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Immunology and Infection

Poisson zèbre comme modèle pour évaluer le potentiel tératogène de nitrite

Published: February 16, 2016 doi: 10.3791/53615
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Indiana University of Pennsylvania

Summary

L'exposition à des agents tératogènes peut causer des malformations congénitales. Poisson zèbre sont utiles pour déterminer le potentiel tératogène de produits chimiques. Nous démontrons l'utilité de poisson zèbre en exposant embryons à différents niveaux de nitrites et également à différents moments de l'exposition. Nous montrons que le nitrite peut être toxique et provoquer des anomalies graves du développement.

Abstract

Des niveaux élevés de nitrates dans l'environnement peut entraîner des malformations congénitales ou des fausses couches chez les humains. Vraisemblablement, cela est dû à la conversion des nitrates en nitrites par l'intestin et salivaires bactéries. Cependant, dans d'autres études sur les mammifères, les niveaux élevés de nitrite ne causent pas de malformations congénitales, même si elles peuvent conduire à des résultats en matière de reproduction pauvres. Ainsi, le potentiel tératogène de nitrite est pas claire. Il serait utile de disposer d'un système modèle vertébré afin d'évaluer facilement des effets tératogènes de nitrite ou tout autre produit chimique d'intérêt. Ici, nous démontrons l'utilité de poisson zèbre (Danio rerio) pour cribler des composés pour la toxicité et les défauts embryonnaires. embryons de poisson zèbre sont fécondés à l'extérieur et ont un développement rapide, ce qui en fait un bon modèle pour les études tératogènes. Nous montrons que l'augmentation du temps d'exposition au nitrite affecte négativement la survie. L'augmentation de la concentration de nitrite aussi affecte négativement la survie, alors que le nitrate ne fonctionne pas. Pour les embryons that survivre à l'exposition nitrite, différents défauts peuvent se produire, y compris péricardique et le jaune oedème sac, la vessie natatoire noninflation, et des malformations cranio-faciales. Nos résultats indiquent que le poisson zèbre est un système idéal pour étudier le potentiel tératogène du nitrite. Cette approche peut facilement être adapté pour tester d'autres produits chimiques pour leurs effets sur le développement des vertébrés tôt.

Introduction

Tératogenèse est un processus qui perturbe le développement normal de l'embryon ou le fœtus en provoquant des anomalies permanentes structurelles et fonctionnelles, un retard de croissance, ou une fausse couche dans les cas graves 1. Elle peut être causée par certains agents naturels (tératogènes) qui interfèrent avec le développement embryonnaire de multiples façons 2. Au cours du développement fœtal humain, tératogènes commun tels que le rayonnement, les agents infectieux, les métaux toxiques, et les produits chimiques organiques ont été rapportés pour causer des malformations à épicanthus (le pli de la peau dans la paupière supérieure) et clinodactylie (doigt courbe ou pieds) à travers les erreurs morphogénétiques 1.

La compréhension du mécanisme moléculaire de tératogenèse est la première étape vers le développement de traitement et de prévention. Plusieurs modèles vertébrés tels que l'Afrique récupérées grenouille (Xenopus laevis) et le poisson zèbre (Danio rerio) ont été utilisées pour déterminer les voies moléculaires touchées par teratOgens. Des études antérieures ont utilisé le poisson zèbre comme un modèle pour l'épidémiologie, de la toxicologie et de tératogenèse 3-7. Scholz et al. considéré comme le poisson zèbre comme un «étalon-or» pour l'évaluation de la toxicité pour l'environnement. Cela est dû, en partie, à la transparence de l'embryon de poisson zèbre, qui permet aux chercheurs de visualiser le défaut de développement comme il se produit 8. Environ 70% des gènes humains ont orthologues chez le poisson zèbre, ce qui rend le poisson-zèbre un modèle vertébré souhaitable pour étudier les défauts humains 9.

Certaines études épidémiologiques ont suggéré que le nitrate et nitrite, communément présents dans les aliments à la ferme et de l'eau, sont associés à des anomalies congénitales ou d'avortements spontanés 10,11, tandis que d'autres études ne prennent pas en charge cette association 12. Nitrate (NO 3 -) et le nitrite (NO 2 -) sont naturellement présents dans le sol et l'eau. Ils sont une source d'azote pour les plantes et sont une partie des nCycle itrogen 13. Les aliments tels que les haricots verts, les carottes, les courges, les épinards et les betteraves provenant de fermes qui utilisent des engrais riches en nitrate ont considérablement augmenté les niveaux de nitrates et de nitrites 7. Lait de vaches nourries avec des aliments à base de nitrate élevés et des poissons dans l'eau du nitrate élevé (principalement du ruissellement des sols 30) peut conduire à des humains qui consomment de grandes quantités de nitrates et de nitrites 14. Nitrates et nitrites sont également couramment utilisés dans la conservation des aliments, ce qui augmente considérablement la quantité ingérée par l'homme 12.

Des niveaux optimaux de nitrates et de nitrites jouent des rôles fondamentaux dans les processus physiologiques comme l'homéostasie vasculaire et la fonction, la neurotransmission et les mécanismes immunologiques de défense de l'hôte 13-15. Toutefois, l'exposition à des niveaux élevés de nitrates et de nitrites peut entraîner des effets indésirables, en particulier chez les nourrissons et les enfants 16. nitrate ingéré est en outre converti en nitrite dans la cavité buccale par la microflore et ee tractus gastro-intestinal par la microflore 17.

Nitrate met les nourrissons à haut risque pour le syndrome du bébé bleu par oxydation de l'hémoglobine en méthémoglobine, altérant l'hémoglobine de son transport d'oxygène capacité 18. Cela se traduit par la couleur bleue de la peau qui se prolonge vers les tissus périphériques dans les cas les plus graves. L'oxygénation des tissus inhibé résultats dans d'autres symptômes, plus gravement menant au coma et à la mort 19,20. Des symptômes similaires sont observés chez les bébés et les adultes à des concentrations plus élevées de nitrate 21. Des niveaux élevés de méthémoglobine chez les adultes en raison de résultats d'empoisonnement au nitrite dans une cyanose, des maux de tête, troubles respiratoires 31, et la mort si non traitées en raison de complications liées à une hypoxie tissulaire vitale 32,33.

Nitrate ingéré à des niveaux plus élevés peuvent également entraîner divers problèmes de santé. diabète infantile, diarrhée récurrente, et les infections des voies respiratoires récidivanteschez les enfants ont été liés avec une grande nitrate apport 11,17,22. L'exposition chronique à un niveau élevé de nitrate est associée à la miction et de la rate hémorragie. L'exposition aiguë à forte dose de nitrates peut conduire à un large éventail de conditions médicales telles que des douleurs abdominales, faiblesse musculaire, sang dans les selles et l'urine, l'évanouissement, et la mort 11. L'exposition prénatale à nitrate à des niveaux élevés a été associée à tube neural et défauts musculo-squelettique 11.

Un rapport récent a montré que le traitement des embryons de poisson zèbre avec nitrite conduit au jaune oedème sac, malformations cranio-faciales et axiales, et vessie natatoire noninflation 5. Dans cette étude, nous démontrons une méthode de traitement embryons de poisson zèbre avec du nitrate et du nitrite de déterminer leur potentiel tératogène. Les embryons ont été exposées à différentes concentrations de nitrite et à différentes périodes de temps. L'éthanol a été utilisé comme témoin positif, car il est un agent tératogène 23 établie. Our méthode a montré que les deux concentrations élevées et des temps d'exposition longs à nitrite étaient préjudiciables à la survie et ont donné lieu à divers phénotypes, allant de légère (œdème) de graves défauts de développement (bruts). Par conséquent, le poisson zèbre est un modèle utile pour explorer directement les effets tératogènes potentiels de nitrate et nitrite sur les embryons de compléter les études épidémiologiques.

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Protocol

Les procédures décrites dans ce protocole a été approuvé par le Comité de protection des animaux et institutionnel à la Indiana University of Pennsylvania.

1. Récolte embryons

  1. Maintenir le poisson zèbre à 28,5 ° C, pH 7, conductivité entre 500-1500 uS, et un cycle lumière / obscurité de 14 heures de lumière et 10 h 24 foncé. Utiliser des souches de type sauvage tels que TU, AB ou TU / AB hybride. Différentes souches peuvent réagir différemment à un traitement chimique 25.
  2. Mettre en place le poisson pour accoupler la veille oeufs de récolte par addition d'eau du système de poisson dans un réservoir d'accouplement. Ajouter un poissons mâles et femelles dans le réservoir et séparer les deux poissons avec un diviseur. Chaque paire de poisson va produire une gamme de 50-300 oeufs. Pour veiller à ce que suffisamment d'oeufs seront produits, mis en place 30 paires de poissons. Typiquement, environ 50% des paires de poissons à l'âge de l'accouplement d'entraînement (6-9 mois) va produire des œufs, résultant jusqu'à 200 œufs par paire et un maximum de jusqu'à 3000 oeufs pour cette expérience.
  3. Le lendemain matin, après que la lumière met en marche, enlever le diviseur de lancer l'accouplement. Vérifiez les réservoirs d'accouplement pour les œufs toutes les 15 min.
  4. Une fois que les poissons pondent des œufs, récolter tous les embryons en utilisant une passoire à thé et les combiner en un grand récipient avec un tampon E3 (NaCl 5 mM, KCl 0,17, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO 4). À 1,5 HPF, enlever et jeter des œufs non fécondés avec une pipette de transfert en plastique sous un microscope à dissection. Les œufs non fécondés sont opaques alors que les œufs fécondés sont transparents 34.
  5. 50 transfert des embryons dans une boîte de Pétri de 100 x 15 mm en verre contenant 50 ml de tampon E3 pour chaque condition de traitement. Un total de 33 plats sont nécessaires pour 11 conditions de traitement et 3 répétitions.

2. Les embryons Traitement

  1. Effectuer des traitements à 2 heures après la fécondation (HPF) 35. Incuber embryons / larves à 28,5 ° C et examiner les larves à 120 HPF. Effectuer au least trois répliques de chaque condition de traitement pour l'analyse statistique.
  2. Pour 3 boîtes de Pétri (contenant chacun 50 embryons) à 2 HPF, éliminer le tampon E3 avec une pipette de transfert et ajouter 50 ml de 300 mM éthanol dilué dans du tampon E3. Couvrir les boîtes de Pétri avec Parafilm pour minimiser l'évaporation de l'éthanol.
    1. Continuez d'exposer les embryons à l'éthanol pendant 22 heures. Puis éliminer l'éthanol avec une pipette de transfert. Ajouter 50 ml de tampon E3 et agiter le plat plusieurs fois pour laver l'éthanol. Retirer ce tampon E3 avec une pipette de transfert et répéter l'étape de lavage 2 fois plus.
  3. Pour 3 boîtes de Pétri (contenant chacun 50 embryons) à 2 HPF, éliminer le tampon E3 avec une pipette de transfert et ajouter 50 ml de nouveau tampon E3.
  4. Pour 9 des boîtes de Pétri (contenant chacun 50 embryons) à 2 HPF, éliminer le tampon E3 avec une pipette de transfert et ajouter 50 ml de 1,000 mg / L de nitrite de sodium dissous dans un tampon E3. Confirmer la concentration de la solution mère de nitrite en utilisant une avancemodification de la diazotation (EPA Méthode 354.1) Méthode spectrophotométrique 28.
    1. Continuez d'exposer 3 plats pour 46 h, 3 plats pour 70 h et 3 plats pour 94 h. Remplacer la solution de nitrite avec une solution de nitrite fraîchement préparé chaque jour.
    2. Après chaque temps d'exposition, retirez le nitrite avec une pipette de transfert. Ajouter 50 ml de tampon E3 et agiter le plat plusieurs fois pour laver le nitrite. Retirer ce tampon E3 avec une pipette de transfert et répéter l'étape de lavage 2 fois plus.
  5. Pour 3 boîtes de Pétri (contenant chacun 50 embryons) à 2 HPF, éliminer le tampon E3 avec une pipette de transfert et ajouter 50 ml de 200 mg / L de nitrite de sodium. Répéter ceci avec 400, 600, 800 et 1000 mg / l de nitrite de sodium.
    1. Continuez d'exposer les embryons en nitrite pendant 70 heures. Remplacer la solution de nitrite avec une solution de nitrite fraîchement préparé chaque jour.
    2. Après le temps d'exposition, retirez le nitrite avec une pipette de transfert. Ajouter 50 ml de tampon E3 et agiter le plat plusieursfois pour laver le nitrite. Retirer ce tampon E3 avec une pipette de transfert et répéter l'étape de lavage 2 fois plus.
  6. Pour 3 boîtes de Pétri (contenant chacun 50 embryons) à 2 HPF, éliminer le tampon E3 avec une pipette de transfert et ajouter 50 ml de 1,000 mg / L de nitrate de sodium dissous dans un tampon E3. Confirmer la concentration de la solution mère de nitrate d'avance en utilisant une modification de la réduction de cadmium (EPA Méthode 353.3) de la méthode de spectrophotométrie 28.
    1. Continuez d'exposer les embryons en nitrate pendant 70 heures. Remplacer la solution de nitrate avec une solution de nitrate fraîchement préparé chaque jour.
    2. Après le temps d'exposition, enlever le nitrate avec une pipette de transfert. Ajouter 50 ml de tampon E3 et agiter le plat plusieurs fois pour laver le nitrate. Retirer ce tampon E3 avec une pipette de transfert et répéter l'étape de lavage 2 fois plus.
  7. Au cours de chaque jour de l'exposition, compter le nombre de morts embryon / larves à l'aide d'un stéréomicroscope. Les signes de la mortinclure le manque de rythme cardiaque et la circulation sanguine, ou le manque de motilité après 1 min d'observation. Retirer morts embryons / larves avec une pipette de transfert pour réduire la contamination du tampon E3.
  8. Lorsque expériences finissent à 120 HPF, euthanasier les larves.
    1. Retirer le tampon E3 avec une pipette de transfert. Ajouter ensuite 50 ml de 0,2% MS-222 (tamponnée à pH 7) et attendre 10 min.
    2. Retirez le MS-222 avec une pipette de transfert. Ajouter 50 ml de tampon E3 et agiter pour laver le MS-222.
    3. Retirer le tampon E3 avec une pipette de transfert et ajouter 20 ml de paraformaldéhyde 4% (PFA) pour fixer les larves. Agiter le plat à plusieurs reprises. Utiliser une pipette de transfert pour transférer les larves dans un flacon en verre avec suffisamment PFA pour remplir le flacon. Conserver les flacons dans le réfrigérateur pendant une nuit (O / N).
  9. Prenez des photos de larves fixe à l'aide d'un stéréoscope avec un appareil photo numérique. Utilisez 30X grossissement, ISO 200, et 200 ms de temps d'exposition. Orienter les larves de telle sorte que la partie antérieure de l'left et la dorsale est en haut du champ.

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Representative Results

L'exposition à 300 mM éthanol pendant 22 heures n'a eu aucun effet sur ​​la survie (données non présentées), en accord avec les rapports précédents 5,23,26. Ceci est prévu, comme l'éthanol est un tératogène connu et a servi de témoin positif. Phénotypes observés comprenaient œdème péricardique, vessie natatoire noninflation (Figure 1), des anomalies cranio-faciales, et un retard de développement (données non présentées).

Le traitement avec du nitrite entraîné légère à de graves effets sur la survie en fonction du temps d'exposition. Par exemple, l'exposition à 1,000 mg / L pour 94 h survie gravement touchés par rapport à la réduction des temps d'exposition (figure 2).

Nous avons également évalué l'effet de différentes concentrations de nitrite sur la survie. Les embryons ont été exposés pendant 70 h à 200, 400, 600, 800 et 1000 mg / L. Les taux de survie sont plus faibles lorsqu'ils sont exposés à une forteconcentrations de nitrite, nitrate alors ne pas avoir d'effet sur ​​la survie (figure 3). Phénotypes pour les larves de nitrite traité ressemblait à celle de l'éthanol embryons traités (Figure 4).

Figure 1
Figure 1:. Effets sur le développement de traitements éthanol embryons traités avec de l'éthanol a révélé un œdème péricardique (flèche), la vessie natatoire noninflation (en pointillés), la vésicule ombilicale oedème (pointe de flèche), et les défauts cranio-faciales (données non présentées). Les images ont été prises à 96 HPF. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Survival of 1,000 mg / L Traitement nitrite après différents temps de Exposure. Les embryons ont été exposés à 1,000 mg / L de nitrite à 2 HPF. Nitrite a été lavé après 46, 70, et 94 heures d'exposition, et le taux de survie a été calculé. temps d'exposition accrue a entraîné le taux de survie diminué. Les écarts-types: non traités = 24; 46 h = 6; 70 h = 6; 94 h = 0,9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. La survie après exposition à différentes concentrations de nitrite embryons ont été exposés pendant 70 heures à des concentrations de nitrite de plus en plus. De plus fortes concentrations de nitrite ont donné lieu à des taux de survie inférieurs. Nitrate n'a eu aucun effet, même à la plus forte concentration de 1,000 mg / L après une exposition pendant 70 heures. Les écarts-types de nitrite: non traités = 19; 200 mg / L = 16; 400 mg / L = 21; 600 mg / L = 20; 800mg / L = 14; 1,000 mg / L = 12. L'écart-type pour le nitrate est égal à 4. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4:. Effets sur le développement de nitrates et de nitrites embryons traités avec 1,000 mg / L de nitrate (panneau du milieu) n'a eu aucun effet par rapport au témoin non traité (en haut). traitement nitrite à 1,000 mg / L a entraîné des défauts graves de développement, en plus de phénotypes similaires observés dans le traitement de l'éthanol (panneau du bas). Les images ont été prises à 120 HPF. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La méthode décrite ici démontre l'utilité de poisson zèbre pour évaluer le potentiel tératogène de nitrites et nitrates. Comparé à d'autres vertébrés, le poisson zèbre ont des avantages qui incluent des taux de fécondité élevé, fécondation externe, la transparence optique, et le développement rapide. Mutants disponibles qui manquent de pigmentation (comme le poisson zèbre casper 36) contribuent également à améliorer la visibilité des organes internes. Il est également facile de générer de poisson zèbre transgénique avec des gènes rapporteurs pour faciliter l'analyse des poissons vivants 37. Parce que le génome du poisson zèbre est conservée avec les humains, les informations obtenues à partir de leurs études peut conduire à des résultats de traduction chez les humains 9. Le procédé peut être appliqué à l'analyse d'expression génique, telles que l'hybridation in situ, pour obtenir des informations supplémentaires concernant la dérégulation des gènes causées par tératogènes.

exposition à l'éthanol n'a pas affecté significativement la survie, mais il ne provoque madéfauts rked similaires aux précédents rapports 5,23,26. Cela démontre que notre méthode est fiable à répéter les résultats publiés. Nitrate n'a eu aucun effet sur la survie, alors que le nitrite a eu un effet significatif de la concentration et du temps d'exposition. Une exposition plus longue et des niveaux plus élevés de nitrite ont eu un effet négatif sur la survie, en accord avec les résultats précédents 5. Il a été récemment montré que l'exposition au nitrite excessive a causé le développement de valve cardiaque défectueuse chez le poisson zèbre 27, validant l'utilisation du poisson zèbre pour étudier le mécanisme de tératogènes.

Il est essentiel de confirmer les concentrations de solutions de travail après leur création. Les concentrations de nitrates et de nitrites peuvent être mesurés en utilisant des modifications de la réduction du cadmium (EPA Method 353.3) et diazotation (EPA Method 354.1) méthodes spectrophotométriques, respectivement 28. Une autre étape importante est de couvrir la boîte de Pétri avec du Parafilm pour minimiser évaporation de l'éthanol si elle est utilisée en tant que témoin positif. Si les larves ont mortalités inattendues (trop élevées ou trop basses), double-vérifier les calculs et les concentrations des solutions.

Récemment, une méthode similaire a été utilisée pour déterminer les effets tératogènes de l'éthanol 29. Bien que ce procédé est similaire à notre procédé ici, on expose uniquement les embryons à l'éthanol jusqu'à 24 heures, sans doute en raison de la toxicité de l'exposition à l'éthanol embryons pendant une longue période de temps. En revanche, notre procédé expose à des embryons nitrate et de nitrite pendant plusieurs jours avec remplacement des solutions d'essai par jour. Ceci est avantageux pour les essais de produits chimiques moins toxiques.

Nous envisageons que notre procédé peut être appliqué pour tester d'autres médicaments ou des conditions environnementales spécifiques. Cependant, ce procédé est limité à tester des molécules solubles dans l'eau. La sensibilité à la lumière de certains produits chimiques est un autre facteur à considérer. Si des produits chimiques d'essai sont sensit lumièreive, envelopper les boîtes de Pétri dans une feuille d'aluminium pour le protéger de la lumière. En outre, la méthode est pas bon pour l'eau de test provenant d'un environnement spécifique parce laboratoire poisson zèbre nécessite des conditions spécifiques (tels que le pH et conductivité) pour un développement optimal. Même ainsi, le poisson zèbre est un modèle favorable à déterminer rapidement les défauts de développement causés par tératogènes potentiel.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DREL/2010 instrument Hach 26700-03
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
KIMAX glass Petri Dish VWR 89001-244
MS-222 Sigma-Aldrich E10521
NitraVer 5 Nitrate Reagent Hach 14034-46
NitriVer 3 Nitrite Reagent Hach 14065-99
Parafilm Fisher Scientific 3-374-10
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
S6E stereomicroscope Leica 10446294
Sodium nitrate Fisher Scientific S343
Sodium nitrite Fisher Scientific S347
Transfer pipets Laboratory Products Sales L320072
Glass vials Fisher Scientific 03-338B

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Keshari, V., Adeeb, B., Simmons, A.… More

Keshari, V., Adeeb, B., Simmons, A. E., Simmons, T. W., Diep, C. Q. Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite. J. Vis. Exp. (108), e53615, doi:10.3791/53615 (2016).

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