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Bioengineering

Rapid-Scan-Elektronenspinresonanz eröffnet neue Wege für Imaging Physiologisch Wichtige Parameter Published: September 26, 2016 doi: 10.3791/54068
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 1, 5, 6, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Denver, 2Magnetic Imaging Group, Applied Physics Division, Physical Measurements Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 3Department of Radiology, Geisel School of Medicine, Dartmouth University, 4Department of Biochemistry, West Virginia University, 5Department of Electrical and Computer Engineering, University of Denver, 6Department of Engineering, University of Denver

Summary

Eine neue Elektronenspinresonanz (EPR) Verfahren, schnelle Scan - EPR (RS-EPR) wird für 2D - spektrale räumliche Abbildung gezeigt , die auf die traditionelle kontinuierliche Welle (CW) Technik überlegen ist , und eröffnet neue Orte für in - vivo - Bildgebung. Die Ergebnisse werden bei 250 MHz gezeigt, aber die Technik ist bei jeder Frequenz anwendbar.

Abstract

Wir zeigen ein überlegenes Verfahren zur 2D - spektral-räumlichen Abbildung von stabilen Rest Reportermoleküle bei 250 MHz unter Verwendung von Rapid-Scan - Elektronen-paramagnetischen-Resonanz (RS-EPR), die quantitative Informationen unter in vivo - Bedingungen auf die Sauerstoffkonzentration liefern kann, pH, Redox Status und die Konzentration der signal~~POS=TRUNC (dh OH •, NO •). Die RS-EPR-Technik eine höhere Empfindlichkeit, eine verbesserte räumliche Auflösung (1 mm) und kürzere Erfassungszeit im Vergleich zu der Standard-Dauerstrich (CW) -Technik. Eine Vielzahl von Phantom Konfigurationen wurden mit räumlicher Auflösung getestet, die 1 bis 6 mm variiert, und die spektrale Breite der Reportermoleküle im Bereich von 16 uT (160 mG) bis 5 mT (50 G). Ein Quer Schleife bimodale Resonator abkoppelt Anregung und Detektion, das Rauschen zu reduzieren, während der schnelle Scan-Effekt mehr Leistung ermöglicht vor der Sättigung Eingabe in das Spin-System sein, das EPR-Signal zu erhöhen. Diesführt zu einer wesentlich Signal-zu-Rausch-Verhältnis höher ist als in herkömmlichen Versuchen CW EPR.

Introduction

Im Vergleich zu anderen medizinischen Bildgebungsverfahren, Elektronenspintomographie (EPRI) ist einzigartig in der Lage , um quantitativ Bild physiologischen Eigenschaften , einschließlich pH 1-3, pO 2 4-7 Temperatur 8, Perfusion und Lebensfähigkeit von Gewebe 9, Mikroviskosität und einfache Verbreitung von kleine Moleküle 10 und oxidativen Stress 11. Die Einschätzung der Leichtigkeit der Disulfid - Spaltung durch Glutathion (GSH) in Gewebe und Zellen 12,13 auf Redox - Status melden. Für in - vivo - Bildgebung, EPR im Frequenzbereich zwischen 250 MHz und 1 GHz gewählt wird , da diese Frequenzen eine ausreichende Tiefe der Gewebepenetration bereitzustellen (bis zu einigen cm) Bilder für kleine Tiere zu erzeugen , in der Intensitäten sind nicht durch dielektrische Verlusteffekte vermindert. Höhere Frequenzen, wie beispielsweise 9,5 GHz 14 (X-Band) und 17 GHz (K u -Band) 15,16 können zur Bildgebung von Haut und Haar oder einzelne Zellen verwendet werden ,, beziehungsweise. Der Erfolg von EPRI bei allen Frequenzen hängt von paramagnetischen Spin-Sonden, die für Gewebe spezifisch sind, so dass ihre Position und Schicksal abgebildet werden kann.

Wenn die Umgebung eines Elektronenspinsonde räumlich heterogen ist, ist das ESR-Spektrum der Summe der Beiträge von allen Standorten. Spectral-räumliche Abbildung teilt das Volumen der Probe in ein Array von kleinen räumlichen Segmente und berechnet das EPR - Spektrum für jedes dieser Segmente 17. Dies ermöglicht die Zuordnung der lokalen Umgebung durch die räumliche Variation in der EPR-Spektrum zu messen. Magnetfeldgradienten verwendet räumliche Informationen in EPR-Spektren zu kodieren, die Projektionen genannt werden. Die spektrale-räumliches Bild wird aus diesen Projektionen 18,19 rekonstruiert.

In RS-EPR wird das Magnetfeld durch Resonanz in einer Zeit abgetastet , die kurz relativ zur Elektronenspin Relaxationszeiten (Abbildung 2) 20,21 ist. D econvolution des Schnellscansignal gibt das Absorptionsspektrum, das mit dem ersten Integral des herkömmlichen ersten Ableitung CW-Spektrum entspricht. Die S-Scan-Signal in Quadratur erfaßt wird, so daß beide Absorptions- und Dispersionskomponenten des Spinsystems Antwort gemessen werden. Dies ist das Sammeln im wesentlichen die doppelte Datenmenge pro Zeiteinheit. Die Sättigung des Signals in einem schnellen Scan Experiment geschieht bei höheren Leistungen als für CW, so höhere Leistungen können für die Sättigung ohne Bedenken verwendet werden. 20,22 Viele weitere Mittelwerte pro Zeiteinheit im Vergleich zu CW getan werden kann. Höhere Leistung, direkte Quadraturerfassung und mehr Mittelwerte pro Zeiteinheit kombinieren schnelle Scan ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) zu geben, insbesondere bei hohen Gradienten Projektionen, die räumliche Trennung zu definieren, um eine höhere Bildqualität führt. Zu erreichen , etwa die gleiche SNR für ein Bild eines Phantoms etwa 10 mal erforderlich , so lange für CW wie für die schnelle Abtastung 23.

Zelt "> Die erhöhte SNR ermöglicht auch Experimente bei 250 MHz mit geringer Konzentration Spin - Trap - Addukte , die durch die Reaktion von OH mit 5-tert-Butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline- N -Oxid (BMPO-OH) , die gebildet würde unsichtbar für die CW - Methode 24. Dinitroxides mit einem Disulfid - Linkers verbunden sind empfindlich gegenüber Spaltung durch Glutathion, und kann auf die zelluläre Redox - Status so melden. Equilibrium, abhängig von der Konzentration von Glutathion vorhanden, zwischen den di- und mono-Radikal Formen existiert. diese Änderungen beobachten erfordert Erfassung des gesamten 5 mT breites Spektrum und kann viel schneller mit einer schnellen Scan EPR im Vergleich zu Schritt das Magnetfeld in einem CW-Experiment erreicht werden.

Eine vollständige schnelle Scan-System besteht aus vier Teilen: dem Spektrometer, das Hauptfeldmagneten, der schnelle Scan-Spulentreiber und die schnelle Scan Quer Schleifen-Resonator. Das Spektrometer und die Hauptfeldmagneten haben die gleiche Funktion wie in einem CW-Experiment, das Haupt Zeeman-Feld Einstellungund Sammeln der Daten von dem Resonator. Die schnelle Scan-Spulentreiber erzeugt die Sinus Scan Strom, der auf den schnellen Scan Quer Schleifenresonators in speziell entwickelten schnellen Scan-Spulen geht. Die schnellen Abtastspulen auf der schnellen Scanquer loop Resonators erzeugen einen großen homogenen Magnetfeld, das bei Frequenzen zwischen 3 und 15 kHz gewobbelt wird.

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Protocol

1. Aufbau des Rapid-Scan-Coil-Treiber bei 250 MHz

  1. Berechnung von Rapid Scan Experimentelle Bedingungen
    Hinweis: Der wichtigste Parameter in RS-EPR ist Abtastrate, α, die das Produkt der Scanfrequenz und Scanbreite (Gleichung 3). Für schmale Scanbreiten, schnellere Abtastraten verwendet werden, und für eine breitere Sweep Breiten, langsamer Abtastraten verwendet werden. Die folgenden Anweisungen Schritt für Schritt durch den letzteren Fall und zeigen, wie bei den experimentellen Spulentreiber Parameter von 7 mT Wobbelbreite und 6,8 ​​kHz Abtastfrequenz zu gelangen.
    1. Bestimmen Sie die Resonatorbandbreite (BW Res).
      Gleichung 1 (1)
      wobei v res ist die Betriebsfrequenz des Resonators und Q ist der Qualitätsfaktor. Q = 90, ist für die schnelle Scan-Resonator verwendet, um die Daten in Repräsentative Ergebnisse erhalten gemeinsam.
    2. Bestimmen Sie die schnelle Scangeschwindigkeit, α, alledurch den Resonator Bandbreite geschuldete Gleichung 2 (2)
      Gleichung 3

      wobei N eine Konstante häufig konservativ ausgewählt ist 5-6 ist, ist & Delta; B pp die peak-to-peak - Derivat Linienbreite in mT und a ist die Abtastrate , wenn T / s für eine Lorentz - Linienbreite.
      Hinweis: Ein gemeinsamer Wert für die Reste in dem repräsentativen Abschnitt ist Gleichung 4 = 0,1 mT. Im Vergleich zu früheren schnellen Scan-Literatur; Gleichung 2 wird durch Einstellen der Signalbandbreite (BW sig) gleich BW Res abgeleitet.
    3. Bestimmen Sie die maximale schnelle Scanfrequenz durch die Geschwindigkeit erlaubt.
      Gleichung 5 (3)
      Gleichung 6
      wobei w die Breite des scan und f die Abtastfrequenz. Ein Sweep Breite von 7 mT für Stromsonden , die in vivo zu 100% des Spektrums abdecken. Verwenden Sie diesen Wert und die Geschwindigkeit berechnet (Gleichung 2), um die Abtastfrequenz zu bestimmen.
      Gleichung 7
  2. Die Auswahl der Tuning - Kondensatoren und Einstellung der schnellen Scan Spulentreiber
    Hinweis: Der schnelle Scan-Spulentreiber wird typischerweise in einem resonanten Modus eine Sinuswelle erzeugt. Resonanz tritt bei einer Abtastfrequenz in dem die induktiven und kapazitiven Reaktanzen sind von gleicher Größe und entgegengesetzten Vorzeichen, so dass die Gesamt Reaktanz nahe Null ist.
    1. Ermitteln Sie die richtige Kapazität für die bestimmte Frequenz in 1.1.3 unter Verwendung der Induktivität L, der schnellen Scan - Spulen und (Gleichung 4).
      Gleichung 8
      Gleichung 9
    2. Dividieren C TOT aus Gleichung (4) in der Hälfte der Kondensatorwerte für jede Seite des Spulentreiber Kondensatorkasten zu erhalten.
      Gleichung 10
      Gleichung 11
      Hinweis: Der schnelle Scan-Spulentreiber zwei Verstärker hat. Wenn ein Kondensator der Auswahl muss die Kondensatorkasten mit einer gleichen Kapazität auf jeder Seite der Box ausgeglichen werden. Die beiden Seiten sind in Reihe geschaltet.
    3. Lösen Sie die obere Abdeckung der Kondensatorkasten und legen Kondensatoren auf beiden Seiten, die in Schritt 1.2.2 bestimmt gleich dem Wert sind.
    4. Ersetzen Sie den oberen Teil des Kondensatorkasten und schrauben Sie ihn fest, um sicherzustellen, bleibt.
    5. Über die Frontplatte des resonanten Schwingspulentreiber, stellen Sie die Ausgangsfrequenz, bis die Sinuswellenform die maximale Amplitude aufweist.

2. Vorbereitung der Reagenzien und Phantome

  1. Herstellung von radiCALs
    1. Entfernen 15 N-PDT aus dem Gefrierschrank und ermöglichen es der Behälter auf Raumtemperatur (10-15 min) zu kommen.
    2. Man wiegt 1,4 mg 15 N-PDT eine analytische Waage.
    3. Hinzufügen 1,4 mg 15 N-PDT zu 15 ml entionisiertem (DI) H 2 O zu einer Endkonzentration von 0,5 mM.
      Hinweis: 4-Oxo-2,2,6,6-tetra (2 H 3) methyl-1- (3,3,5,5- 2 H 4, 1 15 N) piperdinyloxyl (15 N-PDT), 4- 1 H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra (2 H 3) methyl-3-pyrrolinyloxyl (15 N-mHCTPO) und 3-carboxy-2,2,5,5-tetra (2 H 3) methyl-1- (3,4,4- 2 H 3, 1- 15 N) pyrrolidinyloxy (15 N-PROXYL) 25 (1E-G) Reste lang~~POS=TRUNC (2 Jahre) in wässriger Lösung und bei Raumtemperatur. Ihre feste Formen sind in der Regel in einem Gefrierschrank oder Kühlschrank aufbewahrt diese Radikale Jahre stabil zu halten.Die Stabilität der Nitroxid-Radikale im allgemeinen machen sie nicht toxisch, und ihre Herstellung kann auf einem normalen Tisch Modell ausgeführt werden, wenn das Lösungsmittel Wasser ist. Wenn organische Lösungsmittel verwendet, Nitroxid Lösungen innerhalb einer Abzugshaube vorzubereiten, während die richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA) ausgestattet.
  2. Herstellung von pH - sensitiven Trityl Radikale
    1. Man wiegt 0,7 mg triaryl Methylrest (ATAM 4) 26 Rest (1400 g / mol) und in 200 ul absolutem Ethanol auflösen.
    2. Wiegen 0,00681 g KH 2 PO 4 (136,1 g / mol) und lösen sich in 50 ml deionisiertem Wasser für eine Endkonzentration von 1 mM.
    3. Wiegen 2,8 g KOH (56 g / mol) und in 50 ml DI-Wasser für eine Endkonzentration von 1 M. auflösen
    4. In KOH fallen weise zu der Phosphatpuffer (2.2.2), um den pH-Wert von 7,0 einzustellen.
    5. In 800 ul 1 mM Phosphatpuffer und die 200 ul ATAM 4 in absolutem Ethanol für eine Endkonzentrationentration von 0,5 mM in 80:20 Puffer: Ethanol.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1-2.2.5 die ATAM 4 Probe bei pH zu schaffen = 7,2.
    7. Legen Sie die ATAM 4, pH - Wert = 7,0 und ATAM 4, pH - Wert = 7,2 in getrennte 6 mm Quarzprobenröhrchen.
    8. Zeigen beide 6 mm Quarz EPR Rohre in einem 16 mm Quarzrohr EPR, mit einem 2 mm dicken Styroporabstandshalter dazwischen.
      Anmerkung: Die Wände der Quarzprobenröhre 0,5 mm dick sind, und zusätzlich zu dem 2 mm Abstandshalter ergeben eine 3 mm Abstand zwischen den ATAM Proben. Die pH - empfindliche Trityl Radikale wurden verwendet , um an der Ohio State University 26 synthetisiert. Das Beispiel , das für die Bildgebung verwendet wird ATAM 4 bezeichnet. Die Reaktion , die für die pH - Empfindlichkeit berücksichtigt ist in 1A gezeigt.
  3. Die Erzeugung von BMPO-OH
    1. Abwiegen 680 mg KH 2 PO 4 und lösen sich in 100 ml DI Wasser für eine Endkonzentration von 50 mM.
    2. 1 M KOH tropfenweiserzu dem Phosphatpuffer auf pH = 7,3.
    3. Man wiegt 50 mg BMPO (199,25 g / mol).
    4. Kombinieren, um die 50 mg BMPO mit 5 ml Phosphatpuffer in einer 16 mm Quarzbestrahlungsrohr.
    5. 100 l 300 mM Wasserstoffperoxid.
    6. Bestrahlen der Mischung in dem Rohr 16 mm Quarz-Bestrahlung mit einer Lampe W Mitteldruck-UV 450 für 5 min.
    7. Verwendung eines Glastransferpipette übertragen 2,5 ml bestrahlte BMPO-OH-Lösung aus dem Quarzbestrahlungsrohr und in eine Seite eines 16 mm Quarzprobenröhre mit 3 mm Teiler.
    8. Übertragung der verbleibenden 2,5 ml der bestrahlten BMPO-OH in die andere Seite des 16 mm Quarzprobenröhre mit 3 mm Teiler.
  4. Herstellung von Dinitroxidcarbene Radikal
    1. Man wiegt 24,7 mg 2 H, 15 N-Disulfid Dinitroxidcarbene (1C) in 1 ml DMSO für eine Stammlösung von 47,5 mM.
    2. Herstellung von 10 mM Tris-Puffer und Einstellen auf pH 7,2.
    3. Nehmen Sie 40ul Dinitroxidcarbene Stammlösung und verdünnt mit Tris-Puffer zu einer Endkonzentration von 1 mM.
    4. Legen Sie 250 ul Dinitroxidcarbene Lösung in Puffer in einem 16 mm Quarzprobenröhrchen mit einem 10 mm-Teiler in der Mitte.
    5. Abwiegen 154 mg Glutathion und fügt 5 ml Tris-Puffer für eine Endkonzentration von 100 mM.
    6. Zugabe von 5 & mgr; l der 100 mM Glutathion-Lösung zu 250 & mgr; l von 1 mM Dinitroxidcarbene Lösung auf einer Seite des Teilers 10 mm das Diradikal in monoradikalische zu konvertieren.
  5. Herstellung von Nitronylnitroxid
    1. Entfernen Sie den Rest aus der Tiefkühltruhe und damit der Behälter auf Raumtemperatur (10-15 min) zu kommen.
    2. Man wiegt 1,9 mg Nitronyl (390 g / mol).
    3. in 10 ml DI-Wasser für eine Endkonzentration von 1 mM abwiegen 0,56 mg KOH und aufzulösen.
    4. Mischen Sie die 1,9 mg Nitronyl in 10 ml 1 mM KOH-Lösung für eine Endkonzentration von 0,5 mM Nitronyl.
      Hinweis: Wenn necessVortexer oder Beschallungsgerät zu Geschwindigkeit Solvatation des Nitronyl ary, verwenden.

3. Aufbau des Rapid-Scan-Instrument bei 250 MHz

Hinweis: Die Abstimmung des Resonators mit einer wässrigen Probe von Nitroxidradikalgruppe, die am Resonator Q und Tuning als Pufferlösung eine ähnliche Wirkung hat, ist eine gute Möglichkeit für die Probe zur Einrichtung abgebildet werden

  1. Stellen Sie den Resonator mit einer wässrigen Probe von Nitroxidradikalgruppe.
    1. Legen Sie die 15 ml 0,5 mM 15 N-PDT in Wasserprobe in einem 16 mm Quarz EPR Rohr.
    2. Legen Sie die Quarzröhre in die Detektionsseite des Querschleife RS-EPR-Resonator.
    3. Verändern der Frequenz des Instruments Quelle, bis sie die Frequenz der Detektionsseite entspricht, die die Probe enthält. Ändern Sie manuell die Trägerfrequenz des 250-MHz-Quelle durch den gewünschten Wert in der Software eingeben.
    4. Verändern der Frequenz der Anregungsseite, um die frequen entsprechenrungen des Experiments Quelle und Detektionsseite des Resonators. Verändern der Frequenz der Anregungsseite durch einen variablen Kondensator in dem Resonatorhohlraum Drehbewegung nach dem Protokoll des Herstellers.
  2. Richten Sie Instrumentenkonsole und Haupt Magnet
    1. Schalten Sie das Spektrometer und wählen Sie ein Experiment, das transiente Daten mit der Zeit auf der Abszisse aufzeichnet.
    2. Innerhalb der Software, stellen Sie die Anzahl der Punkte auf 65.536 und die Zeitbasis auf 10 ns.
    3. Stellen Sie die Anzahl der Mittelwerte bis 10.000 für einen starken oder engen Signal und 45.000 für ein breites oder schwaches Signal.
    4. Drücken Sie die "engage" -Button in der Software, um die experimentellen Parameter von der Software an die Konsole zu senden und Energie des Hauptfeldmagneten.
    5. Stellen Sie das Hauptmagnetfeld bis 9 mT.
    6. Stellen Sie die Leistungsdämpfung Regler auf 50 dB, und schalten Sie den 7-W-Hochleistungsverstärker.

4. Ausführungvon Rapid Scan Experiment

Hinweis: Besondere Anweisungen im Zusammenhang mit der Analyse von Phantomen enthält BMPO-OH 24, pH - empfindliche TAM Radikale 19,27 und redoxsensitiven dinitroxides 28 sind in der Literatur zur Verfügung gestellt.

  1. Leistungssättigung von Standard Nitroxid Probe
    Anmerkung: Es ist vorteilhaft, eine Stromsättigungskurve auf einem Standard Nitroxidradikal Probe unter den gleichen Versuchsbedingungen zu tun, die verwendet werden, um Radikale empfindlich auf pH-Wert oder Redox-Status zu suchen.
    1. Schalten Sie den schnellen Scan-Spulentreiber, mit den Werten aus Abschnitt 1 (Scanfrequenz von 6,8 kHz und Scanbreite von 7 mT).
    2. Ab 50 dB, sammeln, um eine schnelle Scan-Spektrum mit 100k-Durchschnitt. Verringern Sie die Dämpfung um 3 dB und die Messung wiederholen. Fortsetzen, bis ein Dämpfungsglied Einstellung von 0 dB oder so lange, wie die Isolationsmessung an der Brücke Auslese <0 ist.
    3. Transfer ter roh schnelle Scan-Daten in ein Entfaltungs-Programm (zB in Matlab geschrieben) und verarbeiten die Rohdaten in das Absorptionsspektrum.
    4. Geben Sie die Scanfrequenz, Wobbelbreite, die Anzahl der Punkte, und die Zeit in das Programm, und starten Sie das Programm das rohe schnelle Scan-Signal in ein Absorptionssignal zu verarbeiten.
    5. Zeichnen Sie die Amplitude des Absorptionssignals in Abhängigkeit von der Quadratwurzel Leistung (in Watt) fällt auf den Resonator. In dem nicht-sättigenden Regime ist die Amplitude auf der Quadratwurzel der einfallenden Leistung linear abhängig.
    6. Setzen Sie eine Trendlinie bei 0,0 beginnt und umfassen alle Datenpunkte, die in den linearen Antwortbereich fallen. Im linearen Antwortbereich, Signalamplitude erhöht proportional zu der Quadratwurzel der Mikrowellenleistung.
    7. Extrapolieren diesen Trend zu höheren Leistungen und vergleichen Sie die EPR-Signalintensität. Verwenden Sie die höchste Leistung, für die die Signalamplitude nicht mehr als 3% von der hochgerechneten Trendlinie abweichen. in order für die Entfaltungs des schnellen Scan-Signal richtig funktioniert, muss das Signal sein, noch im linearen Antwortbereich in Bezug auf einfallende Leistung.
      Hinweis: Die Übertragung der rohen schnellen Scan-Daten können über eine Netzwerkverbindung oder über USB-Stick erfolgen. In diesem Fall ist die Übertragung erforderlich, da das Programm Rohdaten (Matlab) zu verarbeiten ist, nicht auf dem gleichen Computer, der Datenerfassungs-Software hat. Der Dekonvolutionsalgorithmus die Rohdaten verarbeitet wird in 29 beschrieben.

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Representative Results

Das Produkt des Experiments ist ein Satz von Projektionen, die in zweidimensionale rekonstruiert werden (eine Spektrallinie, eine räumliche) Bilder mit einer falschen Farbskala Signalamplitude zu repräsentieren. Deep blue bezeichnet Baseline, wo kein Signal vorhanden ist, grün ist geringer Amplitude und Rot ist am höchsten. Scheiben entlang der x-Achse (spektrale Dimension) zeigen das Signal EPR (EPR-Übergang) auf einer Magnetfeldachse. Entlang der y-Achse (räumliche Abmessung), die Trennung zwischen den Signalen entspricht der physikalischen räumlichen Trennung zwischen den Proben in den Resonatoren.

Abbildung 3 zeigt einen Vergleich von zwei Bildern, erworben mit CW (3B) oder RS (3A) eines Phantoms mit drei verschiedenen Typen von 15 N substituiert Nitroxid - Radikale (Figur 3D). Die breiteste Signal entspricht 15 N-PROXYL, einer fünfköpfigen pyrrolidine Ring mit einer negativen Ladung bei physiologischem pH-Wert, die das Molekül an spezifischen zellulären Kompartimenten Ziel helfen könnte. Das Wams Signal gehört zu 15 N-mHCTPO und ist das Ergebnis eines einzelnen Wasserstoff inmitten ansonsten vollständigen Deuterierung. Diese einzelne Spaltung wurde optimiert , 30 Änderungen in der Sauerstoffkonzentration zu überwachen. Das schmalste Signal kommt von 15 N-PDT, ein flexibles Piperidinring , die vollständig deuteriert ist. Es kann verwendet werden, um die Sauerstoffkonzentration oder redox-Umgebung (Reduktion der Struktur führt zu einer Abnahme des EPR-Signals) zu überwachen.

Für den gleichen 5-min Akquisitionszeit zeigt das RS Bild superior räumliche Auflösung und die Klarheit des spektralen Muster für jeden Rest ist. Ein Grund für die Verbesserung der RS über CW kann durch Vergleichen Spektren bei zwei unterschiedlichen Gradientenstärken zwischen den beiden Techniken (3C) zu sehen. Da die Gradientenstärke erhöhtdie spektrale Signal wird erweitert. Deutliche Verschlechterung des CW-Spektrum unter den hohen Gradienten (1 mT / cm), die räumliche Information kodieren.

Da ein Ableitungssignal schneller als ein Absorptionssignal erweitert, ist das SNR für die höchste Steigung CW Projektion (rote Kurve) sehr schlecht im Vergleich zu dem des höchsten Gradienten RS Vorsprung (blaue Kurve). Linienbreite als Funktion der räumlichen Lage kann aus einem 2D-Plot extrahiert werden. Linienbreite wird basierend auf Änderungen in der Sauerstoffkonzentration oder Viskosität um das Nitroxid Sonde breit oder eng sein. Das Phantom in 3A abgebildet wurde bei Raumtemperatur und an der Luft. Da Sauerstoffgehalt und Viskosität (wie durch die Temperatur bestimmt wird ) konstant blieb, sollte die Linienbreite jeder Sonde über die Breite jedes Rohrs einen Rest mit konstant. 4 zeigt die Streuung in Linienbreiten von Scheiben durch das 2D - Bild passen Vergleichauf den wahren Wert der Linienbreite (schwarze horizontale Linie). Die Bildschicht Werte, vor allem für 15 N-PDT, sind eine bessere Anpassung an den wahren Wert der Linienbreite für RS (4A) als für CW (4B). Dies ist auch eine Folge des verbesserten SNR von RS über die CW-Technik.

Ein weiterer Vorteil der RS-Technik ist die Fähigkeit, breite Magnet homogenes Feld Sweeps in sehr kurzer Zeit zu erzeugen. Eine typische Scanfrequenz für Experimente bei 250 MHz beträgt 9 kHz bis 0,11 ms entspricht. Dies ist 0,11 ms, ob das Feld fegen 0,5 mT bzw. 5,0 mT ist. Vergleichen Sie dies mit CW, wo ein 5,0 mT Sweep zehn Sekunden bis Minuten in Anspruch nehmen. Mit schneller Abtastung wird es möglich , schnell in mal 100% der spektralen Informationen zu sammeln, die in vivo - Bildgebung zugänglich sind.

Abbildung 5 zeigt breites Spektrum RS-EPR imaging angewendet Trapping Modelle zu spinnen. Wichtige Signalmoleküle, wie OH • und NO • sind endogene freie Radikale mit sehr kurzer Lebensdauer. Um diese Moleküle zu untersuchen "Spinfallen" verwendet. Ein Beispiel für die Reaktion von Spin - Trap - 31 (BMPO) mit OH • ist in 1B gezeigt. Bildgebung eines Phantoms 5 uM BMPO-OH - Addukt enthält , wird in 5 (A, B) gezeigt ist . Das Spin-trap - Addukts Signal ist abhängig von der Anfangskonzentration von OH • und hat eine Halbwertszeit von 30 Minuten Untersuchung aller Prozesse ermöglicht , die OH • erzeugen. Die Nitronyl nitoxide 32 wurde als ein weiteres Beispiel des breiten Spektrums Bildgebung verwendet, hat aber in der Vergangenheit für spin-Einfangen von NO • 33,34 verwendet. Bildgebung eines Phantom enthält Nitronyl ist in Figur 5 (C, D) dargestellt. Für spbessere Bezeichnung der ursprünglichen transienten Radikalspezies in Fallen, ermöglicht es das gesamte Spektrum erfassen, die vorhanden war.

Empfindlichkeit gegenüber physiologischen Veränderungen wie pH- und Redox - Status wird von Veränderungen in dem gesamten Spektrum abgeleitet. 6 zeigt Bildgebung mit ATAM 4. In 6B dem Profil von ATAM 4 bei pH = 7,0 (blau) hat viele spektrale Merkmale, und ein Stück aus dem Bild passt gut mit dem entsprechenden Null - Gradienten - Spektrum (grün). Vergleichen Sie dies mit dem Profil von ATAM 4 bei einem pH - Wert von 7,4, 6C, mit weniger spektralen Eigenschaften und noch in guter Übereinstimmung mit dem entsprechenden Null Gradienten Spektrum. Imaging von Phantomen des Dinitroxidcarbene in seiner dimeren enthält, und reduzierte monomere Form sind in 7 gezeigt. Die beiden unterschiedlichen Spektren , die durch Spaltung einer Disulfid erzeugt werden (SS), und so vermitteln Empfindlichkeit env auf Redoxironment 1.35.

Abbildung 1
Abbildung 1. EPR - Sonden sind empfindlich gegenüber vielen physiologischen Veränderungen. (A) Ein Beispiel für die pH-sensitive Tri-aryl-methyl (TAM) Reste 26. (B) Spin - Trap - BMPO. (C) 15 N-Dinitroxidcarbene. (D) Die Nitronyl. (E) 15 N-PROXYL. (F) 15 N-mHCTPO. (G) 15 N-PDT. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Schnelle scannen EPR hat von Natur aus besser SNR. (A) In CW EPR die Amplitude h ist ein kleiner Bruchteil des Gesamtsignals durch die Magnetfeldmodulation bestimmt. (B) Im direkten erkannt schnellen Scan, der volle Signalamplitude ermittelt wird. Das Signal - Rausch - Anstieg ist evident in dem Experiment , wo Superoxid durch E. erzeugten faecalis mit BMPO im X-Band gefangen. Für den gleichen 30 Sekunden Aufnahmezeit, kaum ist ein Signal beobachtbar im CW - Spektrum (C) , während ein starkes Signal in der schnellen Scan - Spektrum beobachtet wird (D) 36. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Verbesserte SNR ermöglicht eine bessere räumliche Auflösung. Für den gleichen 5-minütigen Erfassungszeit, die RS - Bild ( (B erworben). (C) Es ist eine gute Übereinstimmung zwischen den Vorsprüngen mit schnellen Scan erworben (blau) und CW (rot) , wenn kein Gefälle vorhanden ist (0 mT / cm) (D). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Der Informationsgehalt einer schnellen Scan - Bild ist höher als bei CW. (A) Scheiben des 2D - RS Bild. (B) Scheiben des 2D - CW - Bild. Die wahre Linienbreite (schwarze horizontale Linie) einer jeden Probe wird zum Vergleich gezeigt. Siehe 23 verweisen. Bitte klicken Sie hier , um die sehen eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5
Abbildung 5. Schnelle Feld fegt erlaubt das Erfassen eines ganzen Spektrums in wenigen Sekunden. (A) 2D - spektral-räumliche Abbildung eines Phantoms , bestehend aus BMPO-OH - Addukt. (B) Eine Simulation Anpassung an die Null Gradienten BMPO-OH - Spektrum bei 250 MHz verwendet wurde , die anfängliche BMPO-OH Bild zu passen und zu unterscheiden zwischen den Regionen BMPO-OH und Rauschen enthaltende Bereiche enthält. (C) 14 N Nitronyl - Rest, der für das Einfangen von Stickstoffmonoxid in vivo verwendet werden können. (D) Scheiben durch jedes Spektrum zeigen die spektrale Form bei 250 MHz. Siehe 19 verweisen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 6
Abbildung 6. Kein Teil des Spektrums wird weggelassen, eine bessere Überwachung der physiologisch induzierten spektralen Veränderungen ermöglicht. (A) 2D - spektral-räumliche Abbildung eines Phantoms , bestehend aus zwei Rohren von pH - sensitiven ATAM 4 - Rest. (B) Spectral Profil von ATAM 4 bei pH = 7,0 (blau) und die entsprechende Null - Gradienten - Spektrum (grün). (C) Spektrale Profil von ATAM 4 bei einem pH - Wert von 7,4 B (blau) und die entsprechende Null-Gradient - Spektrum (grün). Siehe Referenzen 19,26,37. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur sehen.

7
Abbildung 7. Rapid - Scan öffnet bei 250 MHz , die Tür zu in - vivo - Redox - Überwachung. (A) 2D - spektral-räumliche Bilder von 15 N-Dinitroxidcarbene. (B) Scheiben durch die obere (blaue Kurve) und unten (rote Kurve) Fächer in den beiden Bildern. (C) Das obere Fach bleibt gleich, aber die untere Fach ist mit Glutathion reduziert. (D) Scheibe durch jedes Bildobjekts , welche die Änderung in der 1D - Spektrum der unteren Fach. Siehe Referenzen 1,28,35. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Rapid-Scan-Signale haben eine höhere Frequenzkomponenten als CW, und erfordern eine größere Resonatorbandbreite auf Linienbreite abhängig, Ruhezeiten und die Geschwindigkeit der S-Scans. Die Bandbreite für ein bestimmtes Experiment erforderlich ist, basierend auf der Linienbreite und der Abtastgeschwindigkeit des Magnetfeldes (Gleichung 2). In Abhängigkeit von den Relaxationszeiten der Sonde untersucht (T 2 und T 2 *), und die Abtastgeschwindigkeit können Schwingungen an der Hinterkante des Signals angezeigt. Für Nitroxiden mit T 2 ~ 500 ns bei 250 MHz (57 th Rocky Mountain Conference on Magnetic Resonance, Epel, B, et al., 2015), sind experimentelle Abtastraten oft nicht hoch genug irgendwelche Schwingungen zu beobachten.

Die experimentelle Bandbreite wird durch den Resonator Bandbreite typischerweise begrenzt. Jede Halbzyklus eines schnellen Scan-Versuch wird mit entweder kleiner oder größer Feld / Frequenz aufgezeichnet, so dass die experimentelle Bandbreite ½ ter Resonatorbandbreite, wie in (Gleichung 1) gezeigt ist. Wenn die experimentelle Bandbreite durch die Wahl der Parameter beschränkt ist, dass er größer ist als Resonator Bandbreite und Schwingungen gedämpft werden, die Ergebnisse in der entfalteten Linienverbreiterung. Da der Versuch Bandbreite durch die Geschwindigkeit und Linienbreite des radikalen untersucht, das Verständnis dieser Merkmale bestimmt wird, ist ein wichtiger Bestandteil des schnellen Scan-Experiment.

Das aktuelle Protokoll zeigt EPRI bei 250 MHz von Phantomen Sonden empfindlich gegenüber Sauerstoff, Viskosität, pH - Wert, endogene transiente Signalmoleküle (dh OH •, NO •) und Redox - Status enthält. Räumliche Auflösungen zwischen 1 und 3 mm wurde gezeigt , dass mit experimentellen Erfassungszeiten zwischen 29 Sekunden (Einzelzeile einer 2 Linie 15 N Spektrum, Abbildung 3) und 15 Minuten (volles Spektrum von 5 uM BMPO-OH, Abbildung 5). Methodenentwicklung mit den Phantomen zeigtVerwendung von RS-EPR - Bilder ersetzt den herkömmlichen CW-EPR - Imaging - Technik 23,24 und eröffnet neue Wege für die in - vivo - Bildgebung unter Verwendung von EPR - Sonden.

EPRI ist vorteilhaft gegenüber anderen in vivo Bildgebungsverfahren basierend auf Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, wie EPR - Sonden an eine breitere Vielfalt von in vivo Phänomene empfindlich sind. Zusätzlich RF Penetration bei 250 MHz beträgt ~ 7 cm, so dass anomale Gewebe auf einer tieferen Ebene untersucht werden können. Die Kernspintomographie (MRT) liefert sehr detaillierte anatomische Karten, sondern kämpft quantitative physiologische Informationen zu liefern. Eine Kombination von MRT und EPRI könnte eines Tages Ergebnis in einem alle Magnetresonanz-Version eines Positronen-Emissions-Tomographie (PET) / Computertomographie (CT) -Scanner. Ein solches Instrument den gleichen Nutzen von PET / CT würde, jedoch ohne die schweren Strahlendosen oder teure Radiotracer.

Methodenentwicklung mit Phantomen weiter t zu drückener begrenzt von RS-EPR, aber das ultimative Ziel ist es, die Technik, die in Laboratorien Modellen mit tierischen umzusetzen. Die Berechnungen für Bildrekonstruktionen werden müssen verbessert werden Datensammlung für einen 4D Experiment zu beschleunigen (3 räumlichen, spektrale 1 Dimension). Ein verbesserter Algorithmus wird derzeit entwickelt und ist für in vivo Anwendungen ist jedoch der Nachweis der grundsätzlich mit der 2D - Bildgebung durchgeführt werden.

Viele der Reste, wie 15 N-PDT, in Phantome verwendet degradieren schnell unter in vivo Bedingungen mit Halbwertszeit von nur 60 Sekunden. Reste mit einer verbesserten Beständigkeit gegenüber in vivo - Reduktion 39 wurden synthetisiert und sind wichtig für die groß genug Konzentrationen in vivo zu bauen. Die verbesserte Empfindlichkeit des RS-EPR über CW-EPR 24 wird ein weiterer Vorteil bei der Lösung dieses Problems sein. Die Empfindlichkeit des schnellen Scans ist derzeit 5 uM für ein Phantom, und zwischen 100 um und 5 mm, abhängig vondie Sonde abgebildet, für Tierstudien an der Universität von Chicago (persönliche Mitteilung, Maggio, M., 2015) durchgeführt wird, werden. Die RS - Methode wird weiter entwickelt werden , um diese Lücke zu schließen, aber die Anwendung wurde bereits in tatsächlichen in vivo - Anwendungen zu bewegen begonnen (57 th Rocky Mountain Conference on Magnetic Resonance, Epel, B, et al., 2015).

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Acknowledgments

Teilweise Unterstützung dieser Arbeit durch die NIH gewährt NIBIB EB002807 und CA177744 (GRE und SSE) und P41 EB002034 zu GRE, Howard J. Halpern, PI, und von der University of Denver wird dankbar anerkannt. Mark Tseytlin wurde von NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942 unterstützt. Die Autoren sind dankbar Valery Khramtsov, jetzt an der Universität von West Virginia, und Illirian Dhimitruka an der Ohio State University für die Synthese der pH-empfindliche TAM Radikale und Gerald Rosen und Joseph Kao an der University of Maryland für die Synthese des mHCTPO , PROXYL, BMPO und Nitronyl Radikale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N-PDT) CDN Isotopes  M-2327 98% atom 15N, 98 % atom D, Quebec Canada
4-1H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-3-pyrrolinyloxyl (15N-mHCTPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 29
3-carboxy-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pyrrolidinyloxyl (15N-Proxyl) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 25
4 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass 707-SQ-100M
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N-PDT) CDN Isotopes D-2328 98% atom D, Quebec Canada
pH sensitive trityl radical (aTAM4) Ohio State University N/A Synthesized at Ohio State University and described in Reference 26
Potassum Phosphate, Monobasic J.T. Baker Chemicals 1-3246
6 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-5M-6M-0-250/RB
8 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-7M-8M-0-250/RB
5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 30
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009 SIGMA 30%
16 mm Quartz EPR tube Wilmad Glass 16-7PP-11QTZ
Medium Pressure 450 W UV lamp Hanovia 679-A36 Fairfield, NJ
L-Glutathione, reduced Sigma Aldrich G470-5
Nitronyl NA N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 31
Sodium Hydroxide  J.T. Baker Chemicals 1-3146

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References

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Bioengineering Heft 115 Elektronenspinresonanz (EPR) schnelle Scan Nitroxid, 250 MHz pH-Wert Sauerstoffkonzentration Redox-Status Signalmoleküle Biophysik
Rapid-Scan-Elektronenspinresonanz eröffnet neue Wege für Imaging Physiologisch Wichtige Parameter<em&gt; In Vivo</em
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