suyu için iyi değil. Öyle olsa bile, zebra balığı hızla potansiyel Teratojenlerle neden gelişimsel kusurları belirlemek için olumlu bir model olarak hizmet vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DREL/2010 instrument | Hach | 26700-03 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| KIMAX glass Petri Dish | VWR | 89001-244 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| NitraVer 5 Nitrate Reagent | Hach | 14034-46 | |
| NitriVer 3 Nitrite Reagent | Hach | 14065-99 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 3-374-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| S6E stereomicroscope | Leica | 10446294 | |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | S343 | |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | S347 | |
| Transfer pipets | Laboratory Products Sales | L320072 | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-338B |
References
- Gilbert-Barness, E.
- Brent, R. L. The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years. Con Anom. 41 (1), 3-21 (2001).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E. Zebrafish: an in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
- Pamanji, R., et al. Toxicity effects of profenofos on embryonic and larval development of zebrafish (Danio rerio). Environ Toxicol Pharmacol. 39 (2), 887-897 (2015).
- Simmons, A. E., Karimi, I., Talwar, M., Simmons, T. W. Effects of nitrite on development of embryos and early larval stages of the zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9 (4), 200-206 (2012).
- Mantecca, P., et al. Toxicity Evaluation of a New Zn-Doped CuO Nanocomposite With Highly Effective Antibacterial Properties. Toxicol Sci. , (2015).
- Jensen, F. B. Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish. J Exp Biol. 210, 3387-3394 (2007).
- Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing). Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- CDC. Spontaneous abortions possibly related to ingestion of nitrate-contaminated well water--LaGrange County, Indiana, 1991-1994. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 45 (26), 569-572 (1996).
- Brender, J. D., et al. Prenatal nitrate intake from drinking water and selected birth defects in offspring of participants in the national birth defects prevention study. Environ Health Perspect. 121 (9), 1083-1089 (2013).
- Huber, J. C., et al. Maternal dietary intake of nitrates, nitrites and nitrosamines and selected birth defects in offspring: a case-control study. Nutr J. 12, 34 (2013).
- Phillips, W. E. Naturally occurring nitrate and nitrite in foods in relation to infant methaemoglobinaemia. Food Cosmet Toxicol. 9 (2), 219-228 (1971).
- Moncada, S., Palmer, R. M., Higgs, E. A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev. 43 (2), 109-142 (1991).
- Gladwin, M. T., Crawford, J. H., Patel, R. P. The biochemistry of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin: role in blood flow regulation. Free Radic Biol Med. 36 (6), 707-717 (2004).
- Gupta, S. K., et al. Recurrent acute respiratory tract infections in areas with high nitrate concentrations in drinking water. Environ Health Perspect. 108 (4), 363-366 (2000).
- Kross, B. C., Ayebo, A. D., Fuortes, L. J. Methemoglobinemia: nitrate toxicity in rural America. Am Fam Physician. 46 (1), 183-188 (1992).
- Greer, F. R., Shannon, M. Infant methemoglobinemia: the role of dietary nitrate in food and water. Pediatrics. 116 (3), 784-786 (2005).
- Sanchez-Echaniz, J., Benito-Fernandez, J., Mintegui-Raso, S. Methemoglobinemia and consumption of vegetables in infants. Pediatrics. 107 (5), 1024-1028 (2001).
- Reregistration Eligibility Decision: Inorganic Nitrate/Nitrite (Sodium and Potassium Nitrates). , U.S. Environmental Protection Agency. Available from: http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/old_reds/4052red.pdf (1991).
- Virtanen, S. M., et al. Nitrate and nitrite intake and the risk for type 1 diabetes in Finnish children. Childhood Diabetes in Finland Study Group. Diabet Med. 11 (7), 656-662 (1994).
- Case Studies in Environmental Medicine: Nitrate/Nitrite Toxicity. , U.S. Agency for Toxic Substances and Diseases Registry. Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/HEC/CSEM/nitrate/docs/nitrate_nitrite.pdf (2001).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).
- Westerfield, M. The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
- Loucks, E., Carvan, M. J. Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).
- Bilotta, J., Barnett, J. A., Hancock, L., Saszik, S. Ethanol exposure alters zebrafish development: a novel model of fetal alcohol syndrome. Neurotoxicol Teratol. 26 (2), 737-743 (2004).
- Li, J., Jia, W., Zhao, Q. Excessive nitrite affects zebrafish valvulogenesis through yielding too much NO signaling. PLoS One. 9 (3), e92728 (2014).
- Methods for chemical analysis of water and wastes. , United States Environmental Protection Agency. Cincinnati, OH. Environmental Monitoring and Support Laboratory, Office of Research and Development (1983).
- Loucks, E., Ahlgren, S. Assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure. J Vis Exp. (61), (2012).
- Addiscott, T. M. Fertilizers and nitrate leaching. Agricultural Chemicals and the Environment, Issues in Environmental Science and Technology. , book 5 1-26 (1996).
- Su, Y. F., Lu, L. H., Hsu, T. H., Chang, S. L., Lin, R. T. Successful treatment of methemoglobinemia in an elderly couple with severe cyanosis: two case reports. Journal of Medical Case Reports. 6 (290), (2012).
- Harvey, M., Cave, G., Chanwai, G. Fatal methaemoglobinaemia induced by self-poisoning with sodium nitrite. Emergency Medicine Australasia. 22, 463-465 (2010).
- Nishiguchi, M., Nushida, H., Okudaira, N., Nishio, H. An autopsy case of fatal methemoglobinemia due to ingestion of sodium. Forensic Research. 6, (2015).
- Avdesh, A., Chen, M., Martin-Iverson, M. T., Mondal, A., Ong, D., Rainey-Smith, S., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
