La calcification vasculaire est un prédicteur important et un contributeur aux maladies cardiovasculaires humaines. Ce protocole décrit des méthodes pour induire la calcification de cellules musculaires lisses vasculaires primaires en culture et pour quantifier la calcification et la charge macrophage dans les aortes animales à l’aide de l’imagerie par fluorescence proche infrarouge.
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Article de méthode
Calcification vasculaire des cellules musculaires lisses et imagerie de Aortic calcification et Inflammation
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde. Les plaques d’athérosclérose, constituées de macrophages chargés de lipides et de calcifications, se développent dans les artères coronaires, la valve aortique, l’aorte et les artères périphériques des conduits et sont la marque des maladies cardiovasculaires. Chez l’homme, l’imagerie par tomodensitométrie permet de quantifier la calcification vasculaire ; La présence d’une calcification vasculaire est un puissant prédicteur d’événements cardiovasculaires futurs. Le développement de nouvelles thérapies dans le domaine des maladies cardiovasculaires dépend essentiellement de l’amélioration de notre compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents de l’athérosclérose. L’avancement de nos connaissances sur les mécanismes de l’athérosclérose repose sur des modèles murins et cellulaires. Ici, une méthode d’imagerie de la calcification aortique et de l’infiltration de macrophages à l’aide de deux sondes d’imagerie fluorescente dans le proche infrarouge spectralement distinctes est détaillée. L’imagerie fluorescente dans le proche infrarouge permet de quantifier ex vivo la calcification et l’accumulation de macrophages dans l’ensemble de l’aorte et peut être utilisée pour approfondir notre compréhension de la relation mécaniste entre l’inflammation et la calcification dans l’athérosclérose. De plus, l’invention concerne un procédé d’isolement et de culture de cellules musculaires lisses vasculaires aortiques animales et un protocole permettant d’induire une calcification dans des cellules musculaires lisses cultivées à partir d’aortes murines ou d’artères coronaires humaines. Cette méthode in vitro de modélisation de la calcification vasculaire peut être utilisée pour identifier et caractériser les voies de signalisation probablement importantes pour le développement des maladies vasculaires, dans l’espoir de découvrir de nouvelles cibles pour le traitement.
Introduction
Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde, y compris les États-Unis où elle représente plus de 780.000 décès par an. 1 calcification de l' artère coronaire et la calcification aortique sont les caractéristiques de la maladie athéroscléreuse et servent de solides prédicteurs d'événements cardiovasculaires. 2- 4 Deux principaux types de calcifications vasculaires ont été rapportés chez les adultes: calcification intimale, associée à l' athérosclérose, et médiale (également connu sous le nom Mönckeberg) calcification, associée à une maladie rénale chronique et le diabète 5
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Protocole
Toutes les études avec des souris ont été effectuées en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Logement et toutes les procédures impliquant des souris décrites dans cette étude ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et l'utilisation des comités de l'Hôpital général du Massachusetts (Sous-comité sur la recherche de protection des animaux). Toutes les procédures ont été réalisées avec soin pour minimiser la souffrance.
1. Préparation des réactifs
- Near-Infrared Imaging Fluorescence de Whole aortes
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Résultats
Calcification Aortic dans MGP - / - et souris de type sauvage a été mesurée en utilisant l' imagerie de fluorescence NIR de calcium. Aucun signal NIR de calcium a été détectée dans les aortes des souris de type sauvage, ce qui indique l'absence de calcification (figure 2). Un signal NIR de calcium solide a été détectée dans les aortes de MGP souris déficientes, ce qui est compatible avec la calcification vasculaire avancé. Des sections de tissu de aort.......
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Discussion
Calcification artérielle est un facteur de risque important pour les maladies cardio - vasculaires chez l' homme et peut contribuer directement à la pathogenèse des événements cardiovasculaires. 1,5,52 intimale dépôt de calcium dans les calottes fibreuses minces de maladie athéroscléreuse a été proposé d'augmenter le stress biomécanique local et contribuer à rupture de la plaque. 53,54 impacts de calcification médiale sur les résultats cliniques en augmentant la rigidité artérielle, ce qui .......
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Déclarations de divulgation
Le Massachusetts General Hospital a déposé des brevets liés aux inhibiteurs de petites molécules des récepteurs BMP de type I et à l’application d’ALK3-Fc pour traiter l’athérosclérose et la calcification vasculaire, et MD, PBY, KDB et RM peuvent avoir droit à des redevances.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche cardiovasculaire Sarnoff (MFB et TET), l’Institut médical Howard Hughes (TM), le Ladue Memorial Fellowship Award de la Harvard Medical School (DKR), le programme START de la Faculté de médecine de la RWTH d’Aix-la-Chapelle (MD), la Fondation allemande pour la recherche (DE 1685/1-1, MD), l’Institut national de l’œil (R01EY022746, ESB), la Fondation Leducq (Programme multidisciplinaire visant à élucider le rôle de la signalisation des protéines morphogénétiques osseuses dans la pathogenèse des maladies vasculaires pulmonaires et systémiques, PBY, KDB et DBB), l’Institut national de l’arthrite et des maladies muscul....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube conique de 15 ml | Falcon | 352096 | |
| aiguille de 30 g | BD | 305106 | |
| Alpha anticorps anti-actine du muscle lisse | Sigma | SAB2500963 | |
| Lame de chambre | Nunc Lab-Tek | 154461 | |
| Collagénase, Type 2 ; | Worthington | LS004176 | |
| Dexaméthasone | Sigma | D4902 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-084 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, sans calcium | Gibco | 14190-144 | |
| Elastase | Sigma | E1250 | |
| Sérum fœtal bovin | Gibco | 16000-044 | |
| Pince, pointe fine | Roboz | RS-4972 | |
| Pince, courbe complète dentelée | Roboz | RS-5138 | |
| Formol (10 %) | Microscopie électronique Sciences | 15740 | |
| saline équilibrée de Hank | Gibco | 14025-092 | |
| Cellules musculaires lisses de l’artère coronaire humaine | PromoCell | C-12511 | |
| Seringue à insuline avec aiguille | Terumo | SS30M2913 | |
| Acide L-ascorbique | Sigma | A-7506 | |
| Ciseaux à ressort micro-dissectionneurs (13 mm) | Roboz | RS-5676 | |
| Ciseaux à ressort micro-dissectionneurs (3 mm) | Roboz | RS-5610 | |
| NIR, cathepsine (ProSense-750EX) | Perkin Elmer | NEV10001EX | |
| NIR, ostéogénique (OsteoSense-680EX) | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Saline normale | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Nucléaire rapide rouge | Sigma-Aldrich | N3020 | |
| Odyssey Imaging System | Li-Cor | Odyssey 3.0 | |
| Pénicilline/Streptomycine | Corning | 30-001-CI | |
| Nitrate d’argent (5 %) | Ricca Chemical Company | 6828-16 | |
| Phosphate de sodium dibasique heptahydraté | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| Thiosulfate de sodium | Sigma | S-1648 | |
| ß ;-glycérophosphate disodium hydrate | Sigma | G9422 | |
| Fiole de culture tissulaire, 25 cm2 | 353108Falcon | ||
| Culture tissulaire plaque (35 mm x 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Plaque de culture tissulaire, six puits | Falcon | 353046 | |
| Trypsin | Corning | 25-053-CI | |
| Porte-rongeurs | Kent Scientific | RSTR551 | |
| Système de filtration par vide | Millipore | SCGP00525 |
Références
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposit....
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Réimpressions et autorisations
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