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Calcification vasculaire des cellules musculaires lisses et imagerie de Aortic calcification et Inflammation

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DOI :

10.3791/54017

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31 mai 2016

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1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology, Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La calcification vasculaire est un prédicteur important et un contributeur aux maladies cardiovasculaires humaines. Ce protocole décrit des méthodes pour induire la calcification de cellules musculaires lisses vasculaires primaires en culture et pour quantifier la calcification et la charge macrophage dans les aortes animales à l’aide de l’imagerie par fluorescence proche infrarouge.

Résumé

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde. Les plaques d’athérosclérose, constituées de macrophages chargés de lipides et de calcifications, se développent dans les artères coronaires, la valve aortique, l’aorte et les artères périphériques des conduits et sont la marque des maladies cardiovasculaires. Chez l’homme, l’imagerie par tomodensitométrie permet de quantifier la calcification vasculaire ; La présence d’une calcification vasculaire est un puissant prédicteur d’événements cardiovasculaires futurs. Le développement de nouvelles thérapies dans le domaine des maladies cardiovasculaires dépend essentiellement de l’amélioration de notre compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents de l’athérosclérose. L’avancement de nos connaissances sur les mécanismes de l’athérosclérose repose sur des modèles murins et cellulaires. Ici, une méthode d’imagerie de la calcification aortique et de l’infiltration de macrophages à l’aide de deux sondes d’imagerie fluorescente dans le proche infrarouge spectralement distinctes est détaillée. L’imagerie fluorescente dans le proche infrarouge permet de quantifier ex vivo la calcification et l’accumulation de macrophages dans l’ensemble de l’aorte et peut être utilisée pour approfondir notre compréhension de la relation mécaniste entre l’inflammation et la calcification dans l’athérosclérose. De plus, l’invention concerne un procédé d’isolement et de culture de cellules musculaires lisses vasculaires aortiques animales et un protocole permettant d’induire une calcification dans des cellules musculaires lisses cultivées à partir d’aortes murines ou d’artères coronaires humaines. Cette méthode in vitro de modélisation de la calcification vasculaire peut être utilisée pour identifier et caractériser les voies de signalisation probablement importantes pour le développement des maladies vasculaires, dans l’espoir de découvrir de nouvelles cibles pour le traitement.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde, y compris les États-Unis où elle représente plus de 780.000 décès par an. 1 calcification de l' artère coronaire et la calcification aortique sont les caractéristiques de la maladie athéroscléreuse et servent de solides prédicteurs d'événements cardiovasculaires. 2- 4 Deux principaux types de calcifications vasculaires ont été rapportés chez les adultes: calcification intimale, associée à l' athérosclérose, et médiale (également connu sous le nom Mönckeberg) calcification, associée à une maladie rénale chronique et le diabète 5 intimale calcification se produit dans le cadre de l' accumulation de lipides et de macrophage. infiltration dans la paroi du vaisseau. 5,6 Medial calcification murale se produit indépendamment de l' intima calcification, se localise dans les fibres d' élastine ou des cellules musculaires lisses, et n'est pas associé à un dépôt de lipides ou de l' infiltration des macrophages. 5,7,8 études sur les mécanismes moléculaires de lacalcification vasculaire se sont appuyés sur des systèmes modèles cellulaires et animaux. Modèles de rongeurs pour les maladies atherocalcific comprennent des souris déficientes en soit apolipoprotéine E (ApoE) 9,10 ou récepteur de lipoprotéines de basse densité (LDLR) 11 nourris avec un régime alimentaire riche en matières grasses, alors que les modèles pour la calcification médiale comprennent des souris avec la protéine matricielle Gla (MGP) déficit 12 ou rats qui développent urémie soit par néphrectomie totale près (le modèle de néphrectomie 5 / 6e) ou par exposition à un régime riche en adénine. 13

Ici, le modèle de la calcification vasculaire médiale associée à un déficit MGP se concentre sur. MGP est une protéine extracellulaire qui inhibe la calcification artérielle. 12 mutations du gène MGP ont été identifiés dans le syndrome Keutel, une maladie humaine rare caractérisée par diffuse calcification du cartilage en plus brachytéléphalangie, la perte auditive, et une sténose pulmonaire périphérique. 14-18 Bien que non souvent observé, 19calcification concentrique de plusieurs artères a été décrite dans le syndrome de Keutel. 20 polymorphismes communs dans le gène MGP humaine sont associés à un risque accru de calcification des artères coronaires, 21-23 tandis que les taux circulants plus élevés de MGP non carboxyle, biologiquement inactif prédire la mortalité cardiovasculaire. 24 Contrairement aux humains avec le syndrome de Keutel, les souris déficientes MGP développent un phénotype vasculaire sévère constitué de calcification artérielle spontanée généralisée à partir de deux semaines d'âge et de mourir 6-8 semaines après la naissance en raison de la rupture de l' aorte 12.

Contrairement à ApoE - / - et LDLR - / - souris nourris avec un régime riche en graisses, qui développent la calcification vasculaire intimale à l' inflammation induite par macrophage associée, MGP - / -. Souris développent une calcification vasculaire médial en l'absence d'infiltration macrophagique 11,25 Bien ces résultats suggèrent différents stimuli sous-jacents pour intimAl et une calcification médiane, il y a chevauchement des mécanismes de signalisation qui interviennent dans les deux formes de calcification. 26 De multiples voies de signalisation ont été identifiées qui contribuent à la calcification vasculaire , y compris des médiateurs inflammatoires tels que le facteur de nécrose tumorale-α et d' IL-1 et des facteurs pro-osteogenes tel que Notch, Wnt et une protéine morphogénétique osseuse (BMP) de signalisation 27,28 . Ces voies de signalisation augmentent l' expression des facteurs de transcription liés à runt-facteur de transcription 2 (Runx2) et osterix qui , à son tour , augmentent l' expression des protéines osseuses ( . par exemple, l' ostéocalcine, sclerostin, et la phosphatase alcaline) dans la vasculature que la médiation calcification 28-30 Nous et d' autres ont démontré que la calcification vasculaire observée dans ApoE - / - et LDLR - / - souris nourris avec un régime riche en graisses et spontanée calcification vasculaire observée dans MGP - / - souris dépendent tous de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) signaling, et il est cette voie qui se concentre sur ici. 11,25,31 PGB sont des facteurs ostéogéniques puissants nécessaires à la formation des os et sont connus pour présenter une expression accrue dans l' athérosclérose humaine. 32-34 Des études in vitro ont mis en cause la signalisation BMP dans la régulation l'expression de facteurs ostéogéniques tels que Runx2. 35-37 surexpression du ligand BMP, BMP-2, accélère le développement de la calcification vasculaire chez les souris déficientes en ApoE nourris avec un régime riche en graisses. 38 en outre, l'utilisation de BMP inhibiteurs spécifiques tels signalisation comme LDN-193189 (LDN) 39,40 et / ou Alk3-Fc empêche le développement de la calcification vasculaire dans les deux LDLR - / - souris nourris avec un régime riche en matières grasses et des souris déficientes MGP 11,25.

Les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) ont un rôle essentiel dans le développement de la calcification vasculaire. 30,41,42 La calcification vasculaire médial qui se développe dans la MGP-souris déficientes est caractérisée par une transdifférenciation des CMLV à un phénotype ostéogénique. Perte de résultats MGP en diminution de l'expression de marqueurs CMLV y compris myocardin et alpha actine musculaire lisse, avec une augmentation concomitante des marqueurs ostéogéniques tels que Runx2 et ostéopontine. Ces changements coïncident avec le développement de la calcification vasculaire. 25,43,44

La calcification de l' aorte et de l' inflammation chez les souris sont généralement évaluées en utilisant des techniques histochimiques comme l' activité de la phosphatase alcaline pour la calcification précoce et l' activité ostéogénique de von Kossa et Alizarine coloration rouge pour la fin de la calcification, et des protocoles d' immunohistochimie qui ciblent les marqueurs protéiques macrophage (par ex., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 Toutefois, ces techniques d'imagerie standard nécessite le traitement des tissus aortiques dans des sections transversales, ce qui prend du temps et imparfait dû à un biais d'échantillonnage, et sont limitées dans leur capacité à quantifier l'inflammation et calcifications dans l'ensemble de l'aorte. Ce protocole décrit un procédé pour visualiser et de quantifier la calcification artérielle aortique et moyennes ensemble et l' accumulation de macrophages en utilisant fluorescent dans le proche infrarouge (NIR) d'imagerie moléculaire ex vivo. L' invention concerne également un procédé pour la récolte et la mise en culture CMLV aortiques primaires de souris et l' induction de la calcification de murin et CMLV humains in vitro afin de déterminer les mécanismes moléculaires sous - jacents vasculaire calcification. Ces techniques permettent l'investigateur à la fois in vivo et in vitro , des méthodes d'étude des maladies atherocalcific.

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Protocole

Toutes les études avec des souris ont été effectuées en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Logement et toutes les procédures impliquant des souris décrites dans cette étude ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et l'utilisation des comités de l'Hôpital général du Massachusetts (Sous-comité sur la recherche de protection des animaux). Toutes les procédures ont été réalisées avec soin pour minimiser la souffrance.

1. Préparation des réactifs

  1. Near-Infrared Imaging Fluorescence de Whole aortes
    Remarque:. Un bisphosphonate dérivé, dans le proche infrarouge sonde d'imagerie par fluorescence peut être utilisée pour marquer une activité ostéogénique dans le système vasculaire par liaison à l' hydroxyapatite 46,47 Sonde d'imagerie de fluorescence cathepsine activé peut servir de marqueur pour protéolytique macrophage et l' activité élastolytique dans le système vasculaire. 9 Afin de permettre l'utilisation simultanée des deux sondes fluorescentes, il est importantd'utiliser des sondes qui sont spectralement distinctes. La notation calcium RIN sera utilisé pour indiquer le proche infrarouge sonde d'imagerie fluorescente et de la cathepsine NIR spécifiques calcification pour indiquer le proche infrarouge sonde d'imagerie fluorescente spécifique à l'activité de la cathepsine.
    1. Préparer les solutions de calcium NIR et de la cathepsine NIR. Selon les protocoles du fabricant, ajouter 1,2 ml de 1x tampon phosphate salin (PBS) dans le flacon contenant 24 nmol de calcium NIR ou la cathepsine NIR et agiter doucement.
      Remarque: Selon le fabricant, une fois reconstitué avec du PBS, les solutions NIR de calcium et de la cathepsine NIR restent stables pendant 14 jours lorsqu'ils sont stockés dans l'obscurité à 2-8 ° C.
  2. L'isolement et la calcification de Murine Aortic CMLV
    1. Solution Digestion Aortic:
      1. Préparer une solution fraîche (~ 3-5 ml par aorte récoltées) avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant 2 collagénase et 1,25 U / ml élastase 175 U / ml type. Stériliser la solution wvec un système de filtration de 0,22 um entraîné sous vide et maintenir la solution sur de la glace jusqu'à utilisation.
    2. Cellule médias:
      1. Supplément 500 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine. Réchauffez les médias à 37 ° C avant utilisation.
    3. Calcification Médias:
      1. Une calcification (NaPhos, utilisé dans des lignées cellulaires de souris):
        1. Supplément 100-500 ml de DMEM (volume en fonction des besoins) avec 10% de sérum bovin foetal, du phosphate de sodium à 2 mM, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine. Réchauffez les médias à 37 ° C avant utilisation.

          OU
      2. Calcification B (βGP / Desc / DEX, utilisé dans les deux souris ou des lignées cellulaires humaines):
        1. Supplément 100-500 ml de DMEM (volume selon les besoins) avec 10% de sérum bovin foetal, disodique 10 mM β-glycerophosphate, 50 pg / ml d'acide L-ascorbique, 10nM de dexaméthasone, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine. Réchauffez les médias à 37 ° C avant utilisation.

2. Injection de la veine caudale

  1. Avant l'injection de queue, réchauffer les souris sous une lampe de chauffage doux pendant 5 min.
  2. Retiens la souris dans un porte-tube de rongeur. Désinfecter la queue avec un tampon imbibé d'alcool.
  3. Utiliser une aiguille de 30 G pour l'injection veine de la queue. veines Tail sont situés latéralement.
    1. Appliquer une quantité douce de pression vers l'avant sur la seringue que l'aiguille est avancé dans la queue. La veine est accessible une fois la résistance à l'injection est plus présent.
    2. Injecter un volume de 100 pi de calcium NIR et / ou 100 pi de cathepsine NIR à un rythme régulier. A la fin de l'injection, après une pause de 5 secondes, retirer l'aiguille.
  4. Récolter les aortes (voir section 3) 3-24 h après l'injection.

3. Souris Dissection

  1. Euthanize souris avec 200 mg / kg par injection intrapéritonéale de pentobarbital.
  2. Poser le supination animal sur le plateau de dissection et de stabiliser en collant chaque patte à la carte. En utilisant un microscope de dissection et de petits ciseaux, faire une incision médiane étendant à partir du bas-ventre à la partie supérieure du thorax.
  3. Peler la peau avec des pinces et enlever le péritoine, révélant les organes abdominaux. Retirez les organes gastro-intestinaux, en prenant soin de ne pas sectionner l'aorte.
  4. Faire une incision latérale dans le diaphragme antérieur et continuer l'incision dans l'abdomen. Avec des ciseaux de dissection, libérer la cage thoracique en coupant à travers les côtés des nervures et le retrait du adhérente des tissus mous à la partie supérieure du sternum. Retirez la cage thoracique, révélant les poumons.
  5. Laissez le coeur en place initialement (à l'aide dans l'identification et la dissection de l'aorte proximale) et retirer soigneusement les poumons. Retirez le thymus, de la trachée et de l'oesophage avec soin, ensuring que l'aorte reste intacte.
  6. En utilisant des pinces droites fines et micro-dissection ciseaux, enlever les tissus mous entourant l'aorte de la bifurcation iliaque à la crosse de l' aorte, en accordant une attention particulière lors de la suppression de la graisse péri-aortique (figure 1A). Retirez le tissu adipeux et doux restant entourant les grandes branches de la crosse aortique (c. -à- brachiocéphaliques, carotides et subclavières commune artères, figure 1B).
    Note: Il est important d'enlever la graisse de l'aorte parce que la graisse peut augmenter le signal de fond lors de l'exécution d'imagerie de fluorescence.
  7. Retirez le coeur de la cavité thoracique, il détachant soigneusement de l'aorte proximale, et le jeter. Transect l'aorte distale à la bifurcation iliaque. En utilisant une aiguille d'insuline, injecter une solution saline normale dans l'aorte de la crosse de l'aorte pour laver les cellules sanguines restantes. Détachez l'aorte avec les vaisseaux arc aortique, complètement enleverà partir du corps.
  8. Placez l'aorte dans une solution saline normale de la glace jusqu'à l'imagerie.

4. Aortic Imaging

  1. Aortes Image ex vivo immédiatement après la récolte par infrarouge proche imagerie de fluorescence de réflectance. 25
    1. Régler l'appareil d'imagerie par fluorescence aux longueurs d' onde multivoies appropriées pour quantifier l' intensité du signal de fluorescence à partir des aortes de calcium RIN et des souris cathepsine NIR injecté, comme décrit précédemment. 25 D' après le fabricant, NIR de calcium peut être excité par ~ 650-678 nm , la lumière avec une émission maximale dans la ~ 680-700 nm gamme. Cathepsine NIR peut être excité par ~ 745-750 nm de lumière avec une émission maximale à ~ 770 nm.

5. Isolement de murine primaire Aortic vasculaires cellules de muscle lisse

  1. Effectuer les étapes 3,1-3,7 comme décrit plus haut.
  2. Placez aortes dans HBSS froide jusqu'à ce que les dissections sont complets. couper soigneusement toute remaining graisse périaortique et des tissus mous, ne laissant que l'aorte.
  3. Sous une hotte de culture de tissu stérile, transférer les aortes à la solution Digestion Aortic en 35 mm x 10 mm de boîtes de culture de tissus. Placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min avec balancement intermittent doux. Après digestion, les aortes présentent un aspect étiré ou effiloché.
  4. Avec le microscope de dissection et une pince stérile, enlever la couche externe adventice de l'aorte tout en gardant la couche médiane intacte. Une technique pour enlever l'adventice est de décoller la couche externe de l'aorte à une extrémité et le retirer de la couche médiane sous-jacente comme une chaussette peut être décollée et retirée.
  5. Une fois la couche adventice a été retirée, placez les aorte restantes dans une nouvelle boîte de culture de tissu avec des milieux de culture cellulaire et conserver à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 2-4 heures.
  6. Sous une hotte stérile et en utilisant stériles 3 mm ciseaux micro-dissection, couper l'aorte dans 1-2 mm de largeanneaux.
  7. Placez ces anneaux dans une nouvelle boîte de culture de tissu avec la solution Digestion Aortic et incuber à 37 ° C avec intermittent doux balancement pendant 120 minutes. Pipeter la solution monter et descendre plusieurs fois au cours de cette incubation pour remettre en suspension les cellules.
  8. Ajouter 5 ml de milieu de culture cellulaire chaude à la solution de digestion et de transfert dans un tube conique de 15 ml.
  9. Centrifugeuse le tube pendant 5 min à 200 x g.
  10. Aspirer le milieu et les cellules de remettre en suspension dans le volume souhaité de milieux de culture cellulaire (par exemple, 5 ml).
  11. Plaquer la quantité totale de cellules isolées l'une de l'aorte dans une cellule de 25 cm2 flacon de culture et mettre à incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. Propager cellules en utilisant des techniques standard, comme décrit précédemment. 25,48 Pendant les 7-10 premiers jours d'incubation, changer les médias tous les 72-96 heures. Comme les cellules approchent la confluence, reconstituer les médias plus fréquemment (toutes les 48 heures).
    Remarque: Il peut prendre plusieurs semaines pour faire croître une qua suffisantentity des cellules.
  12. Une fois confluentes, les cellules de passage avec la trypsine qui est chauffé à 37 ° C.
    1. Ajouter 0,5-1,0 ml de trypsine à chaque flacon de culture et incuber pendant 3-5 min; tapotez doucement le côté du flacon chaque 30-60 sec que nécessaire pour détacher les cellules de la surface.
    2. Une fois que les cellules se détachent du fond du flacon, ajouter 10 ml de milieu cellulaire pour les cellules dans la trypsine. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min. Aspirer les médias et la trypsine à partir du culot cellulaire. Remettre en suspension les cellules dans la quantité désirée de milieux de cellules fraîches (par exemple, 5 à 10 ml) et transférer dans un nouveau flacon (avec quelques cellules transférées sur une lame de la chambre).
  13. Lors du premier passage des cellules, confirment la lignée lisse des cellules musculaires avec des techniques d'immunocytochimie standard, comme décrit précédemment, 49 en utilisant un anticorps dirigé contre l' α-actine du muscle lisse.

6. Induire calcification du muscle lisse CulturedCellules

  1. cellules de plaques obtenues à partir de 5.12 dans un format de 6 puits. Note: A partir de 1 x 10 5 cellules / puits dans un volume total de 2,0 ml de milieu de cellules par puits est recommandée.
  2. Laisser les cellules se développent dans la calcification des médias A ou B pendant au moins 7 jours dans un format de plaque à 6 puits. Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  3. Changer les médias de cellules toutes les 48 heures.

7. Évaluation CMLV calcification Utilisation de la coloration de von Kossa Méthode

. Remarque: La méthode de von Kossa pour la mesure de la matrice extracellulaire , la calcification des tissus ou des cellules en culture est basée sur le remplacement des ions calcium en phosphate lié avec des ions argent 50 En présence des composés légers et organiques, les ions d'argent sont réduits et visualisées sous forme métallique argent. N'importe quel argent qui n'a pas réagi est éliminé par traitement avec du thiosulfate de sodium 50 Le protocole de coloration de von Kossa est le suivant.:

  1. Aspirer le milieu de cu cellulaireplaques lture.
  2. Fixer les cellules en les plaçant dans 1 ml de formol à 10% à la température ambiante pendant 20 min.
  3. Retirez la formaline et laver les cellules fixées avec de l'eau distillée pendant 5 min.
  4. Incuber les cellules dans 1 ml de solution à 5% de nitrate d'argent sous une ampoule de 60 à 100 W pendant 1 à 2 heures.
  5. Aspirer la solution de nitrate d'argent et laver avec de l'eau distillée pendant 5 min.
  6. Éliminer l'argent qui n'a pas réagi en plaçant les cellules dans 1 ml de thiosulfate de sodium à 5% d'une solution dans l'eau distillée pendant 5 minutes (p / v).
  7. Rincer les cellules avec de l'eau distillée pendant 5 min. Répéter les lavages 3x. La coloration de von Kossa est prêt pour l'imagerie par microscopie optique inversé standard.
  8. Étape facultative: Counterstain avec 1ml de rouge nucléaire rapide pendant 5 min. Suivez ce avec trois lavages avec de l'eau distillée (5 minutes chacun).

OU

8. Évaluation CMLV calcification avec imagerie fluorescente proche infrarouge

Note: Similaire à sa capacitépour identifier la calcification dans les aortes de souris, le calcium se lie facilement NIR calcifiée minérale déposée par les cellules en culture. En utilisant cette technique, la microscopie à fluorescence et lecteurs de plaques avec des filtres de longueurs d'ondes longues peut l' image et de quantifier la calcification in vitro, respectivement. La longue émission de longueur d'onde du proche infrarouge de calcium permet l'utilisation simultanée des longueurs d'onde inférieures fluorophores émettant pour détecter d'autres fonctions. Le protocole pour le calcium NIR coloration est la suivante:

  1. Comme décrit dans la section 1.1.1, ajouter 1,2 ml de PBS 1x dans le flacon contenant 24 nmol de calcium NIR.
  2. Diluer le calcium NIR stock 1: 100 dans les médias de calcification ou de contrôle appropriés.
  3. Aspirer milieux cellulaires à partir des plaques de culture et le remplacer par le calcium NIR contenant des milieux de culture.
  4. Incuber les plaques de culture avec les médias NIR de calcium pendant la nuit à 37 ° C.
  5. Aspirer les médias des puits et laver les puits une fois avec PBS.
    Remarque: À ce stade,les milieux de culture d'origine peut être ajouté dans les puits, et les cellules peuvent être imagé en direct. Sinon, passez aux étapes ci-dessous.
  6. Fixer les cellules en les plaçant dans 1 ml de formol à 10% à la température ambiante pendant 20 min.
  7. Retirez la formaline et laver les cellules fixées avec de l'eau distillée pendant 5 min. Répéter les lavages 3x.
  8. Étape facultative:. Effectuer la coloration d'immunofluorescence ou d' autres contre - colorants pour des protéines d'intérêt 8,9
  9. Image ou détecter la tache NIR de calcium en utilisant des longueurs d' onde de fluorescence appropriée d'excitation (par exemple, NIR de calcium peut être excité par 650-678 nm de lumière) et des filtres d'émission (~ 680-700 nm).

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Résultats

Calcification Aortic dans MGP - / - et souris de type sauvage a été mesurée en utilisant l' imagerie de fluorescence NIR de calcium. Aucun signal NIR de calcium a été détectée dans les aortes des souris de type sauvage, ce qui indique l'absence de calcification (figure 2). Un signal NIR de calcium solide a été détectée dans les aortes de MGP souris déficientes, ce qui est compatible avec la calcification vasculaire avancé. Des sections de tissu de aort...

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Discussion

Calcification artérielle est un facteur de risque important pour les maladies cardio - vasculaires chez l' homme et peut contribuer directement à la pathogenèse des événements cardiovasculaires. 1,5,52 intimale dépôt de calcium dans les calottes fibreuses minces de maladie athéroscléreuse a été proposé d'augmenter le stress biomécanique local et contribuer à rupture de la plaque. 53,54 impacts de calcification médiale sur les résultats cliniques en augmentant la rigidité artérielle, ce qui ...

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Déclarations de divulgation

Le Massachusetts General Hospital a déposé des brevets liés aux inhibiteurs de petites molécules des récepteurs BMP de type I et à l’application d’ALK3-Fc pour traiter l’athérosclérose et la calcification vasculaire, et MD, PBY, KDB et RM peuvent avoir droit à des redevances.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche cardiovasculaire Sarnoff (MFB et TET), l’Institut médical Howard Hughes (TM), le Ladue Memorial Fellowship Award de la Harvard Medical School (DKR), le programme START de la Faculté de médecine de la RWTH d’Aix-la-Chapelle (MD), la Fondation allemande pour la recherche (DE 1685/1-1, MD), l’Institut national de l’œil (R01EY022746, ESB), la Fondation Leducq (Programme multidisciplinaire visant à élucider le rôle de la signalisation des protéines morphogénétiques osseuses dans la pathogenèse des maladies vasculaires pulmonaires et systémiques, PBY, KDB et DBB), l’Institut national de l’arthrite et des maladies musculo-squelettiques et cutanées (R01AR057374, PBY), l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (R01DK082971, KDB et DBB), le Fellow-to-Faculty Award #11FTF7290032 (RM) de l’American Heart Association et l’Institut national du cœur, des poumons et du sang (R01HL114805 et R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube conique de 15 mlFalcon352096
aiguille de 30 gBD305106
Alpha anticorps anti-actine du muscle lisseSigmaSAB2500963
Lame de chambreNunc Lab-Tek154461
Collagénase, Type 2  ;WorthingtonLS004176
DexaméthasoneSigmaD4902
Dulbecco’s Modified Eagle MediumLife Technologies11965-084
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, sans calciumGibco14190-144
ElastaseSigmaE1250
Sérum fœtal bovinGibco16000-044
Pince, pointe fineRobozRS-4972
Pince, courbe complète denteléeRobozRS-5138
Formol (10 %)Microscopie électronique Sciences15740
saline équilibrée de HankGibco14025-092
Cellules musculaires lisses de l’artère coronaire humainePromoCellC-12511
Seringue à insuline avec aiguilleTerumoSS30M2913
Acide L-ascorbiqueSigmaA-7506
Ciseaux à ressort micro-dissectionneurs (13 mm)RobozRS-5676
Ciseaux à ressort micro-dissectionneurs (3 mm)RobozRS-5610
NIR, cathepsine (ProSense-750EX)Perkin ElmerNEV10001EX
NIR, ostéogénique (OsteoSense-680EX)Perkin ElmerNEV10020EX
Saline normaleHospira0409-4888-10
Nucléaire rapide rougeSigma-AldrichN3020
Odyssey Imaging SystemLi-CorOdyssey 3.0
Pénicilline/StreptomycineCorning30-001-CI
Nitrate d’argent (5 %)Ricca Chemical Company6828-16
Phosphate de sodium dibasique heptahydratéSigma-AldrichS-9390
Thiosulfate de sodiumSigmaS-1648
ß ;-glycérophosphate disodium hydrateSigmaG9422
Fiole de culture tissulaire, 25 cm2353108Falcon
Culture tissulaire plaque (35 mm x 10 mm)Falcon353001
Plaque de culture tissulaire, six puitsFalcon353046
TrypsinCorning25-053-CI
Porte-rongeursKent ScientificRSTR551
Système de filtration par videMilliporeSCGP00525
Solution

Références

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