Summary
Et højt udbytte fremgangsmåde til ettrins negativ oprensning af rekombinant Helicobacter pylori neutrofil-aktiverende protein (HP-NAP) overudtrykkes i Escherichia coli ved hjælp af diethylaminoethyl harpikser i batchvis, er beskrevet. HP-NAP renset ved denne metode er til gavn for udviklingen af vacciner, lægemidler, eller diagnostik for H. pylori-associeret sygdomme.
Abstract
Helicobacter pylori neutrofil-aktiverende protein (HP-NAP) er en væsentlig virulensfaktor af Helicobacter pylori (H. pylori). Det spiller en kritisk rolle i H. pylori-induceret gastrisk inflammation ved at aktivere flere medfødte leukocytter, herunder neutrofiler, monocytter og mastceller. De immunogene og immunmodulerende egenskaber af HP-NAP gør det til en potentiel diagnostisk og vaccine kandidat til H. pylori og en ny lægemiddelkandidat til kræftbehandling. For at opnå betydelige mængder oprenset HP-NAP anvendes til dets kliniske anvendelser, til en effektiv fremgangsmåde oprense dette protein med højt udbytte og renhed skal etableres.
I denne protokol, har vi beskrevet en fremgangsmåde til ettrins negativ kromatografisk oprensning af rekombinant HP-NAP overudtrykkes i Escherichia coli (E. coli) ved anvendelse diethylaminoethyl (DEAE) ionbytterharpikser (f.eks. Sephadex) in batch-mode. Rekombinant HP-NAP udgør næsten 70% af det totale protein i E. coli og er næsten fuldt tilbagebetalt i den opløselige fraktion efter cellelysis ved pH 9,0. Under den optimale tilstand ved pH 8,0, er størstedelen af HP-NAP udvundet i den ubundne fraktion, mens de endogene proteiner fra E. coli effektivt fjernet ved harpiksen.
Denne rensning metode bruger negativ tilstand batch kromatografi med DEAE ionbytterharpikser giver funktionel HP-NAP fra E. coli i sin native form med højt udbytte og renhed. Det oprensede HP-NAP kunne yderligere anvendes til forebyggelse, behandling og prognose af H. pylori-associeret sygdomme og cancer terapi.
Introduction
Helicobacter pylori (H. pylori) er en væsentlig årsag til gastritis og mavesår. Denne bakterie er også blevet klassificeret som kræftfremkaldende i mennesker ved Det Internationale Agentur for Kræftforskning, en del af World Health Organization, i 1994. Det er blevet anslået, at forekomsten af H. pylori-infektion er 70% i udviklingslandene og 30-40% i de industrialiserede lande 1. Selvom infektion på H. pylori er faldende i de industrialiserede lande, infektion på H. pylori i udviklingslandene er stadig høj 2. Standarden behandling for at udrydde H. pylori infektion består af administrationen af en protonpumpehæmmer, PPI, og to antibiotika, clarithromycin plus amoxicillin eller metronidazol 3. Men fremkomsten af antibiotikaresistens i H. pylori-relaterede sår terapi tilskynder udviklingen af nye strategier til forebyggelse or helbrede infektionen. Udvikling af forebyggende og / eller terapeutisk vaccination mod H. pylori kunne give en alternativ tilgang til at styre H. pylori-infektion.
Helicobacter pylori neutrofil-aktiverende protein (HP-NAP), en væsentlig virulensfaktor af H pylori, blev først identificeret i vand ekstrakter af H. pylori med evnen til at aktivere neutrofiler til at adhærere til endotelceller og producere reaktive oxygenarter (ROS) 4. Neutrofil infiltration af maveslimhinden fundet i H. pylori-inficerede patienter med aktiv gastritis kan resultere i inflammation og vævsskade af maven. Således kan HP-NAP spille en patologisk rolle ved at aktivere neutrofiler at inducere gastrisk inflammation, hvilket yderligere bevirker ulcus eller H. pylori-associeret gastrisk sygdomme. Ikke desto mindre, HP-NAP er en potentiel kandidat til kliniske anvendelser 5,6. På grund af den immunogene og immunmodulerende proejendommene af HP-NAP, kan dette protein anvendes til at udvikle vacciner, terapeutiske midler og diagnostiske værktøjer. Et klinisk forsøg er gennemført for anvendelse af rekombinant HP-NAP som en af komponenterne i et protein vaccine mod H. pylori. Denne vaccine består af rekombinant HP-NAP, cytotoksin-associeret gen A (CagA), og vakuolerende cytotoksin A (VacA) proteiner formuleret med aluminiumhydroxid og er yderligere blevet demonstreret at være sikkert og immunogent i mennesker 7. Også, HP-NAP virker som en potent immunmodulator til at udløse T-hjælper type 1 (Th1) -polarized immunresponser til cancerterapi 8 og at nedregulere Th2-medierede immunresponser fremkaldt af allergiske reaktioner og parasitære infektioner 9,10. Som for diagnostik, har rekombinant HP-NAP-baserede ELISA blevet anvendt til påvisning af serumantistoffer mod HP-NAP i H. pylori inficerede patienter 11. En undersøgelse viste, at niveauet af HP-NAP-specifikke antistoffer i sera fra H. pylori inficerede patienter med mavekræft var signifikant højere end fra patienter med kronisk gastritis 12. En anden undersøgelse viste også, at serum antistoffer mod HP-NAP er forbundet med tilstedeværelsen af ikke-mavemunden gastrisk adenocarcinom 13. Således kan rekombinant HP-NAP-baserede ELISA anvendes til at måle serum antistoffer mod HP-NAP til prognose af gastrisk cancer hos H. pylori-inficerede patienter. Tilsammen kan det oprensede HP-NAP yderligere anvendes til forebyggelse, behandling og prognose af H. pylori-associeret sygdomme og cancer terapi.
Blandt de mange metoder, der anvendes til oprensning af rekombinant HP-NAP udtrykt i Escherichia coli (E. coli) i sin native form rapporteret hidtil, et andet oprensningstrin involverer gelfiltreringskromatografi er nødvendig for at opnå særdeles rene HP-NAP 14-16 . Her, en fremgangsmåde under anvendelse negativ modus batch kromatografi meddiethylaminoethyl (DEAE) ionbytterharpikser er beskrevet for oprensning af HP-NAP overudtrykt i E. coli med højt udbytte og høj renhed. Denne rensning teknik var baseret på bindingen af værtscelleproteiner og / eller andre end HP-NAP til harpiksen urenheder. Ved pH 8,0, er næsten ingen andre proteiner undtagen HP-NAP genvundet fra den ubundne fraktion. Denne rensning tilgang med DEAE ionbytningskromatografi som negativ er enkel og tidsbesparende ved at tillade oprensning af rekombinant HP-NAP via et-trins kromatografi gennem indsamling af den ubundne fraktion. Ud over HP-NAP, flere andre biomolekyler, såsom vira 17, immunoglobulin G (IgG) 18, hæmoglobin 19, proteinphosphatase 20, og virulensfaktor flagellin 21, også er blevet rapporteret at renses ved ionbytningskromatografi i negativ mode. Den negative modus foretrækkes til ionbytningskromatografi hvis urenheder er den mindreårigekomponenter til stede i prøven underkastes oprenses 22. Anvendelsen af negative chromatografi i rensning af naturlige eller rekombinante biomolekyler er for nylig blevet revideret 23.
Denne rapport giver en trinvis protokol for ekspression af rekombinant HP-NAP i E. coli, lysis af cellerne, og oprensning af HP-luven negativ modus batch-kromatografi med DEAE ionbytterharpikser. Hvis et ønsket til oprensning protein er egnet til ionbytningskromatografi i negativ modus, kan den beskrevne protokol også tilpasses som et udgangspunkt for udvikling af en rensningsproces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskeblod blev indsamlet fra raske frivillige med forudgående skriftlig informeret samtykke og godkendelse fra Institutional Review Board for National Tsing Hua University, Hsinchu, Taiwan.
1. Ekspression af rekombinant HP-NAP i E. coli
- Forbered plasmid pET42a-NAP indeholdende DNA-sekvensen af HP-NAP fra H. pylori 26.695 stamme som tidligere beskrevet 16. Forbered plasmider indeholdende DNA-sekvensen af HP-NAP med de ønskede punktmutationer som beskrevet (se protokol, trin 8).
- Transform 10 ng af ovennævnte DNA-plasmider i E. coli BL21 (DE3) kompetente celler ved varmechok i 45 sekunder ved 42 ° C, streak cellerne på lysogeni bouillon (LB) agarplader indeholdende 50 ug / ml kanamycin, og Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 16 timer.
- Inokulere enkelte kolonier i individuelle rør indeholdende 5 ml LB-bouillon med 50 ug / ml kanamycin og dyrke dem som forkulturer ved 37 ° C i 16 timer under omrystning ved 170 rpm.
- Pode 2 ml af ovennævnte prækultur celler i 200 ml LB-bouillon indeholdende 50 ug / ml kanamycin i en 1 liters kolbe. Inkubér podede kultur kolbe ved 37 ° C i 2 timer under omrystning ved 170 rpm, indtil absorbansen ved 600 nm når ca. 0,4-0,5 detekteres af en UV / VIS spektrofotometer.
- Der tilsættes 80 pi 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) i de ovenfor kultur til en slutkoncentration på 0,4 mM for at inducere ekspressionen af HP-NAP. Inkuber kulturen i 3 timer, indtil absorbansen ved 600 nm når ca. 1,6-1,7.
- Centrifuger cellerne ved 6000 xg ved 4 ° C i 15 minutter for at fjerne supernatanten. Opbevar cellepelleten ved -70 ° C indtil oprensning.
2. Fremstilling af opløseligt protein fraktion indeholdende HP-NAP
Bemærk: Alle de følgende trin udføres ved 4 ° C.
- Resuspender 50 ml af cellen pellet fremstillet i protokol trin 1.6 i 20 ml 20 mM Tris-HCI, pH 9,0, 50 mM NaCl indeholdende 0,13 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,03 mM N-a-tosyl-L-lysinyl-chlormethylketon (TLCK) og 0,03 mM N-tosyl-L-phenylalaninyl-chlormethylketon (TPCK) ved 4 ° C som tidligere beskrevet 16.
- Forstyrre bakteriecellerne ved at passere den bakterielle suspension gennem en højtrykshomogenisator drevet ved en række 15.000 til 20.000 psi i 7 gange ved 4 ° C.
- Centrifuger cellelysatet ved 30.000 x g ved 4 ° C i 1 time for at adskille de opløselige og uopløselige proteinfraktioner ved hjælp af en ultracentrifuge. Supernatanten overføres som den opløselige proteinfraktion til et bægerglas.
- Måle proteinkoncentrationen af det opløselige proteinfraktion ved Bradford-metoden under anvendelse af et kommercielt kit med bovint serumalbumin (BSA) som standard i henhold til producentens anvisninger.
- Tilføj 177,6 pi 1 N HCI i 20 ml the opløselige proteinfraktion opnået fra protokol trin 2.3 til at justere dens pH-værdi fra pH 9,0 til pH 8,0.
- Tilsæt 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 50 mM NaCl til ovennævnte proteinopløsning at foretage den endelige protein fusions 0,5 mg / ml.
3. Oprensning af rekombinant HP-NAP Fra E. coli ved Negativ tilstand Batch Kromatografi med DEAE ionbytterharpikser
- Forbered 15 ml DEAE-harpikser.
- Afvej 0,6 g tørt pulver af DEAE-harpikser og suspenderer det i 30 ml 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 50 mM NaCl ved stuetemperatur i mindst 1 dag.
- Centrifugeres harpiksen ved 10.000 x g ved 4 ° C i 1 min.
- Fjern og kassér supernatanten.
- Der tilsættes 15 ml 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 50 mM NaCl.
- Gentag Protokol trin 3.1.2 til 3.1.4 fire gange mere.
- Opbevar 15 ml fast harpiks (50% opslæmning i 30 ml Tris-buffer) ved 4 ° C til efterfølgende anvendelse.
Bemærk: Alt følgende trins er udført ved 4 ° C.
- Tilsættes 45 ml af de opløselige proteiner fremstillet i protokol trin 2.6 til 15 ml af harpiksen og omrør protein / harpiksopslæmningen med en magnetisk omrører ved 4 ° C i 1 time.
- Hæld protein / harpiksopslæmningen i en plastik eller glassøjle med en stophane. Lad harpiksen at bosætte under tyngdekraften.
- Vandhanen åbnes for at tillade proteinopløsningen at strømme gennem kolonnen ved tyngdekraften flow, indtil væskeniveauet i kolonnen er lige over harpiksen. Opsaml gennemløbet som den ubundne fraktion, som indeholder det oprensede HP-NAP.
- Der tilsættes 15 ml iskold 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 50 mM NaCl i kolonnen.
- Vandhanen åbnes for at tillade vaskepufferen at strømme gennem kolonnen ved tyngdekraften flow, indtil væskeniveauet i kolonnen er lige over harpiksen. Opsaml gennemløbet som vaskefraktion.
- Gentag Protokol trin 3,5 til 3,6 fire gange mere for at indsamle de ekstra vask fraktioner.
- Der tilsættes 15 ml iskold 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 M NaCl i en søjle.
- Vandhanen åbnes for at tillade elueringspufferen at strømme gennem kolonnen ved tyngdekraften flow, indtil væskeniveauet i kolonnen er lige over harpiksen. Opsaml gennemløbet som elueringsfraktion.
- Gentag Protokol trin 3,8 til 3,9 fire gange mere for at indsamle de ekstra elueringsfraktioner.
4. Buffer Exchange og endotoksin Fjernelse af HP-NAP Renset ved Negativ tilstand Batch Kromatografi med DEAE Resins
Bemærk: Det rensede HP-NAP udtrykt i E. coli skal underkastes buffer udveksling og endotoksin fjernelse før stimulere neutrofiler.
- Udføre dialyse for at ændre bufferen af det oprensede HP-NAP til Dulbeccos phosphatbufret saltvand (D-PBS), pH 7,2, ved 4 ° C ved anvendelse af dialyserør med en molekylvægt afskæring på 14 kDa som tidligere beskrevet 24.
- Foretage dialyserede HP-NAP gennem en Syringe filter med en positivt ladet, hydrofil membran fastgjort til en 20 ml engangssprøjte ved strømningshastigheder fra 2,5 til 4 ml / minut ved 4 ° C til fjernelse af endotoksin.
5. Karakterisering af de molekylære egenskaber af oprenset rekombinant HP-NAP ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), Western blotting, Native-PAGE gelfiltreringschromatografi, og cirkulær dikroisme-spektroskopi
- Analyser det oprensede rekombinante HP-NAP ved SDS-PAGE og western blotting med hybridoma kultursupernatanter indeholdende monoklonalt museantistof MAb 16F4 25 som tidligere beskrevet 24.
- Analyser det oprensede HP-NAP af indfødte-PAGE og gelfiltreringskromatografering at undersøge sin oligomere status som tidligere beskrevet 26.
- Analysere oprensede rekombinante HP-NAP ved cirkulær dikroisme spektroskopi til at undersøge sin sekundære struktur som tidligere beskrevet 26.
6. Evaluering af renheden af HP-NAP ved sølvfarvning af en SDS-PAGE-gel
- Forbered fikseringsopløsningen, sensibiliserende opløsning, sølv opløsning, fremkalderopløsning, stop opløsning, og vask opløsning ifølge producentens instruktioner i en sølvfarvning kit.
- Udfør sølvfarvning af en SDS-PAGE-gel i henhold til fabrikantens anvisninger af en sølvfarvning kit.
- Hente billedet af gelen med et billedbehandlingssystem.
7. Måling af ROS Produktion Fra Neutrofiler induceret af HP-NAP
- Isoler humane neutrofiler fra humant hepariniseret blod ved dextransedimentering efterfulgt af densitetsgradientcentrifugering som tidligere beskrevet 24.
- Måling af ROS-produktion fra neutrofiler stimuleret med HP-NAP ved anvendelse af en luminol-afhængig kemiluminescens-assay.
- Tænd en pladelæser og sæt temperaturen ved 37 ° C. Placer entom fladbundet 96-brønd hvid plade inde i pladelæseren kammer, gør det muligt at opvarme til 37 ° C.
- Forbered de stimulerende blandinger i D-PBS, pH 7,2, indeholdende 0,9 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2 og 13,3 uM 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion (luminol) med nærvær og fravær 0,67 uM endotoxin-fjernet HP-NAP fremstillet fra protokol trin 4.2.
- Indstille koncentrationen af humane neutrofiler fremstillet fra protokol trin 7.1 til 2 x 10 6 celler / ml i D-PBS, pH 7,2, indeholdende 5 mM glucose.
- Der tilsættes 50 pi neutrofil suspensionen i hver brønd i 96-brønds mens pladen.
- Tilføj 150 pi af de stimulerende blandinger fremstillet ud fra protokol trin 7.2.2 i brønden indeholdende neutrofiler ved et tidsinterval på 5 sekunder pr brønd.
- Måle emissionen af kemiluminescens i 5 sek per brønd i en periode på tre timer ved anvendelse af en pladelæser.
8.Konstruktion af DNA-plasmider huser HP-NAP mutanter ved polymerasekædereaktion (PCR) -baseret site-direkte mutagenese
Bemærk: PCR-baseret sted-direkte mutagenese blev genereret dybest set som tidligere 27 beskrevet bortset fra, at de "tavse" restriktionssteder blev indført til de mutagenese-primere ved site-directed mutagenese (SDM) -assist software 28.
- Udfør PCR-reaktion.
- Tilsæt 10 ng plasmid pET42a-NAP, 1 uM mutageneseteknikker primerpar er anført i tabel 1, 200 uM af deoxynucleosidtriphosphater (dNTP'er) og 3 enheder af high-fidelity PCR-enzymblanding i en PCR-rør indeholdende deioniseret vand, hvilket giver en endelig volumen på 25 pi.
- Indled PCR cyklusser ved 95 ° C i 10 minutter til denaturering af template-DNA, og følg med 12 amplifikationscykler ved 95 ° C i 1 minut, T m IKKE -5 ° C i 1 minut og 72 ° C i 6 min.
- Afslut PCR-cyklusser medet annealingstrin ved T m pp -5 ° C i 1 minut og forlængelse ved 72 ° C i 30 minutter.
- Behandl 15 pi af PCR-produktet med 0,4 pi Dpnl restriktionsenzym ved 37 ° C i 2 timer og derefter analysere 2 pi af Dpnl-behandlede PCR-produkt ved agarosegelelektroforese.
- Screen mutanter.
- Transform 2 pi af PCR-produktet ind i E. coli DH5a kompetente celler ved varmechok i 45 sekunder ved 42 ° C.
- Spred de transformerede celler på en LB-plade indeholdende 50 ug / ml kanamycin og inkuberes pladen ved 37 ° C i 16 timer.
- Isolere plasmid-DNA fra de bakterielle kolonier under anvendelse af et kommercielt alkalisk lyse kit ifølge producentens protokol.
- Behandl plasmid-DNA'et isoleret i protokol trin 8.3.3 med Xhol restriktionsenzym at bekræfte tilstedeværelsen af de ønskede tavse mutationer ifølge fabrikantens protokol.
- sekvensplasmid-DNA verificeret af protokol trin 8.3.4 med T7-promotor-primeren for at bekræfte korrektionen af de kodende sekvenser af HP-NAP-mutanter ifølge fabrikantens protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det skematiske diagram af den eksperimentelle procedure for negativ oprensning af rekombinant HP-NAP udtrykt i E. coli ved anvendelse af DEAE ionbytterharpikser i batch-tilstand er vist i figur 1. Denne rensning teknik er baseret på bindingen af værtscelleproteiner og / eller andre end HP-NAP til harpiksen urenheder. Ved pH 8,0, er næsten ingen andre proteiner undtagen HP-NAP i sin naturlige form genvundet fra den ubundne fraktion (figur 2A og B). Det oprensede HP-NAP i den ubundne fraktion blev immunodetekteret med antistoffet mod HP-NAP (figur 2C), og renheden var højere end 97% som bekræftet ved sølvfarvning (figur 2D). Derudover det oprensede rekombinante HP-NAP bevaret sin oligomer form som analyseret ved nativ PAGE (figur 2B) og gelfiltreringskromatografi (figur 3A). Cirkulær dikroisme spectroscopic-analyse viste, at det oprensede protein primært bestod af a-helixer (figur 3B). Også den oprensede HP-NAP var stand til at stimulere humane neutrofiler til at producere ROS (figur 3C). Således er den rekombinante HP-NAP oprenset ved denne fremgangsmåde er i sin native form med biologisk aktivitet. Endvidere kan denne negativ modus batch-chromatografi anvendes til oprensning af rekombinant HP-NAP med punktmutationer i et trin. Som vist i figur 4, de to rekombinante HP-NAP Y101H og HP-NAP E97GY101H mutanter, som efterligner HP-NAP af H. pylori NCTC 11639 og NCTC 11,637 stammer henholdsvis blev oprenset ved denne negativ modus batch-kromatografi med renhed på over 95%.
Til udførelse negativ modus batch under anvendelse af DEAE-harpikser til at oprense HP-NAP, bør pH-værdien af pufferen anvendt til oprensning justeres til 8,0at sikre, at hovedparten af HP-NAP er til stede i den ubundne fraktion. Mindre mængde HP-NAP var til stede i de ubundne fraktioner, når pH-værdien af pufferen er større eller mindre end 8,0 (figur 5). Selv om renheden af HP-NAP stede i de ubundne fraktioner blev forøget bare en lille smule som pH steg fra 7,0 til 9,0, mængden af HP-NAP stede i de ubundne fraktioner var det højeste, når pH-værdien af pufferen var pH 8.0 (figur 5). Mængden af de opløselige proteiner fra cellelysater læsset på harpiksen er en anden vigtig faktor for denne rensning. Her er forholdet 1,5 mg proteiner per milliliter harpiks for at opnå maksimal kapacitet af harpiksen til at absorbere urenheder fra E. coli (figur 6). Desuden kan renheden og udbyttet af HP-NAP opnået ved denne negativ modus batch chromatografi øges betydeligt ved at øge mængden af HP-NAP stede i den opløselige fraktion afE. coli lysater. Rekombinant HP-NAP var næsten fuldt genvundet i den opløselige fraktion efter cellelyse ved pH 9,0 (figur 7). Selv om opløseligheden af rekombinant HP-NAP i E. coli-lysater blev markant forøget, når cellerne blev lyseret i buffer med pH-værdi over 7,5 (figur 7), mindre end 90% af HP-NAP var til stede som det opløselige protein, når cellerne blev lyseret i buffer med pH lavere end 9,0.
Figur 1:. Skematisk Oversigt over Negativ Rensning af HP-NAP ved DEAE Harpikser i Batch Mode Rensningen starter med en batch-bindende procedure. Den opløselige proteinfraktion indeholdende HP-NAP opnået fra bakterielysater tilsættes til DEAE-harpiks præækvilibreret med Tris-puffer ved pH 8,0. De proteiner / harpiks opslæmninger inkuberes derefter ved 4 ° C i 1 time under forsigtig mixing. Under inkubationen værtscellen proteiner binder til harpiksen. HP-NAP stede i den ubundne fraktion opnås ved enten at indsamle supernatanten efter centrifugering eller gennemstrømning fraktion fra en søjle drives af tyngdekraften flow. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Eksemplarisk Resultat af Rensning af HP-NAP med negativ tilstand Batch Kromatografi med DEAE ionbytterharpikser Hele cellelysat (W) og opløseligt protein fraktion (S) i E. coli BL21 (DE3), der udtrykker HP-NAP og den ubundne fraktion (U) indeholdende HP-NAP fra DEAE ionbytningskromatografi blev analyseret ved SDS-PAGE (A), nativ PAGE (B), og western blotting (C). Det ubundne fraction med den angivne mængde af proteiner i intervallet fra 1 ug til 10 ug blev analyseret på en sølvfarvet SDS-PAGE-gel (D). Molekylmasser (M) i kDa er vist til venstre af de farvede geler og blottet. (Tilpasset fra henvisning 24) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Strukturel og Funktionel karakterisering af rekombinant HP-NAP oprenset fra E. coli ved negativ modus Batch Chromatography. (A) UV absorbans profilen blev registreret for HP-NAP elueret fra en gelfiltreringssøjle. De molekylære masser af de proteinmarkører blev angivet på kromatogrammet. (B) Den langt UV cirkulær dikroisme SPECTrom af HP-NAP blev indspillet i bølgelængdeområdet fra 195 til 260 nm. (C) Humane neutrofiler (1 x 10 5 celler) blev behandlet med 0,5 pM HP-NAP og D-PBS, pH 7,2, som en negativ kontrol ved 37 ° C. Indholdet af ROS genereret fra neutrofiler blev målt kontinuerligt ved anvendelse af en luminol-afhængig kemiluminescens-assay. Data blev repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse for et eksperiment i tre eksemplarer. (Tilpasset fra henvisning 24) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Oprensning af rekombinante HP-NAP Mutanter udtrykt i E. coli ved negativ modus Batch Chromatography. De opløselige proteinfraktioner E. coli BL21 (DE3) ekspression to rekombinante HP-NAP Y101H og HP-NAP E97GY101H mutanter og vildtype HP-NAP blev renset ved negativ modus kromatografi med DEAE-harpikser. De ubundne fraktioner blev analyseret ved SDS-PAGE. Molekylære masser (M) i kDa er vist til venstre af de farvede geler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Virkning af pH på oprensning af rekombinant HP-NAP udtrykt i E. coli ved negativ modus Batch Chromatography. Den opløselige fraktion af E. coli BL21 (DE3), der udtrykker HP-NAP lyseret ved pH 9,0 blev justeret til den angivne pH i området fra 7,0 til 9,0 og en proteinkoncentration på 0,3 mg / ml. Disse justeresfraktioner, angivet som belastning, blev derefter sat på DEAE-harpikser at oprense rekombinant HP-NAP ved negativ modus batch chromatografi ved 4 ° C. De ubundne, vask, og eluering fraktioner blev analyseret ved SDS-PAGE. Molekylmasser (M) i kDa er vist til venstre af de farvede geler. (Tilpasset fra henvisning 24) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Effekt af mængden af proteiner Loaded på DEAE Harpikser for Purifying Rekombinant HP-NAP Udtrykt i E. coli. De opløselige proteinfraktioner E. coli BL21 (DE3), der udtrykker HP-NAP blev påsat DEAE-harpikser ifølge den angivne forhold mellem mg proteiner pr milliliter af harpikser til rense recombirende HP-NAP af den negative tilstand batch kromatografi ved pH 8,0. De opløselige proteiner, angivet som belastning (L), den ubundne fraktion (A), vask fraktion (B), og elueringsfraktion (C) blev analyseret ved SDS-PAGE. Molekylmasser (M) i kDa er vist til venstre af de farvede geler. (Fra henvisning 24) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Virkning af pH på opløseligheden af HP-NAP i E. coli Lysater. (A) E. coli BL21 (DE3), der udtrykker HP-NAP blev suspenderet i iskold Tris-HCI-puffer ved den angivne pH i området fra 7,0 til 9,5. Cellerne blev lyseret og derefter helcellelysater (W) blev centrifugeret to separere opløselige fraktioner (S) og uopløselige pellets (I). Proteinerne blev analyseret ved SDS-PAGE. Molekylmasser (M) i kDa er vist til venstre af de farvede geler. (B) Procentdelen af opløseligheden af rekombinant HP-NAP i helcellelysat ved hver pH blev beregnet ud fra intensiteten af HP-NAP bånd på SDS geler for den opløselige fraktion (S) divideret med det for hele cellelysat (W ). Data blev repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse af mindst to forsøg. (Fra henvisning 24) Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: primere anvendt til mutagenese. Venligst click her for at se en større version af denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den negative tilstand batch-kromatografi med DEAE anionbytterharpikser præsenteret her er egnet til oprensning af rekombinant HP-NAP overudtrykkes i E. coli. PH-værdierne af de anvendte buffere i trinnene cellelyse og oprensning er meget afgørende for at sikre opløseligheden af HP-NAP i E. coli lysater og effektiv separering af rekombinant HP-NAP fra værtscelleurenheder hhv. Bakterieceller bør lyseres ved pH 9,0, og den negative oprensning bør udføres ved pH 8,0 til opnåelse af HP-NAP i højt udbytte og høj renhed. Typisk inddrivelse af HP-NAP er 90%, og typiske renhed er 95% 24. Da HP-NAP er til stede i den ubundne fraktion, bør en minimal, men tilstrækkelig mængde af harpiksen anvendes til at opnå dens maksimale kapacitet til at absorbere urenhederne. I vores tilfælde er den maksimale lastkapacitet er 1,5 mg af de opløselige proteiner fra E. coli lysater per milliliter harpiks.
Den bestemded protokol er udviklet til oprensning af rekombinant HP-NAP fra en 50 ml E. coli kultur. Udbyttet af HP-NAP er omkring 15 mg. Oprensningsprocessen kan enten nedskaleret eller opskaleret tilsvarende. For eksempel blev de to rekombinante HP-NAP Y101H og HP-NAP E97GY101H mutanter oprenset fra en 1 ml E. coli kultur ved hjælp af denne negative tilstand batch chromatografi. Både HP-NAP mutanter med renhed på over 95% blev opnået ved at opsamle den ubundne fraktion (figur 4). Denne negativ modus batch chromatografi er også blevet anvendt til at oprense rekombinant HP-NAP fra en 860 ml E. coli kultur. Genopretningen af trin ved hjælp af DEAE negative tilstand batch chromatografi har nået 97% med renhed på over 90%.
HP-NAP udtrykt i Bacillus subtilis (B. subtilis) er også med succes blevet oprenset ved denne DEAE negativ modus batch-chromatografii et trin 26. I vores B. subtilis ekspressionssystem, ekspressionsniveauet af HP-NAP er lav. HP-NAP kun tegner sig for omkring 5% af de samlede opløselige proteiner fra de bakterielle lysater. Selvom HP-NAP målrettet til oprensning er til stede i en lille mængde, HP-NAP med renhed på over 90% kan opnås ved at reducere forholdet mellem mængden af proteiner fra cellelysater fyldt på harpiksen effektivt at fjerne næsten hele den endogene proteiner fra B. subtilis 26. Således kan også anvendes denne metode til oprensning af rekombinant HP-NAP udtrykkes i andre bakterieværter.
Der er rapporteret adskillige fremgangsmåder til oprensning af rekombinant HP-NAP i sin native form 14-16. Imidlertid er en ekstra gelfiltrering kromatografisk trin kræves for at opnå HP-NAP i høj renhed. Denne negative kromatografisk oprensning kan effektivt give funktionel rekombinant HP-NAP med høj renhed i et trin. I Addititændt, er afsaltning trinnet ikke nødvendig på grund af koncentrationen af lavt saltindhold i den ubundne fraktion. Portionen-mode oprensning kunne også fjerne behovet for en kolonne. Således er denne negativ modus batch under anvendelse af DEAE-harpiks giver en enkel og effektiv metode til oprensning af HP-HAP i sin native form med højt udbytte og renhed. HP-NAP oprenset ved denne metode kan yderligere udnyttes til udvikling af vacciner, nye lægemidler og diagnostika for H. pylori-relaterede sygdomme eller til andre nye terapeutiske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
- Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
- Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
- de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
- Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
- Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
- Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
- Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
- Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
- Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
- Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
- Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
- Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
- Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
- Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
- Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
- Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
- Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
- Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
- Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
- Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
- Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
- Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).
