Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Один шаг Отрицательный хроматографической очистки Published: June 18, 2016 doi: 10.3791/54043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Institute of Molecular and Cellular Biology, National Tsing Hua University, 2Department of Life Science, National Tsing Hua University

Summary

Высокий метод доходности для одностадийного отрицательной очистки рекомбинантного Helicobacter Pylori активирующий нейтрофилы белок (HP-NAP) суперэкспрессированный в кишечной палочки с помощью диэтиламиноэтиловыми смол в пакетном режиме описана. HP-NAP очищают с помощью этого метода является полезным для разработки вакцин, лекарств, или для диагностики H. пилори -associated заболеваний.

Abstract

Helicobacter Pylori активирующий нейтрофилы белок (НР-NAP) является одним из основных факторов вирулентности Helicobacter Pylori (H.). Он играет важную роль в H. пилори индуцированный воспаление желудка путем активации нескольких врожденных лейкоциты , включая нейтрофилы, моноциты, и тучных клеток. Иммуногенные и иммуномодулирующие свойства HP-NAP делают его потенциальной диагностики и вакцины кандидат на H. пилори и новый кандидат препарат для лечения рака. Для того чтобы получить значительные количества очищенного HP-NAP, используемой для его клинического применения, является эффективным способом, чтобы очистить этот белок с высоким выходом и чистотой должна быть установлена.

В этом протоколе, мы описали метод одностадийного отрицательной хроматографической очистки рекомбинантного HP-NAP избыточная экспрессия Escherichia coli (E.coli) с помощью диэтиламиноэтил (DEAE) ионообменной смолы (например., Колонки Sephadex) Iп пакетном режиме. Рекомбинантный НР-NAP составляет почти 70% от общего количества белка в E. палочка и почти полностью восстановилась в растворимой фракции после лизиса клеток при рН 9,0. При оптимальном состоянии при рН 8,0, большинство HP-NAP восстанавливается в несвязанной фракции в то время как эндогенные белки из E. палочка эффективно удаляются с помощью смолы.

Этот метод очистки с использованием отрицательной пакетном режиме хроматографии с DEAE ионообменных смол дает функциональную HP ворсом из E. палочки в своей нативной форме с высоким выходом и чистотой. Очищенный HP-NAP может быть дополнительно использован для профилактики, лечения, и прогноз H. пилори -associated заболеваний, а также терапии рака.

Introduction

Helicobacter Pylori (H.) является основной причиной гастрита и язвенной болезни. Эта бактерия также классифицируется как канцероген в организме человека Международным агентством по изучению рака, часть Всемирной организации здравоохранения, в 1994 году было подсчитано , что распространенность H. инфекции пилори составляет 70% в развивающихся странах и на 30-40% в промышленно развитых странах 1. Даже при том , что уровень инфицированности H. пилори снижается в промышленно развитых странах, уровень инфицированности H. пилори в развивающихся странах по - прежнему высок 2. Стандартное лечение искоренить H. Инфекция пилори состоит из введения ингибитора протонной помпы, ИПП и двух антибиотиков, кларитромицин плюс амоксициллин или метронидазол 3. Тем не менее, повышение резистентности к антибиотикам у H. пилори терапия язвенной болезни о связанных настоятельно призывает к разработке новых стратегий по предотвращению Oг вылечить инфекцию. Разработка профилактических и / или терапевтической вакцинации против H. пилори может обеспечить альтернативный подход к контролю H. пилори инфекции.

Хеликобактерной активирующий нейтрофилы белок (HP-NAP), одним из основных факторов вирулентности пилори H, был впервые выявлен в водных экстрактов H. пилори с возможностью активировать нейтрофилы придерживаться эндотелиальных клеток и производят активные формы кислорода (ROS) 4. Нейтрофильной инфильтрации слизистой оболочки желудка обнаружено в H. pylori- инфицированных пациентов с активным гастритом может привести к воспалению и повреждению тканей желудка. Таким образом, НР-NAP может играть патологическую роль при активации нейтрофилов , чтобы вызвать воспаление желудка, которое вызывает дальнейшее язву или Н. пилори -associated заболеваний желудка. Тем не менее, НР-NAP является потенциальным кандидатом для клинического применения 5,6. В связи с иммуногенной и иммуномодулирующим проperties НР-NAP, этот белок может быть использован для разработки вакцин, терапевтических средств и диагностических инструментов. Клиническое исследование было проведено с использованием рекомбинантного для HP-NAP в качестве одного из компонентов белковой вакцины против H. пилори. Эта вакцина состоит из рекомбинантного HP-NAP, цитотоксин-ассоциированный ген (CagA) и вакуолизирующий цитотоксин А (VacA) белков , сформулированного с гидроксидом алюминия и далее было показано , что безопасность и иммуногенность у человека 7. Кроме того , НР-NAP действует как мощный иммуномодулятор , чтобы вызвать Т - хелперов типа 1 (Th1) -поляризованым иммунные ответы для лечения рака 8 и вниз регулировать Th2-опосредованные иммунные реакции , индуцируемые аллергических реакций и паразитарных инфекций 9,10. Что касается диагностики, рекомбинантный НР-NAP на основе ELISA , был применен для выявления антител сыворотки против HP-NAP в H. пилори -infected пациентов 11. Одно исследование показало , что уровень HP-NAP-специфических антител в сыворотке крови от H. PYLori -infected пациентов с раком желудка была достоверно выше , чем у пациентов с хроническим гастритом 12. Другое исследование также показало , что сывороточные антитела против HP-NAP связаны с наличием не-кардии аденокарциномы желудка 13. Таким образом, рекомбинантный НР-NAP на основе ELISA , может быть применен для определения сывороточных антител против HP-NAP для прогноза рака желудка в H. пилори -infected пациентов. Взятые вместе, очищенный HP-NAP может быть дополнительно использован для профилактики, лечения, и прогноз H. пилори -associated заболеваний, а также терапии рака.

Среди нескольких методов , используемых для очистки рекомбинантного HP-NAP выражается в Escherichia coli (E.coli) в своей нативной форме сообщалось до сих пор, необходим второй этап очистки с участием гель-фильтрационной хроматографии с получением высокочистого НР-NAP 14-16 , При этом способ с использованием негативного режима пакетной хроматографии сдиэтиламиноэтил (DEAE) ионообменные смолы описана для очистки HP-NAP сверхэкспрессируется в E. палочка с высоким выходом и высокой степенью чистоты. Этот метод очистки был основан на связывании белков клетки-хозяина и / или других, чем HP-NAP к смоле примесей. При рН 8,0, почти нет других белков, кроме HP-NAP извлекают из несвязанной фракции. Такая очистка подход с использованием DEAE ионообменной хроматографии в отрицательном режиме проста и экономии, позволяя очистку рекомбинантного HP-NAP с помощью одностадийной хроматографии путем сбора несвязанной фракции времени. В дополнение к HP-NAP, несколько других биомолекул, таких как вирусы 17, иммуноглобулин G (IgG) , 18, ​​гемоглобин 19, протеинфосфатазы 20, и фактор вирулентности флагеллином 21, также , как сообщалось, очищают с помощью ионообменной хроматографии в негативном Режим. Отрицательный режим является предпочтительным для ионообменной хроматографии, если примеси являются незначительнымикомпоненты , присутствующие в образце , подвергнутого быть очищено 22. Применение отрицательной хроматографии в очистки природных или рекомбинантных биомолекул был недавно рассмотрен 23.

В настоящем докладе дается шаг за шагом протокола для экспрессии рекомбинантного HP-NAP в E. палочка, лизис клеток и очистки HP-NAP с использованием негативного режима пакетной хроматографии с DEAE ионообменных смол. Если белок желательно для очистки пригоден для ионообменной хроматографии в отрицательном режиме, описанный протокол также может быть адаптирована в качестве отправной точки для разработки способа очистки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Человеческая кровь собирали у здоровых добровольцев с предварительного письменного информированного согласия и одобрения Совета по институциональному обзору Национального университета Цинхуа, Синьчжу, Тайвань.

1. Экспрессия рекомбинантных HP-NAP в E. палочки

  1. Приготовьте плазмиду pET42a-NAP , содержащую последовательность ДНК HP-NAP от H. пилори 26695 штамма , как описано выше 16. Подготовьте плазмиды, содержащие последовательность ДНК HP-NAP с желаемыми точечных мутаций, как описано (см протокол, этап 8).
  2. Преобразование 10 нг вышеуказанных плазмид ДНК в E. палочка BL21 (DE3) компетентные клетки теплового шока в течение 45 секунд при 42 ° С, полоса клетки на лизогении бульона (LB) агаром , содержащих 50 мкг / мл канамицина, и инкубировать пластин при 37 ° С в течение 16 часов.
  3. Инокулируйте единичные колонии в отдельные пробирки, содержащие 5 мл LB бульона из 50 мкг / мл канамицина, и выращивают их в качестве предварительных культивирований в 37 ° С в течение 16 часов при встряхивании со скоростью 170 оборотов в минуту.
  4. Инокулируйте 2 мл вышеназванного клеток предварительной культуры в 200 мл LB бульона, содержащего 50 мкг / мл канамицина, в колбу емкостью 1 л. Выдержите привит культуры колбы при 37 ° С в течение 2 ч при встряхивании при 170 оборотах в минуту, пока поглощение при 600 нм не достигнет приблизительно 0.4-0.5 детектируется УФ / ВИД спектрофотометр.
  5. Добавляют 80 мкл 1 М изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в указанную выше культуру до конечной концентрации 0,4 мМ, чтобы индуцировать экспрессию HP-NAP. Инкубируйте культуру в течение 3 часов, пока поглощение при 600 нм не достигает приблизительно 1,6-1,7.
  6. Центрифуга клетки при 6000 мкг при 4 ° С в течение 15 мин, чтобы удалить надосадочную жидкость. Хранить осадок клеток при -70 ° С до очистки.

2. Приготовление фракции растворимого белка, содержащего HP-NAP

Примечание: Все следующие шаги выполняются при температуре 4 ° С.

  1. Ресуспендируют в 50 мл клеточной рellet подготовлен в Протоколе стадии 1.6, в 20 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 9,0, 50 мМ NaCl, содержащего 0,13 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ), 0,03 мМ N-альфа-тозил-L-лизинильных-chloromethylketone (TLCK) и 0,03 мМ N-тозил-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (ТРСК) при температуре 4 ° С , как описано ранее 16.
  2. Разрушени клеток бактерий путем прохождения бактериальной суспензии через гомогенизатор высокого давления, работающие в диапазоне от 15000 до 20000 фунтов на квадратный дюйм в течение 7 раз при 4 ° С.
  3. Центрифуга Клеточный лизат при 30000 х г при температуре 4 ° С в течение 1 часа, чтобы отделить растворимые и нерастворимые фракции белков с помощью ультрацентрифуге. Передача супернатант в качестве фракции растворимого белка в стакан.
  4. Измерение концентрации белка в растворимой фракции белка по методу Бредфорда с использованием коммерческого набора с бычьим сывороточным альбумином (БСА) в качестве стандарта в соответствии с инструкциями изготовителя.
  5. Добавить 177,6 мкл 1 N HCl в 20 мл йе фракцию растворимого белка, полученный из протокола стадии 2.3, чтобы регулировать его значение рН от рН 9,0 до рН 8,0.
  6. Добавить 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, к указанному выше раствору белка с приведением конечной концентрации белка в 0,5 мг / мл.

3. Очистка рекомбинантного HP-NAP из E. палочки отрицательным Пакетный режим хроматографии с DEAE ионообменных смолах

  1. Приготовьте 15 мл ДЭАЭ смол.
    1. Взвешивают 0,6 г сухого порошка ДЭАЭ смол и подвесить его в 30 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 день.
    2. Центрифуга смолы при 10000 х г при температуре 4 ° С в течение 1 мин.
    3. Удалите и отбросить супернатант.
    4. Добавьте 15 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl.
    5. Повторите шаги 3.1.2 Протокол 3.1.4 четыре раза больше.
    6. Хранить в 15 мл смолы (обосновались 50% суспензии в 30 мл Трис-буфер) при 4 ° С для последующего использования.
      Примечание: Все на следующей стадииs проводят при температуре 4 ° С.
  2. Добавить 45 мл растворимых белков, полученных в стадии протокола от 2,6 до 15 мл смолы и приготовленную суспензию белка / смолы с магнитной мешалкой при температуре 4 ° С в течение 1 часа.
  3. Налить шлам белковый / смолы в колонку с пластиковой или стеклянной, снабженной запорным краном. Дайте смолу селиться под действием силы тяжести.
  4. Откройте запорный кран, чтобы позволить раствору белка бежать через колонку самотеком до тех пор пока уровень жидкости в колонне не только выше смолы. Соберите проточного как несвязанной фракции, которая содержит очищенный HP-NAP.
  5. Добавьте 15 мл охлажденного льдом 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl в колонку.
  6. Откройте запорный кран, чтобы позволить промывочный буфер для запуска через колонку самотеком до тех пор пока уровень жидкости в колонне не только выше смолы. Собирают Проточный в качестве промывного фракции.
  7. Повторите шаги Протокол от 3,5 до 3,6 раза четыре больше, чтобы собрать дополнительные фракции мыть.
  8. Добавьте 15 мл охлажденного льдом 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 М NaCl в колонну.
  9. Откройте запорный кран, чтобы позволить элюирующий буфер для запуска через колонку самотеком до тех пор пока уровень жидкости в колонне не только выше смолы. Соберите проточного как элюирования фракции.
  10. Повторите шаги Протокол от 3,8 до 3,9 раза четыре больше, чтобы собрать дополнительные фракции элюирования.

4. Буфер обмена и эндотоксина Удаление HP-NAP Очищают Negative Пакетный режим хроматографии с DEAE Смолы

Примечание: Очищенный НР-NAP экспрессируется в E. палочка должна быть подвергнута буфер обмена и удаление эндотоксина до начала стимуляции нейтрофилов.

  1. Выполните диализ , чтобы изменить буфер очищенного HP-NAP в фосфатно-буферном солевом растворе Дульбекко (D-PBS), рН 7,2, при 4 ° С с использованием диализных трубок с пропускания по молекулярному весу 14 кДа , как описано ранее 24.
  2. Фильтр диализуют HP-NAP через syringе фильтр с положительно заряженной гидрофильной мембраны, прикрепленной к 20 мл одноразового шприца при скорости потока в пределах от 2,5 до 4 мл / мин при 4 ° С для удаления эндотоксина.

5. Определение характеристик молекулярных свойств очищенным рекомбинантным HP-NAP с помощью додецилсульфата натрия-электрофорезом на геле полиакриламида (SDS-PAGE), вестерн-блоттинга, Native-PAGE, гель-фильтрационная хроматография, кругового дихроизма спектроскопии

  1. Анализ очищенного рекомбинантного HP-NAP с помощью SDS-PAGE и вестерн - блоттинга с гибридомной культуры надосадочную жидкость , содержащую моноклональное антитело мыши MAb 16F4 25 , как описано выше 24.
  2. Анализ очищенного HP-NAP нативным-PAGE и гель - фильтрационной хроматографии с целью изучения его олигомерного состояния , как описано выше 26.
  3. Анализ очищенного рекомбинантного HP-NAP с помощью спектроскопии кругового дихроизма для изучения его вторичную структуру , как описано выше 26.

6. Оценка чистоты HP-NAP серебром окрашиванием геля SDS-PAGE

  1. Подготовить Фиксирующий раствор, сенсибилизации раствор, раствор серебра, разработка решения, стоп-раствор и промывочный раствор в соответствии с инструкцией изготовителя набора для окрашивания серебром.
  2. Выполните серебряное окрашивание геля SDS-PAGE в соответствии с инструкцией изготовителя набора для окрашивания серебром.
  3. Приобретать изображение геля с системой визуализации.

7. Измерение РОС производства нейтрофилами, индуцированный HP-NAP

  1. Изолировать нейтрофилов человека из гепаринизированной крови человека путем осаждени с применением декстрана с последующим центрифугированием в градиенте плотности , как описано выше 24.
  2. Измерение производства ROS из нейтрофилов, стимулированных HP-NAP с помощью люминолзависимой хемилюминесценции анализа.
    1. Включите планшет-ридере и установить температуру при 37 ° С. Разместитьпустой плоское дно 96-луночного белая пластина внутри пластины считывания камеры, позволяя ей нагреваться до 37 ° С.
    2. Готовят Стимул смеси в D-PBS, рН 7,2, содержащего 0,9 мМ CaCl 2, 0,5 мМ MgCl 2, и 13,3 мкМ 5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион (люминол) с наличием и отсутствием 0,67 мкМ эндотоксинов удаляют HP-NAP, полученного из протокола шага 4.2.
    3. Регулировка концентрации нейтрофилах человека , приготовленных из протокола шага от 7,1 до 2 × 10 6 клеток / мл в D-PBS, рН 7,2, содержащем 5 мМ глюкозы.
    4. Добавляют 50 мкл суспензии нейтрофилов в каждую лунку 96-луночного в то время как пластины.
    5. Добавьте 150 мкл стимулирующих смесей, приготовленных из протокола этапа 7.2.2 в лунку, содержащую нейтрофилы в интервале времени 5 секунд на каждую лунку.
    6. Измерьте излучение хемилюминесценции в течение 5 сек на лунку в течение в течение трех часов с использованием планшет-ридера.

8.Конструирование ДНК плазмид укрывательство HP-NAP Мутанты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) основе сайта-прямой мутагенеза

Примечание: ПЦР-сайт-прямой мутагенез был создан в основном , как описано ранее 27 за исключением того, что "молчащие" сайты рестрикции были введены мутагенеза праймеров с помощью сайт-направленного мутагенеза (SDM) -assist программного обеспечения 28.

  1. Выполнение реакции ПЦР.
    1. Добавляют 10 нг плазмиды pET42a-NAP, 1 мкМ пар праймеров мутагенеза , перечисленных в Таблице 1, 200 мкМ дезоксинуклеозидтрифосфатами (дНТФ), и 3 единицы с высокой точностью воспроизведения смеси ферментов ПЦР в ПЦР - пробирку , содержащие деионизированную воду, давая окончательное объем 25 мкл.
    2. Инициировать циклов ПЦР при 95 Не ° С в течение 10 мин дл денатурации ДНК - матрицы, и следуют с 12 циклов амплификации при 95 ° С в течение 1 минуты, Тпл нет -5 ° С в течение 1 минуты и 72 ° С в течение 6 мин.
    3. Завершите циклы ПЦР сстадию отжига при Т м п.п. -5 ° С в течение 1 мин и стадию удлинения при 72 ° С в течение 30 мин.
  2. Treat 15 мкл ПЦР-продукта с 0,4 мкл ДПН I рестриктазы при 37 ° С в течение 2 ч, а затем анализируют по 2 мкл ДПШ I-обработанного продукта ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле.
  3. мутанты экрана.
    1. Transform 2 мкл ПЦР - продукта в E. палочки DH5 & компетентные клетки путем теплового шока в течение 45 секунд при 42 ° C.
    2. Распространение трансформированных клеток на пластине LB, содержащей 50 мкг / мл канамицина и инкубируйте при 37 ° C в течение 16 часов.
    3. Изолировать плазмидной ДНК из бактериальных колоний с использованием коммерческого набора для щелочного лизиса в соответствии с протоколом производителя.
    4. Лечить плазмиды ДНК, выделенной в Протоколе стадии 8.3.3 с XhoI ферментом рестрикции, чтобы проверить наличие желаемых молчащих мутаций в соответствии с протоколом производителя.
    5. Выстраивание последовательностиДНК плазмиды уточнена шагом протокола 8.3.4 с промотором Т7 праймера, чтобы подтвердить коррекцию кодирующей последовательности мутантов НР-NAP в соответствии с протоколом производителя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Принципиальная схема экспериментальной процедуры отрицательной очистки рекомбинантного HP-NAP экспрессируется в E. палочка с использованием DEAE ионообменных смол в пакетном режиме, показан на рисунке 1. Этот метод очистки основан на связывании белков клетки - хозяина и / или других , чем HP-NAP к смоле примесей. При рН 8,0, почти нет других белков , кроме HP-NAP в своей нативной форме извлекают из несвязанной фракции (Фигура 2А и В). Очищенный НР-NAP в несвязанной фракции иммунодетектировали антителом против HP-NAP (фиг.2С), и его чистота была выше , чем 97% , как подтверждено окрашиванием серебром (рис 2D). Кроме того, очищенный рекомбинантный НР-NAP сохранил свою олигомерной форме , как анализировали методом нативного-PAGE (Фигура 2В) и гель - фильтрационной хроматографии (фиг.3А). Круговой дихроизм spectroscopАнализ IC показал , что очищенный белок в основном состоит из альфа-спиралей (рис 3б). Кроме того , очищенный НР-NAP был способен стимулировать нейтрофилов человека , чтобы произвести ROS (фиг.3С). Таким образом, рекомбинантный НР-NAP очищают с помощью этого подхода является то, в своей нативной форме с биологической активностью. Кроме того, этот отрицательный пакетный режим хроматографии может быть использован для очистки рекомбинантного HP-NAP с точечными мутациями в одном шаге. Как показано на рисунке 4, два рекомбинантных HP-NAP Y101H и HP-NAP E97GY101H мутантов, которые имитируют HP-ворс H. пилори НКТЦ 11639 и NCTC 11,637 штаммы, соответственно, были очищены с помощью этой отрицательной пакетном режиме хроматографии с чистотой выше 95%.

Для выполнения отрицательного пакетного режима хроматографии с использованием DEAE смолы для очистки HP-NAP, значение рН буфера, используемого для очистки должна быть скорректирована до 8,0чтобы гарантировать, что большинство HP-NAP присутствует в несвязанной фракции. Меньшее количество HP-NAP присутствовал в несвязанной фракции , когда значение рН буфера был выше или ниже , чем 8,0 (рисунок 5). Даже при том, что чистота НР-NAP настоящее время в несвязанной фракций была увеличена только немного, как рН увеличилось от 7,0 до 9,0, количество НР-NAP настоящее время в несвязанной фракций был самым высоким, когда значение рН буфера был рН 8,0 (рисунок 5). Количество растворимых белков из клеточных лизатов загружают на смоле является еще одним важным фактором для этой очистки. При этом отношение составляет 1,5 мг белков на миллилитр смолы для достижения максимальной емкости смолы для поглощения примесей из E. палочка (рисунок 6). Кроме того, чистота и выход НР-NAP, полученного с помощью этого отрицательного пакетного режима хроматографии может быть существенно увеличена за счет увеличения количества НР-NAP, присутствующего в растворимой фракцииE.coli , лизатов. Рекомбинантный HP-NAP был почти полностью восстановилась в растворимой фракции после лизиса клеток при рН 9,0 (рис 7). Даже при том , что растворимость рекомбинантного HP-NAP в E. палочки лизаты значительно увеличивалась , когда клетки лизируют в буфере с рН выше , чем 7,5 (фиг.7), менее 90% от HP-NAP присутствовал в качестве растворимого белка , когда клетки лизируют в буфере с рН ниже 9,0.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Схема Схема Отрицательного Очистка HP-NAP с помощью DEAE Смолы в пакетном режиме очистки начинается с процедуры пакетного связывания. Растворимая фракция белка, содержащего HP-NAP, полученный из бактериальных лизатов добавляют к смоле DEAE, предварительно уравновешенную Трис-буфером при рН 8,0. Белки / смола Суспензии затем инкубировали при 4 ° С в течение 1 ч при осторожном Mixiнг. Во время инкубации клетки-хозяина белки связываются со смолой. HP-NAP присутствует в несвязанной фракции получают либо путем сбора надосадочной жидкости после центрифугирования или проточного фракции из колонки запуска самотеком. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рис . 2: Примерный Результат очистки HP-NAP отрицательным Пакетный режим хроматографии с DEAE ионообменных смолах Весь клеточный лизат (W) и фракции растворимого белка (S) Е. палочка BL21 (DE3) , выражающая HP-NAP и несвязанного фракции (U) , содержащей НР-NAP с DEAE ионообменной хроматографии анализировали с помощью SDS-PAGE (A), нативный-PAGE (В) и вестерн - блоттинга (C). Несвязанный гидроразрывации с указанным количеством белков в пределах от 1 мкг до 10 мкг, анализировали на серебряной окрашенных SDS-PAGE гель (D). Молекулярные массы (M) в кД указаны слева от окрашенных гелей и блоттинга. (Взято из ссылки 24) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Структурная и функциональная характеристика рекомбинантного HP-NAP Очищенная из E. палочки отрицательным Пакетный режим хроматографии. (A) Профиль УФ - поглощение регистрировали для HP-NAP , элюированной из колонки гель - фильтрации. Молекулярные массы белковых маркеров указаны на хроматограмме. (В) Дальняя УФ кругового дихроизма ОФЭКТРом НР-NAP был записан в диапазоне длин волн от 195 до 260 нм. (C) нейтрофилах человека (1 х 10 5 клеток) обрабатывали 0,5 мкМ HP-NAP и D-PBS, рН 7,2, в качестве отрицательного контроля при 37 ° С. Содержание ROS генерируется из нейтрофилов была измерена непрерывно с помощью люминолзависимой хемилюминесценции анализа. Данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение эксперимента в трех экземплярах. (Взято из ссылки 24) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Очистка рекомбинантных Мутанты НР-NAP экспрессируется в E. палочки отрицательным Пакетный режим хроматографии. Растворимые белковые фракции Е. палочки BL21 (DE3) экспрессии двух рекомбинантных HP-NAP Y101H и HP-NAP E97GY101H мутантов и дикого типа HP-NAP очищают с помощью отрицательного режима хроматографии с DEAE смол. Несвязанные фракции анализировали с помощью SDS-PAGE. Молекулярные массы (M) в кД указаны слева от окрашенных гелей. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Влияние рН - буфера на очистки рекомбинантного HP-NAP экспрессируется в E. палочки отрицательным Пакетный режим хроматографии. Растворимая фракция Е. палочка BL21 (DE3) , выражающая HP-NAP лизису при рН 9,0 доводили до указанного рН в интервале от 7,0 до 9,0 и концентрации белка 0,3 мг / мл. Они скорректированыФракции, указанные в качестве нагрузки, затем наносили на DEAE смолы для очистки рекомбинантного HP-NAP с помощью отрицательного режима пакетной хроматографии при 4 ° С. Несвязанные, промывка и элюирование фракции анализировали с помощью SDS-PAGE. Молекулярные массы (M) в кД указаны слева от окрашенных гелей. (Взято из ссылки 24) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Влияние количества белков , погруженных на DEAE Смолы для Очищающий Рекомбинантный HP-NAP экспрессируется в E. палочка. Растворимые белковые фракции Е. палочка BL21 (DE3) экспрессирующих НР-NAP погрузили на DEAE смолы в соответствии с указанное соотношение белков мг на миллилитр смолы, чтобы очистить recombiNant HP-NAP с помощью отрицательного режима пакетной хроматографии при рН 8,0. Растворимые белки, указаны в качестве нагрузки (L), несвязанной фракции (А), промывной фракции (В), и элюирование фракции (С) анализировали с помощью SDS-PAGE. Молекулярные массы (M) в кД указаны слева от окрашенных гелей. (Из справки 24) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7: Влияние рН на растворимость HP-NAP в E. Лизаты палочка. (A) E. палочка BL21 (DE3) экспрессирующих НР-NAP, суспендировали в охлажденной льдом буфера Трис-HCl при указанном рН в интервале от 7,0 до 9,5. Клетки лизируют, а затем целые клеточные лизаты (W) центрифугировали тO отделить растворимые фракции (увлажнителей) и нерастворимые гранулы (I). Белки анализировали с помощью SDS-PAGE. Молекулярные массы (M) в кД указаны слева от окрашенных гелей. (Б) процент растворимости рекомбинантного HP-NAP во всей лизата клеток при каждом значении рН рассчитывали по интенсивности НР-NAP полосы на SDS - гели для растворимой фракции (S) , деленное на что в течение всего клеточного лизата (Вт ). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение по крайней мере двух экспериментов. (Из справки 24) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1
Таблица 1: праймеры , используемые для мутагенеза. Пожалуйста , клИк здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Отрицательный пакетный режим хроматографии с DEAE анионитов , представленные здесь подходит для очистки рекомбинантного HP-NAP сверхэкспрессируется в E палочки. Значения рН буферов , используемых на стадиях лизиса клеток и очистки очень важно для обеспечения растворимости HP-NAP в E. палочки лизаты и эффективное отделение рекомбинантного HP-NAP от примесей клеток хозяина, соответственно. Бактериальные клетки должны быть лизированы при рН 9,0, а отрицательный очистку следует проводить при рН 8,0 для получения HP-NAP с высоким выходом и высокой степенью чистоты. Типичное восстановление HP-NAP составляет 90%, и типичные чистота составляет 95% 24. Поскольку HP-NAP присутствует в несвязанной фракции, минимальный, но достаточное количество смолы, следует использовать для достижения своего максимального потенциала для поглощения примесей. В нашем случае, максимальная грузоподъемность составляет 1,5 мг растворимых белков из E. палочки лизаты на миллилитр смолы.

ProviDed протокол предназначен для очистки рекомбинантного HP-NAP из 50 мл E. палочки культуры. Выход HP-NAP составляет около 15 мг. Процесс очистки может быть либо уменьшенную или в увеличенном масштабе, соответственно. Например, два рекомбинантных НР-NAP Y101H и HP-NAP E97GY101H мутанты были очищены от 1 мл E. палочки культуры, используя этот негативный режим пакетной хроматографии. Оба HP-NAP мутанты с чистотой выше 95% были получены путем сбора несвязанных фракции (рисунок 4). Этот отрицательный пакетный режим хроматографии также применяются для очистки рекомбинантного HP ворсом из 860 мл E. палочка культуры. Восстановление шага с использованием DEAE отрицательный режим пакетной хроматографии достиг 97% с чистотой выше 90%.

HP-NAP выражается в Сенная палочка (B. Сенная) также успешно очищают с помощью этого DEAE отрицательный режим пакетной хроматографиив одном шаге 26. В нашем B. Система экспрессии зиЫШз, уровень экспрессии HP-NAP низка. HP-NAP составляет лишь около 5% от общего количества растворимых белков из бактериальных лизатов. Несмотря на то, НР-NAP, предназначенные для очистки присутствует в небольшом количестве, HP-NAP с чистотой выше 90% могут быть получены за счет уменьшения отношения количества белков из лизатов клеток, погруженных на смоле, чтобы эффективно удалить практически всю эндогенную белки из B. Сенная 26. Таким образом, этот способ может быть также применен для очистки рекомбинантного HP-NAP, выраженное в других бактериальных хозяевах.

Несколько методов было зарегистрировано для очистки рекомбинантного HP-NAP в своей нативной форме 14-16. Тем не менее, требуется дополнительный гель-фильтрации стадии хроматографической для получения HP-NAP с высокой степенью чистоты. Эта очистка отрицательный хроматографический может эффективно выход функционального рекомбинантного HP-NAP с высокой степенью чистоты в одну стадию. В дополнительна стадию обессоливания не требуется из-за низкой концентрации соли в несвязанной фракции. Очистка загрузочном режиме может также устранить необходимость в колонке. Таким образом, этот отрицательный пакетный режим хроматографии с использованием DEAE смолы предлагает простой и эффективный метод для очистки HP-ГАП в своей нативной форме с высоким выходом и чистотой. НР-NAP очищают с помощью этого способа может быть дополнительно использованы для разработки вакцин, новых лекарственных препаратов и диагностических средств для Н. пилори заболевания или о связанных для других новых терапевтических применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
pET42a-NAP  N/A N/A prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3) Thermo Fisher Scientific Inc C6000-03 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
Kanamycin Amresco 25389-94-0 http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) MD Biomedical Inc 101-367-93-1 http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name
=IPTG%20
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich 10837091001 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW
N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) Sigma-Aldrich T7254 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW
N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) Sigma-Aldrich T4376 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW
Protein standard (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich P5619  a standard protein for Bio-Rad Protein Assay
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW
DEAE–Sephadex  A-25 chloride form Sigma-Aldrich A25120 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW
Spectrum/Por dialysis tubing Spectrum Laboratories 132720 with molecular weight cutoff of 14 kDa
http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Acrodisc® units with Mustang® E membrane Pall MSTG25E3 for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min
http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
mouse monoclonal antibody MAb 16F4 N/A N/A raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;  A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare Life Sciences 28989335 for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
PlusOne silver staining kit, protein GE Healthcare Life Sciences 17-1150-01 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Life Sciences 17-1440-02 for density gradient centrifugation to purify human neutrophils
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure
_16963/17144002
Flat bottom 96-well white plate Thermo Fisher Scientific Inc 236108 http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
Luminol Sigma-Aldrich A8511 protected from light
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW
Expand  long template PCR system Sigma-Aldrich 11681834001 source of High Fidelity PCR enzyme mix
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW
Dpn I New England Biolabs R0176S https://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho I New England Biolabs R0146S https://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5α Thermo Fisher Scientific Inc 18265-017 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
Name Company Product Number Comments
Equipment
 
U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer Hitachi  N/A out of market and upgraded to a new model
http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer Avestin Inc C315320 http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge Hitachi Koki Co 90106401 for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates
http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
ÄKTA FPLC GE Healthcare Life Sciences 18-1900-26 for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv model 62ADS CD spectrophotometer Aviv Biomedical N/A out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php
LAS-3000 imaging system Fujifilm N/A discontinued and replaced
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter Perkin-Elmer 1420-018 for chemiluminescence detection
http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
  2. Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
  3. Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
  4. Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
  5. Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
  6. de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
  7. Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
  8. Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
  9. Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
  10. Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
  11. Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
  12. Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
  13. Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
  14. Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
  15. Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
  16. Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
  17. Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
  18. Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
  19. Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
  20. Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
  21. Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
  22. Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
  23. Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
  24. Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
  25. Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
  26. Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
  27. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
  28. Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).

Tags

Immunology выпуск 112 HP-NAP, DEAE Negative хроматография несвязанный фракцию Batch хроматографии,
Один шаг Отрицательный хроматографической очистки<em&gt; Хеликобактерной</em&gt; Активирующий нейтрофилы белок избыточно экспрессируется в<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; В пакетном режиме
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuo, T. Y., Hong, Z. W., Tsai, C.… More

Kuo, T. Y., Hong, Z. W., Tsai, C. C., Yang, Y. C., Fu, H. W. One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode. J. Vis. Exp. (112), e54043, doi:10.3791/54043 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter