Summary
Eine hohe Ausbeute Verfahren zur einstufigen negativen Reinigung von rekombinanten Helicobacter pylori in Escherichia coli Neutrophile aktivierendes durch Verwendung Diethylaminoethyl Harze im Batch - Modus überexprimiert Protein (HP-NAP) beschrieben ist. HP-NAP durch dieses Verfahren gereinigt ist vorteilhaft für die Entwicklung von Impfstoffen, Medikamente oder Diagnostika für H. pylori -assoziierte Krankheiten.
Abstract
Helicobacter pylori Neutrophilen-aktivierendes Protein (HP-NAP) ist ein wichtiger Virulenzfaktor von Helicobacter pylori (H. pylori). Es spielt eine entscheidende Rolle in H. pylori induzierte Magenentzündung durch verschiedene angeborene Leukozyten einschließlich Neutrophile, Monozyten und Mastzellen aktiviert werden . Die immunogene und immunmodulatorische Eigenschaften von HP-NAP machen es zu einem möglichen diagnostischen und Impfstoffkandidaten für H. pylori und ein neuer Medikamentenkandidaten für die Krebstherapie. Um erhebliche Mengen an gereinigtem HP-NAP für seine klinische Anwendung, ein effizientes Verfahren dieses Protein mit hoher Ausbeute und Reinheit zu erhalten, verwendet zu reinigen eingerichtet werden muss.
In diesem Protokoll haben wir ein Verfahren zur einstufigen negativen chromatographischen Reinigung von rekombinantem HP-NAP überexprimiert in Escherichia coli (E. coli) unter Verwendung von Diethylaminoethyl (DEAE) Ionenaustauscherharzen beschrieben (z. B. Sephadex) in Batch-Modus. Rekombinante HP-NAP bildet fast 70% des Gesamtproteins in E. coli und wird nahezu vollständig in der löslichen Fraktion nach Zelllyse bei pH 9,0 gewonnen. Unter der optimalen Bedingung bei einem pH von 8,0, wird der Großteil der HP-NAP in der ungebundenen Fraktion gewonnen , während die endogenen Proteine aus E. coli effizient durch das Harz entfernt.
Dieses Reinigungsverfahren unter Verwendung von negativen Modus batch - Chromatographie mit DEAE - Ionenaustauschharze ergibt funktionelle HP-NAP aus E. coli in seiner nativen Form mit hoher Ausbeute und Reinheit. Das gereinigte HP-NAP könnte weiter zur Verhütung, Behandlung verwendet werden, und die Prognose von H. pylori -assoziierte Erkrankungen sowie Krebstherapie.
Introduction
Helicobacter pylori (H. pylori) ist eine Hauptursache von Gastritis und Magengeschwüren. Dieses Bakterium ist auch als Karzinogen beim Menschen von der Internationalen Agentur für Krebsforschung, Teil der Weltgesundheitsorganisation im Jahr 1994 eingestuft Es wurde geschätzt , dass die Prävalenz von H. pylori - Infektion ist 70% in den Entwicklungsländern und 30-40% in den Industrieländern 1. Auch wenn die Infektionsrate von H. pylori wird in den Industrieländern abnimmt, die Infektionsrate von H. pylori in den Entwicklungsländern ist 2 immer noch hoch. Die Standardbehandlung H. auszurotten pylori - Infektion besteht aus der Verabreichung eines Protonenpumpenhemmers, PPI, und zwei Antibiotika, Clarithromycin und Amoxicillin oder Metronidazol 3. Allerdings ist der Anstieg der Antibiotikaresistenz in der H. pylori verwandtes Geschwür Therapie die Entwicklung neuer Strategien drängt o zu verhindernr die Infektion zu heilen. Entwicklung von präventiven und / oder therapeutischen Impfung gegen H. pylori könnte einen alternativen Ansatz bieten H. zu steuern pylori - Infektion.
Neutrophilen-aktivierende Protein Helicobacter pylori (HP-NAP), ein wichtiger Virulenzfaktor von H pylori, wurde zuerst in Wasserextrakten von H. identifiziert pylori mit der Fähigkeit , Neutrophile zu aktivieren , um an endotheliale Zellen anheften und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) 4 herzustellen. Neutrophile Infiltration der Magenschleimhaut in H. gefunden pylori - infizierten Patienten mit aktiver Gastritis kann bei der Entzündung und Gewebeschädigung des Magens führen. So Neutrophilen eine pathologische Rolle spielen , indem sie die Aktivierung HP-NAP kann eine Magenentzündung zu induzieren, die weiter Geschwür oder H. verursacht pylori -assoziierten Magenerkrankungen. Dennoch ist HP-NAP ein potentieller Kandidat für die klinische Anwendung 5,6. Aufgrund der immunogene und immunmodulatorische Proschaften von HP-NAP könnte dieses Protein verwendet werden, um Impfstoffe, therapeutische Mittel und Diagnose-Tools zu entwickeln. Eine klinische Studie wurde unter Verwendung von rekombinantem HP-NAP als eine der Komponenten eines Proteins Impfstoff gegen H. durchgeführt pylori. Dieser Impfstoff besteht aus rekombinanten HP-NAP, Cytotoxin-assoziierte Gen A (CagA) und vacuolating cytotoxin A (VacA) Proteine mit Aluminiumhydroxid formuliert und hat sich weiter beim Menschen sicher und immunogen zu sein 7 gezeigt. Auch wirkt HP-NAP als ein potenter Immunmodulator T - Helfer Typ 1 (Th1) -polarisierte Immunantworten für die Krebstherapie 8 und nach unten zu regulieren Th2-vermittelte Immunreaktionen durch allergische Reaktionen und parasitäre Infektionen 9,10 ausgelöst auszulösen. Wie für die Diagnostik, wurde Serum - Antikörper gegen HP-NAP in H. zu erkennen rekombinanten HP-NAP-basierten ELISA angewendet pylori - infizierten Patienten 11. Eine Studie zeigte , dass der Pegel des HP-NAP-spezifische Antikörper in Seren von H. pylori -infizierten Patienten mit Magenkrebs als die 12 von Patienten mit chronischer Gastritis signifikant höher war. Eine andere Studie zeigte auch , dass Serumantikörper gegen HP-NAP mit der Anwesenheit von nicht-Cardia Adenokarzinom des Magens 13 verbunden sind. So können rekombinante HP-NAP-basierten ELISA Serum - Antikörper gegen HP-NAP für die Prognose von Magenkrebs in H. zu erkennen , anzuwenden pylori - infizierten Patienten. Zusammengenommen können das gereinigte HP-NAP weiter für die Prävention, Behandlung verwendet werden, und die Prognose von H. pylori -assoziierte Erkrankungen sowie Krebstherapie.
Unter den verschiedenen zur Reinigung von rekombinantem HP-NAP Methoden exprimiert in Escherichia coli (E. coli) in seiner nativen Form berichtet so weit, einem zweiten Reinigungsschritt beteiligt Gelfiltrationschromatographie hochreines HP-NAP zu erhalten , ist erforderlich 14-16 . Hier wird ein Verfahren unter Verwendung von negativen Modus batch-Chromatographie mitDiethylaminoethyl (DEAE) Ionenaustauscherharzen wird zur Reinigung von HP-NAP beschrieben überexprimiert in E. coli mit hoher Ausbeute und hoher Reinheit. Dieses Reinigungsverfahren wurde auf die Bindung von Wirtszellproteinen basieren und / oder anderen Verunreinigungen als HP-NAP auf das Harz. Bei pH 8,0, fast keine andere Proteine außer HP-NAP werden aus der ungebundenen Fraktion gewonnen. Diese Reinigung Ansatz unter Verwendung von DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie in negativen Modus ist einfach und zeitsparend durch Reinigung von rekombinantem HP-NAP über Einstufen-Chromatographie durch die Erhebung von der ungebundenen Fraktion ermöglicht. Neben HP-NAP mehrere andere Biomoleküle, wie beispielsweise 17 Viren, Immunoglobulin G (IgG) 18, Hämoglobin 19, Proteinphosphatase 20 und Virulenzfaktor Flagellin - 21, wurden auch durch Ionenaustauschchromatographie zu reinig in negativer berichtet Modus. Der negative Modus wird für die Ionenaustauschchromatographie bevorzugt, wenn die Verunreinigungen gering sindvorhandenen Komponenten in der Probe unterzogen , bis 22 gereinigt werden. Die Anwendung der negativen Chromatographie bei der Reinigung von natürlichen oder rekombinanten Biomoleküle wurde 23 vor kurzem überprüft.
Der vorliegende Bericht liefert eine Schritt für Schritt - Protokoll für die Expression von rekombinanten HP-NAP in E. coli, Lyse der Zellen und die Reinigung von HP-NAP unter Verwendung von negativen Modus batch - Chromatographie mit DEAE - Ionenaustauschharze. Wenn ein Protein für die Reinigung erwünscht für Ionenaustauschchromatographie in Negativmodus geeignet ist, könnte das beschriebene Protokoll auch als Ausgangspunkt für die Entwicklung eines Reinigungsverfahrens angepasst werden.
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Protocol
Menschliches Blut wurde von gesunden Freiwilligen mit vorheriger schriftlicher Einwilligung nach Aufklärung und Zustimmung von der Institutional Review Board der National Tsing Hua University in Hsinchu, Taiwan gesammelt.
1. Expression von rekombinantem HP-NAP in E. coli
- Bereiten Sie das Plasmid pET42a-NAP die DNA - Sequenz von HP-NAP von H. enthält , pylori 26695 Stamm wie zuvor beschrieben 16. Herstellung der Plasmide, die die DNA-Sequenz von HP-NAP mit den gewünschten Punktmutationen enthalten, wie beschrieben (siehe Protokoll, Schritt 8).
- Transformation 10 ng der oben genannten DNA - Plasmide in E. coli BL21 (DE3) kompetente Zellen durch Hitzeschock für 45 Sekunden bei 42 ° C, streak die Zellen auf LB-Medium (LB) Agarplatten , enthaltend 50 & mgr; g / ml Kanamycin, und Inkubation der Platten bei 37 ° C für 16 Stunden.
- Beimpfen einzelne Kolonien in einzelne Röhrchen mit 5 ml LB-Brühe mit 50 ug / ml Kanamycin und wachsen sie als Vorkulturen bei 37 ° C für 16 Stunden mit bei 170 Umdrehungen pro Minute schütteln.
- Beimpfen von 2 ml der oben Vorkultur Zellen in 200 ml LB-Brühe, die 50 ug / ml Kanamycin in einem 1-l-Kolben. Inkubieren des beimpften Kulturkolben bei 37 ° C für 2 h mit bis die Absorption bei 600 bei 170 rpm Schütteln nm etwa 0,4-0,5 durch einen UV / VIS-Spektrophotometer detektiert erreicht.
- Hinzufügen 80 ul 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) in der obigen Kultur bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mM, die Expression von HP-NAP zu induzieren. Inkubieren der Kultur für 3 h, bis die Absorption bei 600 nm etwa 1,6-1,7 erreicht hat.
- Zentrifuge die Zellen bei 6.000 × g bei 4 ° C für 15 min den Überstand zu entfernen. Lagern Sie das Zellpellet bei -70 ° C bis zur Reinigung.
2. Herstellung der löslichen Proteinfraktion, die HP-NAP
Anmerkung: Alle der folgenden Schritte durchgeführt werden bei 4 ° C.
- Resuspendieren 50 ml der Zell pEllet in Protocol Schritt 1.6 hergestellt, in 20 ml 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM NaCl, enthaltend 0,13 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0.03 mM N-alpha-Tosyl-L-Lysinyl-Chlormethylketon (TLCK) und 0,03 mM N-Tosyl-L-phenylalaninyl-Chlormethylketon (TPCK) bei 4 ° C , wie zuvor beschrieben 16.
- Stören die Bakterienzellen durch die Bakteriensuspension durch einen Hochdruckhomogenisator bei einem Bereich von 15.000 bis 20.000 psi für 7-mal bei 4 ° C betrieben verläuft.
- Zentrifuge das Zelllysat bei 30000 × g bei 4 ° C für 1 Stunde die löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen zu trennen, indem eine Ultrazentrifuge. Den Überstand als lösliche Proteinfraktion in ein Becherglas.
- Messung der Proteinkonzentration der löslichen Proteinfraktion von der Bradford-Methode eines kommerziellen Kits mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard verwendet, gemäß der Anweisungen des Herstellers.
- In 177,6 ul 1 N HCl in 20 ml the lösliche Proteinfraktion aus Protocol Schritt 2.3 erhaltenen 8,0 pH im Bereich von pH 9,0 bis sein pH-Wert einzustellen.
- Hinzufügen 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl zu der obigen Proteinlösung auf die endgültige Proteinkonzentration machen 0,5 mg / ml sein.
3. Reinigung von rekombinantem HP-NAP Von E. coli durch Negativ - Modus Batch - Chromatographie mit DEAE Ionenaustauscherharze
- Vorbereitung 15 ml DEAE-Harze.
- Abwiegen 0,6 g trockenes Pulver aus DEAE-Harze und suspendieren sie in 30 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl bei Raumtemperatur für mindestens 1 Tag.
- Zentrifugieren des Harzes bei 10.000 x g bei 4 ° C für 1 min.
- Entfernen und den Überstand verwerfen.
- 15 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl.
- Wiederholen Protokoll 3.1.2 bis 3.1.4 vier weitere Male Schritte.
- Lagern Sie die 15 ml siedelten Harz (50% ige Aufschlämmung in 30 ml Tris-Puffer) bei 4 ° C für die spätere Verwendung.
Hinweis: Alle folgenden Schritts werden bei 4 ° C durchgeführt.
- Hinzufügen 45 ml der löslichen Proteine in Protokolls hergestellt Schritt 2,6-15 ml des Harzes und rühre das Protein / Harzaufschlämmung mit einem Magnetrührer bei 4ºC für 1 Stunde.
- Gießen das Protein / Harz-Aufschlämmung in eine Plastik- oder Glassäule mit einem Absperrhahn versehen. Lassen Sie das Harz unter Schwerkraft absetzen.
- Öffnen des Absperrhahns die Proteinlösung zu ermöglichen, durch die Kolonne durch Schwerkraftströmung zu laufen, bis der Flüssigkeitspegel in der Säule unmittelbar oberhalb der Harz ist. Sammeln Sie die Flow-Through als der ungebundenen Fraktion, die das gereinigte HP-NAP enthält.
- 15 ml eiskaltem 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl in die Säule.
- Öffnen des Absperrhahns der Waschpuffer zu ermöglichen, durch die Kolonne durch Schwerkraftströmung zu laufen, bis der Flüssigkeitspegel in der Säule unmittelbar oberhalb der Harz ist. Sammeln Sie die Flow-Through als Waschfraktion.
- Wiederholen Protokoll 3,5-3,6 vier weitere Male die Schritte, die zusätzlichen Waschfraktionen zu sammeln.
- 15 ml eiskaltem 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl in eine Säule.
- Öffnen des Absperrhahns der Elutionspuffer zu ermöglichen, durch die Kolonne durch Schwerkraftströmung zu laufen, bis der Flüssigkeitspegel in der Säule unmittelbar oberhalb der Harz ist. Sammeln Sie die Flow-Through als Elutionsfraktion.
- Wiederholen Protokoll 3,8-3,9 vier weitere Male die Schritte, die zusätzlichen Elutionsfraktionen zu sammeln.
4. Puffer Exchange und Endotoxin Entfernung von HP-NAP Gereinigt durch Negativ-Modus Batch-Chromatographie mit DEAE Resins
Hinweis: Das gereinigte HP-NAP in E. ausgedrückt coli muss ausgesetzt werden , den Austausch und Endotoxin Entfernung zum Puffern vor Neutrophilen zu stimulieren.
- Führen Dialyse Puffer des gereinigten HP-NAP nach Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) zu ändern, pH 7,2, bei 4 ° C durch einen Dialyseschlauch mit Molekulargewichtsgrenze von 14 kDa verwendet , wie zuvor beschrieben 24.
- Filtern Sie die dialysiert HP-NAP durch eine syringe Filter mit einem positiv geladenen, hydrophilen Membran angebracht auf eine 20 ml Einwegspritze mit Raten von 2,5 bis 4 ml / min bei 4 ° C im Bereich Strömungs Endotoxin zu entfernen.
5. Charakterisierung der molekularen Eigenschaften von gereinigtem rekombinantem HP-NAP durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), Western Blotting, Native-PAGE, Gelfiltrationschromatographie und Circulardichroismus-Spektroskopie
- Analyse des gereinigten rekombinanten HP-NAP durch SDS-PAGE und Western Blotting mit Hybridomkulturüberständen enthält monoklonaler Maus - Antikörper MAb 16F4 25 , wie zuvor beschrieben 24.
- Analysieren Sie den gereinigten HP-NAP durch native-PAGE und Gelfiltrationschromatographie seinen oligomeren Status zu prüfen , wie zuvor 26 beschrieben.
- Analysieren Sie den gereinigten rekombinanten HP-NAP durch Circulardichroismus - Spektroskopie seine Sekundärstruktur zu untersuchen , wie zuvor 26 beschrieben.
6. Bewertung der Reinheit des HP-NAP durch Silberfärbung eines SDS-PAGE-Gel
- Bereiten Sie die Befestigungslösung, Sensibilisierungslösung, Silberlösung, Entwicklungslösung, Stopplösung und Waschlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers einer Silberfärbung Kit.
- Führen Silberfärbung eines SDS-PAGE-Gel nach den Anweisungen des Herstellers einer Silberfärbung Kit.
- Erwerben, um das Bild des Gels mit einem Abbildungssystem.
7. Messung der ROS-Produktion aus Neutrophilen induziert durch HP-NAP
- Isolieren menschlicher Neutrophile aus humanem heparinisiertem Blut durch Dextran - Sedimentation durch Dichtegradientenzentrifugation gefolgt , wie zuvor beschrieben 24.
- Die Messung der ROS-Produktion von neutrophilen Granulozyten stimuliert mit HP-NAP durch eine Luminol-abhängige Chemilumineszenz Assay.
- Schalten Sie auf einem Plattenlesegerät und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Legen Sie einleer flachen Boden 96-Well-Platte, weiß im Inneren der Plattenleser Kammer, so dass sie auf 37 ° C zu erwärmen.
- Bereiten Sie die Stimulus Mischungen in D-PBS, pH 7,2, enthaltend 0,9 mM CaCl 2, 0,5 mM MgCl 2 und 13,3 & mgr; M 5-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion (Luminol) mit der Anwesenheit und Abwesenheit von 0,67 uM Endotoxin entfernt HP-NAP, hergestellt aus Protokoll Schritt 4.2.
- Stellen Sie die Konzentration von humanem Neutrophilen hergestellt aus Protocol Schritt 7,1-2 x 10 6 Zellen / ml in D-PBS, pH 7,2, enthaltend 5 mM Glukose.
- In 50 ul Neutrophilen-Suspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, während.
- Zugabe von 150 & mgr; l der Stimulus Mischungen aus Protokolls hergestellt Schritt 7.2.2 in die Vertiefung mit Neutrophilen in einem Zeitintervall von 5 Sekunden pro Vertiefung.
- Messen der Emission von Chemilumineszenz für 5 sec pro Vertiefung über einen Zeitraum von 3 Stunden durch einen Plattenleser.
8.Aufbau von DNA-Plasmiden HP-NAP Mutants durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) -basierte Standort direkte Mutagenese
Hinweis: PCR-basierte Website-direkte Mutagenese wurde im Grunde erzeugt , wie zuvor 27 beschrieben mit der Ausnahme , dass die "stille" Restriktionsstellen an die Mutagenese - Primer eingeführt wurden durch ortsgerichtete Mutagenese (SDM) -Assist Software 28.
- Führen PCR-Reaktion.
- Werden 10 ng von Plasmid pET42a-NAP, 1 uM Mutagenese - Primer - Paare , die in Tabelle 1, 200 uM Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs) und 3 Einheiten von High-Fidelity PCR Enzymmischung in ein PCR - Röhrchen entionisiertes Wasser enthielt, was eine endgültige Volumen von 25 & mgr; l.
- Initiieren Sie die PCR-Zyklen bei 95 ° C für 10 min , um die Matrizen - DNA zu denaturieren , und 12 Amplifikationszyklen bei 95 ° C für 1 Minute folgt, m T kein -5 ° C für 1 Minute und 72 o C für 6 min.
- Beenden Sie die PCR-Zyklen mitein Temperschritt bei T m pp -5 o C für 1 Minute und ein Verlängerungsschritt bei 72 ° C für 30 min.
- Behandlung von 15 & mgr; l des PCR-Produktes mit 0,4 & mgr; l DpnI-Restriktionsenzym bei 37 ° C für 2 Stunden und dann analysieren 2 ul der Dpn I-behandelten PCR-Produkt durch Agarose-Gelelektrophorese.
- Screen-Mutanten.
- Transformieren 2 & mgr; l des PCR - Produkts in E. coli DH5 kompetenter Zellen durch Hitzeschock für 45 Sekunden bei 42 ° C.
- Verbreiten Sie die transformierten Zellen auf einer LB-Platte, die 50 ug / ml Kanamycin und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 16 Stunden.
- Isolieren der Plasmid-DNA aus den Bakterienkolonien einen handelsüblichen alkalischen Lyse-Kit nach dem Protokoll des Herstellers.
- Behandeln die Plasmid-DNA isoliert in Protocol Schritt 8.3.3 mit XhoI-Restriktionsenzym, das Vorhandensein der gewünschten stille Mutationen zu verifizieren dem Protokoll des Herstellers entsprechend.
- Ablauf derPlasmid-DNA durch das Protokoll Schritt 8.3.4 mit T7-Promotor-Primer bestätigte die Korrektur der kodierenden Sequenzen von HP-NAP-Mutanten dem Protokoll des Herstellers entsprechend bestätigen.
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Representative Results
Die schematische Darstellung des experimentellen Verfahrens negativer Reinigung rekombinanter HP-NAP exprimiert in E. coli durch DEAE - Ionenaustauschharze in Batch - Modus verwendet , ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Reinigungsverfahren auf die Bindung von Wirtszellproteinen basieren und / oder anderen Verunreinigungen als HP-NAP auf das Harz. Bei pH 8,0 fast keine andere Proteine außer HP-NAP in nativer Form aus der ungebundenen Fraktion (2A und B) gewonnen wird . Das gereinigte HP-NAP in der ungebundenen Fraktion wurde durch den Antikörper gegen HP-NAP (2C) immunodetected, und seine Reinheit war höher als 97% , wie durch Silberfärbung (Abbildung 2D) bestätigt. Darüber hinaus hielt das gereinigte rekombinante HP-NAP seine oligomerer Form analysiert , wie durch native-PAGE (2B) und Gelfiltrationschromatographie (3A). Circulardichroismus spectroscopIC - Analyse zeigte , dass das gereinigte Protein im wesentlichen aus α-Helices (3B) zusammengesetzt war. Außerdem wurde das gereinigte HP-NAP fähig stimulierenden menschlichen Neutrophilen ROS (3C) zu erzeugen. Somit ist das rekombinante HP-NAP durch diesen Ansatz gereinigt in seiner nativen Form mit biologischer Aktivität. Darüber hinaus kann diese Negativ - Modus Batchchromatographie rekombinante HP-NAP mit Punktmutationen in einem Schritt zu reinigen verwendet werden. Wie in 4 gezeigt, die zwei rekombinanten HP-NAP Y101H und HP-NAP E97GY101H Mutanten, die Mimik HP-NAP von H. pylori NCTC 11639 und NCTC 11.637 Stämme wurden jeweils mehr als 95% mit einer Reinheit von dieser negativen Modus batch - Chromatographie gereinigt.
Zum Durchführen einer negativen Modus batch-Chromatographie unter Verwendung von DEAE-Harze HP-NAP, der pH-Wert des Puffers für die Reinigung verwendet zu reinigen sollte auf 8,0 eingestellt werden,um sicherzustellen, dass der Großteil der HP-NAP in der ungebundenen Fraktion vorliegt. Geringere Menge an HP-NAP war in den ungebundenen Fraktionen , wenn der pH - Wert des Puffers höher oder niedriger als 8,0 (Abbildung 5). Auch wenn die Reinheit des HP-NAP in den ungebundenen Fraktionen erhöht wurde nur ein wenig wie pH-Wert von 7,0 bis 9,0 erhöht, die Menge des HP-NAP in den ungebundenen Fraktionen war am höchsten, wenn der pH-Wert des Puffers pH-Wert war 8.0 (Abbildung 5). Die Menge der löslichen Proteine aus Zelllysaten auf das Harz geladen, ist ein weiterer wichtiger Faktor für diese Reinigung. Hier ist das Verhältnis 1,5 mg Protein pro ml Harz für die maximale Kapazität des Harzes zu erreichen , die Verunreinigungen von E. aufzusaugen coli (Abbildung 6). Darüber hinaus können die Reinheit und Ausbeute der HP-NAP durch diesen negativen Modus batch-Chromatographie erhaltenen im wesentlichen durch die Erhöhung der Menge von HP-NAP in der löslichen Fraktion von erhöht werdenE. coli - Lysaten. Rekombinante HP-NAP wurde fast vollständig in der löslichen Fraktion nach Zelllyse bei einem pH von 9,0 (7) zurückgewonnen. Obwohl die Löslichkeit von rekombinanten HP-NAP in E. coli - Lysaten deutlich erhöht wurde , wenn die Zellen in dem Puffer mit pH - Wert höher als 7,5 (7) lysiert wurden, weniger als 90% der HP-NAP war als das lösliche Protein , wenn die Zellen in dem Puffer mit pH - Wert niedriger als 9,0 lysiert wurden.
Abb . 1: Schematische Darstellung des Negativen Reinigung von HP-NAP durch DEAE Resins im Batch - Modus Die Reinigung beginnt mit einem Batch-Verfahren verbindlich. Die lösliche Proteinfraktion enthält, HP-NAP aus bakteriellen Lysaten erhalten wird, auf das DEAE-Harz hinzugefügt, voräquilibriert mit Tris-Puffer bei pH 8,0. Die Proteine / Harz-Schlämme werden dann bei 4 ° C für 1 Stunde unter vorsichtigem mixi inkubiertng. Während der Inkubation binden die Wirtszellproteine zum Harz. HP-NAP in der ungebundenen Fraktion von entweder erhalten wird , um den Überstand nach der Zentrifugation oder der Durchflussfraktion von einer durch Schwerkraftfluss führen Spalte zu sammeln. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 2: beispielhaftes Ergebnis der Reinigung von HP-NAP durch Negativ - Modus Batch - Chromatographie mit DEAE Ionenaustauscherharze Das gesamte Zelllysat (W) und löslichen Proteinfraktion (S) von E. HP-NAP und die ungebundene Fraktion (U) , die HP-NAP aus DEAE - Ionenaustausch - Chromatographie wurden durch SDS-PAGE (A), native-PAGE (B) und Western Blot (C) analysiert exprimieren coli BL21 (DE3). Die ungebundene Fraction mit der angegebenen Menge der Proteine von 1 ug bis 10 ug Bereich wurde auf einem silbergefärbten SDS-PAGE - Gel (D) analysiert. Molekularmassen (M) in kDa sind links der gefärbten Gele und dem Blot angegeben. (Übernommen von Referenz 24) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von rekombinanten HP-NAP Von E. Gereinigtes coli durch Negativ - Modus Batch Chromatography. (A) Die UV - Absorptionsprofil wurde aus einer Gelfiltrationssäule eluierte für HP-NAP aufgezeichnet. Die Molmassen der Proteinmarker wurden auf dem Chromatogramm angegeben. (B) Die fernen UV - Circulardichroismus spectRum von HP-NAP wurde im Wellenlängenbereich von 195-260 nm aufgezeichnet. (C) Humane Neutrophile (1 · 10 & sup5 ; Zellen) wurden mit 0,5 & mgr; M HP-NAP und D-PBS behandelt, pH 7,2, als negative Kontrolle bei 37 ° C. Der Gehalt an ROS von Neutrophilen erzeugt wurde kontinuierlich gemessen, indem eine Luminol-abhängige Chemilumineszenz-Assay verwendet wird. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung von einem Experiment, in dreifacher Ausführung dargestellt. (Übernommen von Referenz 24) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Reinigung von rekombinantem HP-NAP Mutants Expressed in E. coli durch Negativ - Modus Batch - Chromatographie. Die löslichen Proteinfraktionen von E. coli BL21 (DE3) exprimieren , zwei rekombinante HP-NAP Y101H und HP-NAP E97GY101H Mutanten und Wildtyp - HP-NAP wurden durch den negativen Modus - Chromatographie mit DEAE - Harze gereinigt. Die ungebundenen Fraktionen wurden analysiert durch SDS-PAGE. Molekulare Massen (M) in kDa sind auf der linken Seite der gefärbten Gele angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Einfluß des pH - Puffer auf Purification of Recombinant HP-NAP Expressed in E. coli durch Negativ - Modus Batch - Chromatographie. Die lösliche Fraktion von E. coli BL21 (DE3) exprimiert HP-NAP bei pH 9,0 lysiert wurden dem angegebenen pH - Wert von 7,0 bis 9,0 und einer Proteinkonzentration von 0,3 mg / ml bis hin eingestellt. Diese eingestelltFraktionen, wie Last angegeben, wurden dann auf DEAE-Harze geladen rekombinante HP-NAP durch negativen Modus batch-Chromatographie bei 4 ° C zu reinigen. Die ungebundenen, waschen und Elutionsfraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Molekularmassen (M) in kDa sind links der gefärbten Gele angegeben. (Übernommen von Referenz 24) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Wirkung der Menge von Proteinen beladen auf DEAE Resins für Purifying Recombinant HP-NAP Expressed in E. coli. Die löslichen Proteinfraktionen von E. coli BL21 (DE3) exprimiert HP-NAP wurden auf DEAE - Harze geladen gemäß das angegebene Verhältnis von mg Proteine pro ml Harze recombi zu reinigenNant HP-NAP durch die negative Chromatographie-Modus Batch bei pH 8,0. Die löslichen Proteine, angegeben als Last (L), der ungebundenen Fraktion (A), Waschfraktion (B) und Elutionsfraktion (C) wurden durch SDS-PAGE analysiert. Molekularmassen (M) in kDa sind links der gefärbten Gele angegeben. (Von Referenz 24) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Wirkung des pH auf die Löslichkeit von HP-NAP in E. coli Lysate. (A) E. coli BL21 (DE3) exprimiert HP-NAP wurde in eiskaltem Tris-HCl - Puffer bei dem angegebenen pH - Wert im Bereich von 7,0 bis 9,5 suspendiert. Zellen wurden lysiert und dann Ganzzelllysaten (W) wurden t zentrifugierto trennen löslichen Fraktionen (S) und unlöslichen Pellets (I). Die Proteine wurden durch SDS-PAGE analysiert. Molekularmassen (M) in kDa sind links der gefärbten Gele angegeben. (B) Der Anteil der Löslichkeit von rekombinantem HP-NAP in der gesamten Zell - Lysats bei jedem pH - Wert wurde für den löslichen Fraktion von der Intensität des HP-NAP Bande auf SDS - Gelen berechnet (S) , dividiert durch die für die gesamte Zelllysat (W ). Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens zwei Experimenten dargestellt. (Von Referenz 24) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: Primer verwendet für Mutagenesis. Bitte click hier eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
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Discussion
Die negativen Modus batch - Chromatographie mit DEAE Anionenaustauscherharze präsentierten zur Reinigung von rekombinantem HP-NAP überexprimiert in E coli geeignet. Die pH - Werte der Puffer in den Schritten der Zell - Lyse und Reinigung verwendet werden , sind sehr kritisch , um die Löslichkeit von HP-NAP in E. , um sicherzustellen , coli - Lysaten und effiziente Trennung von rekombinantem HP-NAP von Wirtszellverunreinigungen, respectively. Bakterielle Zellen sollten bei einem pH von 9,0, und die negative Reinigung lysiert werden sollte bei pH 8,0 durchgeführt werden HP-NAP in hoher Ausbeute und hoher Reinheit zu erhalten. Typische Wiederherstellung von HP-NAP 90% beträgt, und typische Reinheit beträgt 95% 24. Da HP-NAP in der ungebundenen Fraktion, eine minimale, aber ausreichende Menge des Harzes sollte seine maximale Kapazität verwendet werden, um zu erreichen, um die Verunreinigungen zu absorbieren. In unserem Fall ist die maximale Ladekapazität 1,5 mg der löslichen Proteine aus E. coli Lysaten pro Milliliter Harz.
Die provided - Protokoll wird zur Reinigung von rekombinantem HP-NAP aus einer 50 ml E. entworfen coli - Kultur. Die Ausbeute an HP-NAP ist etwa 15 mg. Der Reinigungsprozess kann entweder entsprechend abgespeckte oder skaliert-up. Zum Beispiel wurden die beiden rekombinanten HP-NAP Y101H und HP-NAP E97GY101H Mutanten aus einer 1 ml E. gereinigt coli - Kultur durch diesen negativen Modus Batch - Chromatographie. Beide HP-NAP - Mutanten mit einer Reinheit von mehr als 95% wurden durch Sammeln der ungebundenen Fraktion (Abbildung 4) erhalten. Dieser negative Modus Batchchromatographie haben auch rekombinante HP-NAP aus einem 860 ml E. zu reinigen angewendet worden coli - Kultur. Die Erholung der Schritt DEAE negativen Modus Batch - Chromatographie hat 97% mit einer Reinheit von mehr als 90% erreicht.
HP-NAP ausgedrückt in Bacillus subtilis (B. subtilis) wurde ebenfalls von dieser DEAE negativen Modus Batchchromatographie erfolgreich gereinigt wordenin einem Schritt 26. In unserem B. subtilis - Expressionssystem, das Expressionsniveau von HP-NAP ist gering. HP-NAP nur rund 5% der gesamten löslichen Proteine von den bakteriellen Lysaten. Obwohl HP-NAP zur Reinigung ausgerichtet ist, die in einer kleinen Menge, HP-NAP mit einer Reinheit von höher als 90% wird auf das Harz effizient geladen durch Verringerung des Verhältnisses der Menge von Proteinen aus Zellysaten erhalten werden, um fast die gesamte endogene entfernen Proteine aus B. subtilis 26. Somit kann dieses Verfahren auch rekombinante HP-NAP ausgedrückt in anderen bakteriellen Wirten zu reinigen, angewendet werden.
Es wurden verschiedene Verfahren zur Reinigung von rekombinantem HP-NAP in seiner nativen Form 14-16 berichtet. Jedoch wird eine zusätzliche Gelfiltration Chromatographieschritt erforderlich HP-NAP in hoher Reinheit zu erhalten. Diese negative chromatographischen Reinigung kann funktionelle rekombinante HP-NAP mit hoher Reinheit in einem Schritt effizient ergeben. in additi, wird der Entsalzungsschritt nicht aufgrund der niedrigen Salzkonzentration in der ungebundenen Fraktion erforderlich. Die Batch-Modus Reinigung kann auch die Notwendigkeit für eine Säule vermeiden. Somit bietet diese negative Modus Batch-Chromatographie mit DEAE Harz ein einfaches und effizientes Verfahren HP-HAP in seiner nativen Form mit hoher Ausbeute und Reinheit zu reinigen. HP-NAP nach diesem Verfahren gereinigt könnte weiter für die Entwicklung von Impfstoffen, neue Medikamente verwendet werden, und die Diagnose für H. pylori verwandtes Krankheiten oder für andere neue therapeutische Anwendungen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
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